Name: Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung afferenter Neuronen durch retrograde Farbstoffmarkierung und Patch-Clamp-Elektrophysiologie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spannungsgesteuerter Ionenkanäle in sensorischen Neuronen.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grant AR059397 (KSE) finanziert.

Hinweis: Alle Tierarbeiten müssen gemäß den Richtlinien der Institution und der Tierpflege durchgeführt werden.
1. Vorbereitung des Tieres und Kennzeichnung
<ol>
	<li>Anästhesieren Sie Ratten: Betäuben Sie eine Ratte (typischerweise 150-400 g) mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketamin (50 mg/kg Körpergewicht), Xylazin (5 mg/kg) und Acepromazin (1 mg/kg). Überprüfen Sie, ob Reflexe vorhanden sind, indem Sie den Fuß einklemmen, und warten Sie, bis keine Reaktion erfolgt. Da die Anästhesiereaktion von Tier zu Tier unterschiedlich ist, ist es am besten, die Wirkung der Anästhetika durch Testen der Schmerzreflexe zu bestimmen.</li>
	<li>DiI-Lösung: DiI-Pulver wiegen und in sterilem 100%igem DMSO auflösen, um eine 1,5%ige Lösung (15 mg/ml) zu erhalten. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur in trockener Atmosphäre.</li>
	<li>DiI-Injektionen: Rasieren Sie die Haare über dem Wadenbereich an beiden Beinen der anästhesierten Ratte mit einem Elektrorasierer.
	<ol>
		<li>Füllen Sie eine sterile 1-ml-Spritze (11/4 in 27 g Nadel) mit 200 μl 1,5%iger DiI-Lösung. Führen Sie die Nadel langsam parallel zur Längsachse jedes Gastrocnemius-Muskels ein und injizieren Sie 100 μl DiI in den Muskel, während Sie die Nadel langsam aus dem Muskel herausziehen (~10 Sekunden), ohne sich aus dem Muskel zurückzuziehen.</li>
		<li>Bevor Sie die Nadel aus dem Muskel ziehen, ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht mehr aus der Spitze fließt, warten Sie 10 Sekunden und ziehen Sie dann die Nadel aus dem Muskel zurück. Dieser Schritt verhindert das Austreten von DiI von der Nadel auf die Haut, wodurch kutane Afferenzen markiert werden könnten.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Bein.</li>
		<li>Warten Sie 4-5 Tage, bis der DiI vom Muskel zum DRG transportiert wird.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Dissektion und neuronale Isolierung
<ol>
	<li>Lösungen:
	<ol>
		<li>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) nach Herstellerangaben zubereiten, filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Nährmedien (MEM Plus): Mischen Sie 89 ml minimal essentielle Medien (MEM), 10 ml fötales Rinderserum (FBS), 1 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung, filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern.</li>
		<li>Polylysinlösung: Poly-L-Lysinhydrobromidpulver (10 mg/100 ml) in 0,1 M Natriumboratlösung, pH 8,4, auflösen, filtrieren, sterilisieren und Aliquote bei -20 °C lagern.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Beschichtung von Deckgläsern
	<ol>
		<li>Reinigen Sie die Deckgläser (12 mm rund) 3-4 Stunden lang in 70 % Ethanol und trocknen Sie sie in einer sterilen Kulturhaube an der Luft.</li>
		<li>Legen Sie die getrockneten Deckgläser in die Polylysinlösung O/N.</li>
		<li>Aus der Polylysinlösung nehmen und 2x für jeweils 5 Minuten in sterilem destilliertem Wasser waschen, um überschüssiges Polylysin zu entfernen.</li>
		<li>Trennen Sie die Deckgläser, trocknen Sie sie in der Kulturhaube und lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vorbereitung für die Präparierung
	<ol>
		<li>Ein Becherglas mit 10 ml HBSS, eine 35 mm Petrischale und eine 100 mm Petrischale auf Eis legen.</li>
		<li>Wägen Sie die Enzyme ab: 7 mg Kollagenase, 1 mg DNAse und 10 mg Trypsin.</li>
		<li>Ein Schüttelwasserbad auf 37 °C vorheizen und ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml EBSS zum Aufwärmen in das Bad stellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissektion:
	<ol>
