Zellsubtyp-spezifische Analyse von neuronalen Membranproteasomen in somatosensorischen Neuronen

Wir untersuchen die Mechanismen, wie somatosensorische Neuronen über das kürzlich entdeckte neuronale Membranproteasom (NNP) kommunizieren, um zu modulieren, wie wir Berührungen, Juckreiz und Schmerz wahrnehmen. Vor kurzem haben wir das neuronale Membranproteasom entdeckt, einen spezialisierten Proteinabbaukomplex, der in einigen sensorischen Neuronen vorkommt und die Empfindlichkeit gegenüber Berührung, Juckreiz und Schmerz moduliert. Mit diesem Protokoll werden wir in der Lage sein, die Expressions- und Modulationsdynamik des NMP auf zelltypspezifische Weise unter Gesundheits- und Krankheitsbedingungen zu untersuchen.

Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung von NMP-exprimierenden Neuronen von den nicht-NMP-exprimierenden Neuronen, um ihre Funktion mit Zelltypspezifität untersuchen zu können. Wichtig ist, dass diese isolierten neuronalen Populationen für nachgelagerte Analysen brauchbar bleiben. Mit diesen Protokollen werden wir beginnen zu untersuchen, wie verschiedene neuropathische Erkrankungen die Expression und Funktion des NMP beeinflussen und wie dies zu veränderten Berührungen, Juckreiz und Schmerzempfinden beiträgt.

Zu Beginn werden die entnommenen Spinalganglien in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie mit einer Pipette sieben Milliliter der Arbeitslösung der Gewebedissoziationsenzymmischung in das Röhrchen und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren. Legen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge und drehen Sie die Ganglien bei 120 G zwei Minuten lang nach unten.

Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Ganglien in sieben Millilitern einer Gewebedissoziationsenzymmischung mit geringer Verreibung mit Papain. Nach erneutem Zentrifugieren des Röhrchens den Überstand aspirieren und verwerfen.

Suspendieren Sie dann die Ganglien in 500 Mikrolitern BSA-, TI- und DMEM-Lösung. Mit einer einen Milliliter eingesteckten, feuerpolierten Glaspipette die Ganglien 12 bis 16 Mal verreiben. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um Zelltrümmer herauszufiltern.

Waschen Sie das Sieb mit einem Milliliter BSA-, TI- und DMEM-Lösung, um die verbleibenden Neuronen der Spinalganglien zu sammeln. Übertragen Sie die gefilterte Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Bereiten Sie eine Immunfluoreszenz-Färbeschale vor, indem Sie sie mit einem großen Stück Parafilm auskleiden.

Übertragen Sie mit einer sterilen Pinzette 5-45 die Deckgläser aus der Gewebekulturschale auf den Parafilm, wobei Sie darauf achten, dass die Seite mit den Neuronen der Spinalganglien nach oben zeigt. Pipettieren Sie langsam 100 Mikroliter Medium der Spinalganglien auf jeden Deckglas, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Verdünnen Sie dann den go anti PSM alpha zwei Primärantikörper in warmen dorsalen Wurzelganglienmedien, um eine Verdünnung von eins bis 20 zu erreichen.

Entfernen Sie mit einem Aspirator, der mit einer ungefilterten P10-Spitze ausgestattet ist, das Medium langsam vom Rand jedes Deckglases. Geben Sie 100 Mikroliter der go anti PSM alpha two-Antikörperlösung auf jeden Deckglas und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie danach vorsichtig die primäre Antikörperlösung von jedem Deckglas.

Geben Sie 100 Mikroliter PBS bei Raumtemperatur in die Zellen und inkubieren Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur, um sie zu waschen. Um nun den sekundären Anti-Go-Antikörper herzustellen, verdünnen Sie ihn in warmem Medium der dorsalen Wurzelganglien in einer Verdünnung von eins bis 250. Nach Abschluss der dritten Wäsche geben Sie 100 Mikroliter der verdünnten Sekundärantikörperlösung auf jeden Deckglas.

