Identifikation von spezifischen sensorischen Neuronenpopulationen für das Studium der Ausgedrückt Ionenkanäle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, afferente Neuronen durch retrograde Farbstoffmarkierung zu identifizieren und die Ionenkanäle in diesen Neuronen mit Hilfe der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Immunchemie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst DAI in das Zielgewebe injiziert wird, um die innervierenden afferenten Neuronen zu markieren. Der zweite Schritt besteht darin, afferente Neuronen aus den Spinalganglien zu isolieren.

Als nächstes werden die markierten Neuronen mit einem Patch geklemmt, um die Gated-Ionenkanäle aufzuzeichnen, der letzte Schritt besteht darin, exprimierte Ionenkanäle in den markierten Neuronen mit Hilfe der Immunchemie zu identifizieren. Mit einer Kombination aus Patch-, Clamp- und Immunchemie sind wir in der Lage, das Expressionsmuster sowie die funktionellen Eigenschaften der Ionenkanäle in afferenten Neuronen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen bestehenden Methoden besteht darin, dass es sich um eine nicht-invasive Methode handelt und die von uns verwendete DAI I für ihre schnelle Aufnahme durch die neuronalen Enden bekannt ist.

Mangelnder Transfer zwischen Neuronen und langfristige Retentionen innerhalb der Neuronen, die wir injizieren. Das Verfahren wird von mir und Stephanie, Forschungstechnikerin aus unserem Labor für Farbstoffinjektion, demonstriert. Rasieren Sie zunächst die Haare im Wadenbereich an beiden Beinen der narkotisierten Ratte mit einem Elektrorasierer.

Füllen Sie anschließend eine sterile Spritze mit einem CC mit 200 Mikrolitern 1,5%iger Dai-Lösung. Führen Sie die Nadel langsam parallel zur Längsachse jedes Magenmuskels ein und injizieren Sie 100 Mikroliter Dai in den Muskel, bevor Sie die Nadel aus dem Muskel ziehen. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass der Farbstoff nicht mehr aus der Spitze fließt.

Warten Sie 10 Sekunden und ziehen Sie dann die Nadel aus dem Muskel zurück. Vier bis fünf Tage werden benötigt, bis die Farbstoffverteilung für die Sektion vorbereitet ist. Stellen Sie ein Becherglas mit 10 Millilitern HBSS, eine 35-Millimeter-Petrischale und eine 100-Millimeter-Petrischale auf Eis.

Als nächstes wiegen Sie sieben Milligramm Kollagenase, ein Milligramm DNA und 10 Milligramm Trypsin vor, erhitzen ein Schüttelwasserbad auf 37 Grad Celsius und erwärmen ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 10 Millilitern EBSS im Bad. Nachdem Sie die Ratte vor der Sektion eingeschläfert haben, schneiden Sie schnell die Haut auf dem Rücken des Tieres auf. Entfernen Sie dann das Binde- und Muskelgewebe entlang der Wirbelsäule, um eine bessere Exposition zu gewährleisten.

Anschließend entfernen Sie den Lendenwirbelsäulenabschnitt. Legen Sie anschließend die isolierte Wirbelsäule in die 100 Millimeter große Petrischale. Tragen Sie gekühlte HBSS-Lösung mit einer sterilen Weidepipette auf, um das Präparat feucht und kalt zu halten.

Schneiden Sie die Muskeln an den Seiten der Wirbelsäule ab. Führen Sie eine dorsale Laminektomie durch, indem Sie den Knochen mit Rongeuren oder Scheren vorsichtig entfernen und die Aussparungen mit den Spinalganglien schließen. Wiederholt. Tragen Sie während dieses Vorgangs eiskaltes HBSS auf.

Isolieren Sie unter dem Mikroskop das DRG, indem Sie den peripheren und zentralen Nerv durchtrennen, wobei ein bis zwei Millimeter Nerv übrig bleiben, um die Handhabung der Ganglien zu erleichtern. Geben Sie dann das isolierte DRG in die 35-Millimeter-Petrischale mit dem eiskalten HBSS-Puffer. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle DRG L vier und L fünf isoliert sind.

Entfernen Sie überschüssige Nerven und Blutgefäße mit einer Mikroschere und einer Pinzette. Schneiden Sie das DRG auf, um den Enzymen besser ausgesetzt zu sein, aber enthüllen Sie das DRG nicht für die Dissoziation der DRG-Neuronen. Geben Sie die Enzyme in das warme EBSS-Medium und wirbeln Sie sie dann vortex, um sie aufzulösen und zu sterilisieren.

Geben Sie anschließend das gesamte DRG mit einem sterilen Weiderohrkopf in die Enzymlösung. Danach wird der Kolben 60 Sekunden lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % CO2 gefüllt, bevor der Kolben fest verschlossen wird. Dann inkubieren Sie den Kolben im 37 Grad Celsius heißen Schüttelwasserbad für 60 Minuten bei 240 U/min.