		<li>Tötete die Ratte gemäß einem von der IACUC genehmigten Protokoll. CArbondioxid wurde verwendet, um die Ratte einzuschläfern.</li>
		<li>Entfernen Sie schnell den Rücken, indem Sie die Haut am Rücken aufschneiden, entfernen Sie das Binde- und Muskelgewebe entlang der Wirbelsäule für eine bessere Belichtung und entfernen Sie den Lendenwirbelsäulenabschnitt (Ende der Brustregion bis zum Beckenknochen; Abbildung 1).</li>
		<li>Legen Sie die isolierte Wirbelsäule in die 100-mm-Petrischale und tragen Sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette gekühlte HBSS-Lösung auf, um das Präparat feucht und kalt zu halten.</li>
		<li>Schneiden Sie die Muskeln an den Seiten der Wirbelsäule ab. Führen Sie eine dorsale Laminektomie mit einem Rongeur oder einer Schere durch und entfernen Sie vorsichtig den Knochen, der die Aussparungen umschließt, in denen sich das DRG befindet.</li>
		<li>Tragen Sie während dieses Vorgangs wiederholt eiskaltes HBSS (~1 ml) auf.</li>
		<li>Isolieren Sie das DRG, indem Sie den peripheren und zentralen Nerv durchtrennen (1-2 mm Nerv verbleiben, um die Handhabung der Ganglien zu erleichtern)</li>
		<li>Geben Sie das isolierte DRG in die 35-mm-Petrischale mit eiskaltem HBSS-Puffer.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle L-4 und L-5 DRG isoliert sind. Thoracic DRG kann isoliert und separat als Negativkontrolle für die DiI-Markierung verarbeitet werden.</li>
		<li>Stellen Sie die Schale mit isoliertem DRG unter ein Seziermikroskop und entfernen Sie die überschüssigen Nerven und Blutgefäße mit einer Mikroschere und einer Pinzette.</li>
		<li>Schneiden Sie das DRG auf, um den Enzymen besser ausgesetzt zu sein, aber enthüllen Sie das DRG nicht.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRG-Neuronen-Dissoziation:
	<ol>
		<li>Geben Sie die Enzyme in das warme EBSS-Medium (im Wasserbad aufbewahrt). Zum Auflösen kurz schütteln und mit dem Filter sterilisieren.</li>
		<li>Geben Sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette das gesamte DRG in die Enzymlösung. Das Volumen des HBSS, das mit DRG zugesetzt wird, wird auf ein Minimum reduziert, da das HBSS das Enzymgemisch verdünnt. Der Kolben wird 60 Sekunden lang mit 95 % O2 und 5 % CO2 begast, bevor der Kolben fest verschlossen wird.</li>
		<li>Der Kolben wird im Schüttelwasserbad bei 37 °C für 60 min bei 240 U/min inkubiert.</li>
		<li>Am Ende der Inkubation wird der Kolben 50x kräftig geschüttelt, um das DRG5 zu dissoziieren.</li>
		<li>Unter sterilen Bedingungen werden 5 ml MEM Plus in den Kolben gegeben, um die Enzyme zu stoppen.</li>
		<li>Der Kolbeninhalt wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 6 Minuten lang bei 16 x g zentrifugiert.</li>
		<li>Den Überstand entfernen und entsorgen, 5 ml MEM Plus zur Probe geben. Zerreiben Sie vorsichtig mit einer Pipette, um das Pellet aufzubrechen.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen und entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 500 μl MEM Plus hinzu. Mit einer 1-ml-Pipettenspitze auf einer Pipette vorsichtig verreiben, um eine Zellsuspension herzustellen.</li>
		<li>Legen Sie ein Deckglas mit Polylysin beschichtet in eine leere sterile 35-mm-Schale. Geben Sie einen Tropfen (~50 μl) der Zellsuspension in die Mitte des Deckglases.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zelllösung erschöpft ist.</li>
		<li>Stellen Sie die 35-mm-Schalen für 1 Stunde in einen 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator, damit die Neuronen an den Deckgläsern haften können.</li>
		<li>Geben Sie weitere 2 ml Medium in jede Schale und kehren Sie in den Inkubator zurück.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Patch Clamp Aufnahme
<ol>
	<li>Lösungen für die Aufzeichnung: Diese Lösungen sind für die Aufzeichnung von NaV-Strömen vorgesehen. Beispiele für Lösungen mit unterschiedlicher Zusammensetzung finden Sie in diesen Referenzen5-7.