Inkubieren Sie die Deckgläser 40 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie die Zellen vor Licht. Aspirieren Sie dann die sekundäre Antikörperlösung von den Deckgläsern und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, wie zuvor beschrieben. Fügen Sie nach der letzten PBS-Wäsche 100 Mikroliter Fixierlösung hinzu, die 4 % para-Formaldehyd und 4 % Saccharose in PBS enthält.

Sobald die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, aspirieren Sie das Fixiermittel von jedem Deckglas. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS, wie zuvor beschrieben. Um die Zellen zu permeabolisieren, fügen Sie 100 Mikroliter 0,1% nichtionisches Detergens in PBS hinzu.

Inkubieren Sie die Deckgläser fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie dann die durchlässige Lösung von den Deckgläsern und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, wie zuvor beschrieben. Geben Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung, bestehend aus 5 % fötalem Rinderserum und 5 % Eselsserum in PBS, zu jedem Deckglas.

Als nächstes verdünnen Sie Kaninchen-Anti-CGRP, A-Selektin B-Vier-Biotin-Konjugat und Hühnchen-Anti-NFH in der Blockierungslösung, um die spezifische primäre Antikörpermischung für den Spinalganglien-Neuronenzelltyp herzustellen. Aspirieren Sie die Blockierungslösung aus den Deckgläsern und geben Sie dann 100 Mikroliter des vorbereiteten Primärantikörpergemisches zu jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Deckgläser 45 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie dabei vor Licht.

Entfernen Sie anschließend die primäre Antikörperlösung von den Deckgläsern und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie nun die sekundäre Antikörpermischung vor, indem Sie Streptavidin, Esel Anti Kaninchen und Esel Anti Huhn auf jeweils eins bis 500 in Blockierungslösung verdünnen. Aspirieren Sie die letzte PBS-Wäsche von jedem Deckglas und fügen Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten Sekundärantikörperlösung hinzu.

Inkubieren Sie die Deckgläser bei Raumtemperatur für 45 Minuten im Dunkeln. Saugen Sie die letzte Wäsche aus dem Deckglas ab. Heben Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze jeden Deckzettel vom Parafilm ab und tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit vorsichtig ab, indem Sie den Rand des Deckglases mit einem fusselfreien Tuch berühren.

Geben Sie ein sieben Mikroliter großes Tröpfchen Eindeckmedium auf einen Objektträger. Senken Sie den Deckglas vorsichtig mit der Zellenseite nach unten auf das Eindeckmedium ab, um vollen Kontakt mit dem Medium zu gewährleisten. Legen Sie die vorbereiteten Objektträger in eine dunkle, trockene Schublade oder Schachtel, um sie mindestens eine Stunde lang zu trocknen.

Versiegeln Sie den Rand des Deckglases mit schnell trocknendem Nagellack und warten Sie 10 bis 15 Minuten, bevor Sie fotografieren. Antikörper, die sich von lebenden Neuronen des Spinalgangliens ernährten, zeigten eine Subpopulation von Neuronen mit oberflächenzugänglichen Proteasomen, während Kontrollproben ohne primären Antikörper keine Oberflächenmarkierung zeigten. Die Durchflusszytometrie identifizierte zwei unterschiedliche Populationen von Neuronen des Spinalgangliens auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität, wobei NMP-positive von NMP-negativen Zellen getrennt wurden, wobei klare Gating-Regionen unter Verwendung von Kontrollen etabliert wurden.

Die Quantifizierung der flusssortierten Populationen zeigte, dass etwa 4% der Neuronen des Spinalgangliens NMP-positiv waren, während die verbleibende Mehrheit NMP-negativ war. Sortierte NMP-positive und NMP-negative Neuronen behielten ihre Lebensfähigkeit bei und exprimierten die zelltypspezifischen Marker NFH, IB vier und CGRP, was die Eignung des Arbeitsablaufs für die nachgelagerte molekulare Analyse bestätigt.