Am Ende der Inkubation kräftig. Der Kolben wird 50 Mal geschüttelt, um das DRG unter sterilen Bedingungen zu dissoziieren. Geben Sie fünf Milliliter MEM plus in den Kolben, um die enzymatischen Aktivitäten zu stoppen.

Den Kolbeninhalt in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und sechs Minuten lang bei 16-fachem G zentrifugieren. Entfernen und entsorgen Sie anschließend den Überstand. Geben Sie fünf Milliliter MEM plus vorsichtig mit der Pipette in das Probentritrat.

Um das Pellet aufzubrechen, wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt, entfernen und verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 500 Mikroliter MEM hinzu und tritrieren Sie vorsichtig mit der Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf einer Pipette, um eine Zellsuspension herzustellen. Legen Sie danach einen mit Polylysin beschichteten Glasdeckel in eine leere, sterile 35-Millimeter-Schale. Geben Sie dann einen Tropfen der Zellsuspension in die Mitte des Deckglases.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Zelllösung erschöpft ist. Legen Sie die 35-Millimeter-Schalen für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius und 5 % CO2-Inkubator, damit die Neuronen nach einer Stunde an den Lippen der Deckschicht haften können. Geben Sie weitere zwei Milliliter Medien in jede Schale und geben Sie sie zurück in den Inkubator, um die Patch-Clamp-Aufzeichnung durchzuführen.

Identifizieren Sie zunächst die mit Farbstoffen markierten DRG-Neuronen mit einem Mikroskop mit Epi-Fluoreszenz. Füllen Sie anschließend die Glaselektrode mit interner Lösung. Tippen Sie vorsichtig auf, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.

Setzen Sie dann die Elektrode in den Elektrodenhalter ein. Senken Sie die Elektrode mit einem Mikromanipulator auf die Zelle ab. Sobald die Elektrode die Zelle berührt, üben Sie einen sanften Sog über das Saugrohr aus, bis eine dichte Abdichtung gebildet ist.

Klemmen Sie dann die Membranspannung auf das gewünschte Haltepotential. Erhalten Sie die Konfiguration der Patch-Klemme für die gesamte Zelle, indem Sie eine stärkere Saugkraft anwenden. Um das Membranpflaster an der Spitze der Elektrode zu entfernen, starten Sie die Aufnahme, sobald die Konfiguration der Patch-Klemme für die gesamte Zelle festgelegt wurde.

Bei diesem Verfahren fixieren Sie die Neuronen auf den Deckgläsern eine Stunde lang mit 4%para Formaldehyd. Dann permieren Sie die Neuronen mit 2%tween 20 in PBS für 10 Minuten. Inkubieren Sie anschließend die Zellen eine Stunde lang in Blocklösung.

Die Testzellen werden über Nacht in der Blockierungslösung plus Primärantikörper inkubiert. Der Kontrollsatz von Neuronen wird über Nacht in einer Blocklösung ohne primäre Antikörper inkubiert. Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Tag dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS-Puffer, gefolgt von zwei Wäschen von jeweils fünf Minuten mit 1 %Tween 20, um den ungebundenen Primärantikörper zu entfernen.

Inkubieren Sie dann die Test- und Kontrolldeckgläser 30 Minuten lang mit dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, der an den Primärantikörper bindet, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Waschen Sie danach die Deckgläser jeweils fünf Minuten lang mit PB S3, um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. Montieren Sie anschließend die Deckgläser mit Montagemedien auf einem sauberen Glasobjektträger.

Tragen Sie dann Klarlack auf den Rand des Deckglases auf, um ihn zu fixieren. Sobald sie getrocknet sind, visualisieren Sie die Neuronen und nehmen Sie Bilder mit der Software auf, die dem Fluoreszenzmikroskop beiliegt. Dies ist eine Darstellung der Dai-Injektion in den Gastro-Muskel und des retrograden Transports vom Muskel zum DRG.

Hier sind die DRG L vier und L fünf beschriftet. Die afferenten Neuronen sind im Hellfeldbild zu sehen, und dieses Fluoreszenzbild zeigt ein mit Farbstoff markiertes Muskelafferentenneuron. Dieses Histogramm zeigt die DII-Fluoreszenzintensität von sensorischen Neuronen.

Der große Peak stammt von unmarkierten Neuronen und ist mit einer Gaußschen Gleichung versehen, um die mittlere Intensität und die Standardabweichung zu bestimmen. Die gestrichelte vertikale Linie stellt den Schwellenwert für die DAI-Beschriftung dar. Das Histogramm enthält Daten von 1047 Neuronen, von denen 167 mit Dai markiert sind.

Hier ist ein repräsentatives muskelafferentes Neuron mit guter Kontrolle der Membranspannung. Links sind die Natriumströme bei minus 20, minus 10 und null Millivolt dargestellt und rechts das Stromspannungsverhältnis. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die DRGs schnell, aber vorsichtig zu zerlegen und das Präparat immer wieder bei ice code hbss feucht zu halten.

Nach diesem Verfahren können andere efferente Neuronen markiert und identifiziert werden, um ihre Rolle in der Physiologie zu verstehen.