	<ol>
		<li>Externe Lösung: (in mM) 45 NaCl, 100 N-Methyl-d-glukamin (NMG)•Cl, 4 MnCl2, 10 Na•HEPES und 10 Glukose, mit einem pH-Wert = 7,4 und einer Osmolarität = 320 mOsm.</li>
		<li>Innere Lösung: (in mM) 104 NMG•Cl, 14 Kreatin•PO4, 6 MgCl2, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG2•EGTA und 0,3 Tris2•GTP mit pH 7,4 und Osmolarität = 300 mOsm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Messung von Ionenströmen:
	<ol>
		<li>Ziehen Sie Aufzeichnungselektroden aus Glaskapillaren auf einem Elektrodenabzieher und polieren Sie die Spitzen mit einer Mikroschmiede heiß. Der Widerstand der Elektroden beträgt typischerweise 2-3 MΩ</li>
		<li>Identifizieren Sie die DiI-markierten DRG-Neuronen mit einem Mikroskop mit Epifluoreszenz und einem TRITC-Würfel. DiI hat eine Anregungswellenlänge von 550 nm und eine Emissionswellenlänge von 570 nm.</li>
		<li>Füllen Sie die Glaselektrode mit interner Lösung (feilen Sie nur ~ 1 cm der Elektrodenspitze ab) und klopfen Sie vorsichtig darauf, um eingeschlossene Blasen zu entfernen. Setzen Sie sie in den Elektrodenhalter ein und bewegen Sie sie mit einem Mikromanipulator zur Zelle.</li>
		<li>Sobald die Elektrode die Zelle berührt, üben Sie einen sanften Sog über das Saugrohr aus, bis eine dichte Abdichtung gebildet ist (bestimmt durch die Erhöhung des Elektrodenwiderstands).</li>
		<li>Klemmen Sie die Membranspannung auf das gewünschte Haltepotenzial (typischerweise -60 bis -120 mV).</li>
		<li>Erhalten Sie die Konfiguration der Ganzzell-Patch-Klemme, indem Sie einen stärkeren Sog anwenden, um das Membranpflaster an der Spitze der Elektrode zu entfernen. Der Übergang zur Ganzzellenkonfiguration wird elektrisch als Erhöhung des kapazitiven Stroms8-10 beobachtet.</li>
		<li>Kompensieren Sie den Serienwiderstand mit der Kompensationsschaltung des Patch-Clamp-Verstärkers (verwenden Sie mindestens 80 % Kompensation)8,10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Immunzytochemie
<ol>
	<li>Fixieren Sie die Neuronen auf den Deckgläsern mit 4% Paraformaldehyd für 1 h und permeabilisieren Sie dann mit 2% Tween 20 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 10 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die fixierten Zellen O/N in einer Blockierungslösung (normales Serum oder Rinderserumalbumin) plus den primären Antikörper, bei dem es sich um einen Antikörper handelt, der entwickelt wurde, um an ein spezifisches Antigen von Interesse zu binden.</li>
	<li>Inkubieren Sie einen Kontrollsatz von Neuronen O/N in einer Blocklösung, der die primären Antikörper fehlen.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläser 3x für 5 min mit PBS-Puffer, gefolgt von 2 Wäschen à 5 min mit 1% Tween 20, um den ungebundenen Primärantikörper zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Test- und Kontrolldeckgläser mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet, um eine Visualisierung zu ermöglichen.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläser 3x 5 Minuten lang mit PBS, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.</li>
	<li>Montieren Sie die Deckgläser mit Montagemedien auf einem sauberen Objektträger.</li>
	<li>Tragen Sie klaren Nagellack auf den Rand des Deckglases auf, um ihn zu fixieren. Sobald sie getrocknet sind, visualisieren Sie die Neuronen und nehmen Sie Bilder mit der Software auf, die dem Fluoreszenzmikroskop beiliegt. 
	Hinweis: In dieser Arbeit wurde ein Nikon-Mikroskop mit der Software NIS-elements BR 3.2 verwendet. Die Belichtungszeit wurde optimiert und für Kontroll- und Testpräparate gleich gehalten.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenzintensität und Zellgröße einzelner Neuronen mit Bildgebungssoftware wie ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).</li>
</ol>

<ol><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reactions+of+cutaneous+and+muscle+afferent+neurons+to+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats.</a> J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).</li>
<li>Wang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+reactive+oxygen+species+modulates+voltage-gated+sodium+channels+in+dorsal+root+ganglia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endogenous reactive oxygen species modulates voltage-gated sodium channels in dorsal root ganglia of rats.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1439-1447 (2011).</li>
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<li>Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Modulation+of+Mu+%28%7Bmicro%7D%29+Opioid+Receptors+in+Adult+Rat+Sphenopalatine+Ganglion+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons.</a> J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Muskelafferenzen, die aus Trizepsmuskeln (z. B. Gastrocnemius) stammen, wurden in mehreren Studien zur Untersuchung des Trainingsdruckreflexes (EPR) verwendet13. Aufgrund des Interesses an der Untersuchung sensorischer Neuronen, die das EPR vermitteln, wurden die Gastrocnemius-Muskeln für die Farbstoffinjektion ausgewählt. DiI wurde aufgrund seiner lipophilen Natur ausgewählt und da es nicht durch Diffusion durch die intakte Plasmamembran aus dem Neuron verloren geht3,14. Mit dieser Methode...

Dorsale Wurzelganglien (DRG) bestehen aus Soma von afferenten Neuronen, die verschiedene Teile des Körpers innervieren, und wichtige Erkenntnisse können durch die Untersuchung sensorischer Neuronen mit unterschiedlichen Innervationszielen gewonnen werden1. Verschiedene indirekte oder invasive Methoden werden verwendet, um afferente Neuronen zu isolieren und zu identifizieren, z.B. durch Injektion von Markern wie Fluorgold1 in den Nerv, Injektion von Farbstoff in die Muskeln durch chirurgische Methode2. Von den verschiedenen Farbstoffen, die erfolgreich zur Markierung von Neuronen und neuronalen Bahnen verwendet wurden, werden Fluoreszenzfarbstoffe wie DiI aufgrund ihrer schnellen Aufnahme durch Neuronenterminals, der langfristigen Retention in Neuronen und des fehlenden Transfers zwischen Neuronen häufig in neuroanatomischen Tracings verwendet3. Die afferenten Neuronen, die mit DiI markiert sind, können für eine detaillierte Untersuchung leicht mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass Marker wie DiI während der Zellpermeabilisierung, die für die Immunzytochemie mit intrazellulären Epitopen benötigt wird, aus den Zellen verloren gehenkönnen 4. Hier beschreiben wir eine Methode, bei der DiI in den Skelettmuskel injiziert wird, um muskelafferente Neuronen im DRG zu identifizieren. Wir beschreiben auch eine Zellpermeabilisierungsmethode, die DiI im Neuron hält und gleichzeitig den Antikörperzugang zu intrazellulären Epitopen ermöglicht. Wir demonstrieren die Verwendung sowohl der Patch-Clamp-Elektrophysiologie als auch der Immunzytochemie, um diese identifizierten Neuronen zu untersuchen, und beschreiben die unterschiedlichen Vorteile jeder Technik bei der Untersuchung von Ionenkanälen, die die neuronale Erregbarkeit steuern. Schließlich beschreiben wir mögliche Probleme, die die Interpretation elektrophysiologischer Daten behindern können. Wir haben diese Methoden verwendet, um Muskel- und kutane afferente Neuronen zu identifizieren und die spannungsgesteuerten Natriumkanäle (NaV) zu bestimmen, die in diesen identifizierten Neuronen exprimiert werden8. Diese Methoden können jedoch an eine Vielzahl von Präparaten angepasst werden, um identifizierte Untergruppen von Neuronen zu untersuchen, die ein bestimmtes Zielgewebe oder einen bestimmten Hirnkern innervieren.

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 und 1.9</td><td>Alamone Labs, Jerusalem, Israel</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluor-Gel</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

identifikation von spezifischen sensorischen neuronenpopulationen für das studium der ausgedrückt ionenkanäle

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensorische Neuronen übertragen Signale von verschiedenen Teilen des Körpers an das zentrale Nervensystem. Das Soma für diese Neuronen befindet sich in den Spinalganglien, die die Wirbelsäule auskleiden. Das Verständnis der Rezeptoren und Kanäle, die von diesen sensorischen afferenten Neuronen exprimiert werden, könnte zu neuartigen Therapien für Krankheiten führen. Der erste Schritt besteht darin, die spezifische Untergruppe der sensorischen Neuronen von Interesse zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung afferenter Neuronen, die die Muskeln innervieren, durch retrograde Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat). Das Verständnis des Beitrags von Ionenkanälen zur Erregung von Muskelafferenzen könnte dazu beitragen, eine übermäßige Erregbarkeit, die durch bestimmte Krankheitszustände wie periphere Gefäßerkrankungen oder Herzinsuffizienz induziert wird, besser zu kontrollieren. Wir verwendeten zwei Ansätze, um die spannungsabhängigen Ionenkanäle zu identifizieren, die von diesen Neuronen exprimiert werden, die Patch-Clamp-Elektrophysiologie und die Immunzytochemie. Während Elektrophysiologie plus pharmakologische Blocker funktionelle Ionenkanaltypen identifizieren können, haben wir die Immunzytochemie verwendet, um Kanäle zu identifizieren, für die spezifische Blocker nicht verfügbar waren, und um das Ionenkanal-Verteilungsmuster in der Zellpopulation besser zu verstehen. Diese Techniken können auf andere Bereiche des Nervensystems angewendet werden, um bestimmte neuronale Gruppen zu untersuchen.

Mithilfe der hier beschriebenen Methode identifizierten wir muskuläre afferente Neuronen im DRG und bestimmten anschließend die von diesen Neuronen exprimierten spannungsabhängigen Natriumkanäle (NaV). Mit DiI markierte muskuläre afferente Neuronen (Abbildung 1C) stellten einen kleinen Anteil der gesamten Neuronenpopulation im DRG dar, im Durchschnitt 16 % der Neuronen (167/1047) waren markiert. Die Quantifizierung erfolgte, indem zunächst die Fluoreszenzintensität mit ImageJ gemessen und Histogramme der...

Afferente sensorische Neuronen signalisieren sensorische Informationen von der Peripherie an das zentrale Nervensystem. Die Identifizierung spezifischer afferenter Neuronen hilft beim Verständnis ihrer Physiologie. Wir beschreiben eine Methode der retrograden Markierung, um afferente Neuronen zu identifizieren, und untersuchen die spannungsgesteuerten Ionenkanäle in diesen Neuronen mit Hilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Immunzytochemie.

Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, afferente Neuronen mittels retrograder Farbstoffmarkierung zu identifizieren und die Ionenkanäle in diesen Neuronen unter Verwendung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und der Immunchemie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst DAI in das Zielgewebe injiziert wird, um die innervierenden afferenten Neuronen zu markieren. Der zweite Schritt besteht darin, afferente Neuronen aus den Spinalganglien zu isolieren.Anschließend werden die markierten Neuronen mit der Patch-Clamp-Methode untersucht, um die gesteuerten Ionenkanäle zu registrieren; der letzte Schritt besteht darin, mithilfe der Immunchemie die exprimierten Ionenkanäle in den markierten Neuronen zu identifizieren. Letztendlich ermöglicht die Kombination aus Patch-Clamp und Immunchemie die Identifizierung des Expressionsmusters sowie der funktionellen Eigenschaften der Ionenkanäle in afferenten Neuronen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen etablierten Verfahren liegt darin, dass sie nicht invasiv ist, und das von uns verwendete DAI, DAI I, zeichnet sich durch eine schnelle Aufnahme über die neuronalen Endigungen aus.Fehlender Transfer zwischen Neuronen und langfristige Speicherung in den Neuronen, in die wir injizieren. Die Demonstration des Verfahrens werde ich gemeinsam mit Stephanie, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus unserem Labor, für die Farbstoffinjektion durchführen. Zunächst wird das Haar im Wadenbereich beider Hinterbeine der anästhesierten Ratte mit einem Elektrorasierer abrasiert.Füllen Sie als Nächstes eine sterile Ein-Kubikzentimeter-Spritze mit 200 Mikrolitern einer 1,5 %igen Dai-Lösung. Führen Sie die Nadel langsam parallel zur Längsachse jedes Gastrocnemius-Muskels ein und injizieren Sie jeweils 100 Mikroliter Dai in den Muskel, bevor Sie die Nadel aus dem Muskel zurückziehen. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit nicht mehr aus der Spitze austritt.Warten Sie 10 Sekunden und ziehen Sie dann die Nadel aus dem Muskel. Für die Verteilung des Farbstoffs sind vier bis fünf Tage erforderlich, um die Vorbereitung für die Präparation abzuschließen. Stellen Sie einen Becher mit 10 Milliliter HBSS, eine 35 Millimeter große Petrischale und eine 100 Millimeter große Petrischale auf Eis.Als Nächstes sieben Milligramm Kollagenase, ein Milligramm DNA und 10 Milligramm Trypsin abwiegen, ein Schüttelbad auf 37 Grad Celsius vorheizen und ein 15-Milliliter-Zentrifalenröhrchen, das 10 Milliliter EBSS enthält, im Bad erwärmen. Nachdem die Ratte vor der Sektion euthanasiert wurde, schnell die Haut auf dem Rücken des Tieres öffnen. Anschließend das Bindegewebe und Muskelgewebe entlang der Wirbelsäule entfernen, um eine bessere Sichtbarkeit zu erzielen.Entfernen Sie anschließend den Lendenabschnitt der Wirbelsäule. Legen Sie danach die isolierte Wirbelsäule in die 100 Millimeter große Petrischale. Geben Sie mit einer sterilen Pasteurpipette gekühlte HBSS-Lösung hinzu, um die Präparation feucht und kühl zu halten.Schneiden Sie die Muskeln an den Seiten der Wirbelsäule ab. Führen Sie eine dorsale Laminektomie durch, indem Sie mit einer Knochenquetsche oder Schere vorsichtig den Knochen entfernen und dabei die Vertiefungen, die die Spinalganglien enthalten, schonen. Wiederholen Sie dies mehrfach. Geben Sie während des Vorgangs eiskaltes HBSS hinzu.Isolieren Sie unter dem Mikroskop das DRG, indem Sie die peripheren und zentralen Nerven durchtrennen und einen bis zwei Millimeter Nervenansatz belassen, um die Handhabung der Ganglien zu erleichtern. Anschließend geben Sie das isolierte DRG in die 35-Millimeter-Petri-Schale, die kalte HBSS-Pufferlösung enthält. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle L4- und L5-DRG isoliert wurden.Entfernen Sie überschüssige Nerven und Blutgefäße mit Mikroscheren und einer Pinzette. Schneiden Sie das DRG auf, um eine bessere Exposition gegenüber den Enzymen zu ermöglichen, entfernen Sie jedoch die Hülle des DRG nicht für die DRG-Neuronen-Dissociation. Geben Sie die Enzyme dem warmen EBSS-Medium zu, vortexen Sie, um sie aufzulösen, und filtrieren Sie steril.Als Nächstes alle DRG mit einem sterilen Pasteurpipettenkopf in die Enzymlösung geben. Danach den Kolben 60 Sekunden lang mit 95% Sauerstoff und 5% CO2 durchblubbern, bevor der Kolben fest verschlossen wird. Anschließend den Kolben 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Wasserbad bei 240 U/min inkubieren.Am Ende der Inkubation das Gefäß unter sterilen Bedingungen kräftig 50-mal schütteln, um die DRG zu dissoziieren. Fünf Milliliter MEM plus zum Gefäß hinzufügen, um die enzymatischen Aktivitäten zu stoppen.Überführen Sie den Inhalt des Kolbens in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 16 × g für sechs Minuten. Anschließend entfernen und verwerfen Sie den Überstand. Geben Sie fünf Milliliter MEM plus zu der Probe und titrieren Sie vorsichtig mit der Pipette.Um das Pellet aufzulösen, wiederholen Sie den Zentrifugierungsschritt, entfernen und entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 500 µL MEM plus hinzu. Pipettieren Sie vorsichtig mit einer 1-mL-Pipettenspitze, um eine Zellsuspension herzustellen. Danach legen Sie eine mit Polylysin beschichtete Glas-Deckscheibe in eine leere, sterile 35-mm-Schale. Geben Sie anschließend einen Tropfen der Zellsuspension in die Mitte der Deckscheibe.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zellsuspension aufgebraucht ist. Stellen Sie die 35-Millimeter-Dishs eine Stunde lang in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2, damit die Neuronen nach einer Stunde an den Deckgläsern haften können. Geben Sie zusätzlich zwei Milliliter Medium in jede Dish und bringen Sie sie zurück in den Inkubator, um die Patch-Clamp-Aufzeichnung durchzuführen.Zunächst identifizieren Sie die mit Farbstoff markierten DRG-Neurone mithilfe eines Mikroskops mit Epifluoreszenz. Füllen Sie danach die Glaselektrode mit der internen Lösung. Klopfen Sie vorsichtig, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.Danach platzieren Sie die Elektrode in der Elektrodenhalterung. Senken Sie die Elektrode mit einem Mikromanipulator auf die Zelle ab. Sobald die Elektrode die Zelle berührt, saugen Sie vorsichtig über das Absaugrohr, bis ein dichter Verschluss entsteht.Dann halten Sie die Membranspannung am gewünschten Haltepotential fest. Stellen Sie die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration durch stärkeren Sog her. Um den Membranfleck an der Spitze der Elektrode zu entfernen, beginnen Sie mit der Aufzeichnung, sobald die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration etabliert ist.Fixieren Sie in diesem Verfahren die Neuronen auf den Deckgläsern mit 4 % Paraformaldehyd für eine Stunde. Permeabilisieren Sie anschließend die Neuronen mit 2 % Tween 20 in PBS für 10 Minuten. Inkubieren Sie danach die Zellen eine Stunde lang in einer Blockierungslösung.Die Testzellen werden über Nacht in der Blockierungslösung zusammen mit dem primären Antikörper inkubiert. Der Kontrollsatz an Neuronen wird über Nacht in der Blockierungslösung ohne primäre Antikörper stehengelassen. Am nächsten Tag die Deckgläser dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS-Puffer waschen, gefolgt von zwei Waschungen mit 1 % Tween 20, jeweils fünf Minuten lang, um nicht gebundene primäre Antikörper zu entfernen.Danach die Test- und Kontroll-Deckgläser 30 Minuten lang mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper inkubieren, der an den primären Antikörper bindet und dessen Sichtbarmachung ermöglicht. Anschließend die Deckgläser dreimal je fünf Minuten mit PBS waschen, um überschüssigen sekundären Antikörper zu entfernen. Danach die Deckgläser mit Einbettmedium auf eine saubere Objektträger aufbringen.Tragen Sie dann klaren Nagellack auf die Kante des Deckgläschens auf, um es zu fixieren. Nach dem Trocknen die Neuronen visualisieren und Bilder mit der Software des Fluoreszenzmikroskops aufnehmen. Dies stellt die Dai-Injektion in den Gastrocnemius-Muskel und den retrograden Transport vom Muskel zum DRG dar.Die L4- und L5-Spinalganglien sind hier markiert. Die afferenten Neuronen sind im Hellfeldbild sichtbar, und dieses Fluoreszenzbild zeigt ein mit Farbstoff markiertes muskuläres afferentes Neuron. Dieses Histogramm zeigt die DII-Fluoreszenzintensität der sensorischen Neuronen.Der große Peak stammt von nicht markierten Neuronen und wird mit einer Gauß-Funktion angepasst, um die mittlere Intensität und die Standardabweichung zu bestimmen. Die gestrichelte vertikale Linie stellt die Schwelle für die DAI-Markierung dar. Das Histogramm umfasst Daten von 1047 Neuronen, von denen 167 mit dai markiert sind.Hier ist eine repräsentative muskuläre afferente Neuronenzelle mit guter Kontrolle der Membranspannung. Die Natriumströme bei minus 20, minus 10 und null Millivolt sind links dargestellt und die Strom-Spannungs-Beziehung rechts gezeigt. Während des Vorgehens ist es wichtig, daran zu denken, die DRGs schnell aber vorsichtig zu isolieren und die Präparation wiederholt mit eisgekühltem HBSS feucht zu halten.Mithilfe dieses Verfahrens können andere efferente Neurone markiert und identifiziert werden, um ihre Rolle in der Physiologie zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

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Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

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