Transplantation einer biotechnologisch hergestellten Lunge unter Verwendung von dezellularisierten Mauslungen und primären humanen Endothelzellen

Die Biotechnik von Organen in menschlicher Größe erfordert eine große Menge an Ressourcen, die oft die Kapazität akademischer Labore übersteigt. Die Reduzierung der Kosten für die iterative Protokollentwicklung wird den Forschungsfortschritt in diesem Bereich beschleunigen. Das Ziel dieser Studie ist es, das standardisierte Protokoll für das Lungen-Bioengineering unter Verwendung von Herz-Lungen-Blöcken der Maus bereitzustellen. Es ist noch nicht bekannt, welche Zellen für das Organ-Bioengineering geeignet sind und wie diese Zellen in die Organ-Bioreaktorkultur integriert werden sollten. Mehrere Arten von Zellen und Bedingungen müssen verglichen werden, um skalierbare und reproduzierbare Protokolle zu erstellen.

Mäuse sind kleine und leicht zu handhabende Versuchstiere. Obwohl sie klein sind, ist die grundlegende Architektur der Lunge bei allen Säugetieren ähnlich. Durch die Optimierung des Protokolls auf dieser kleinen Plattform können wir die Laser-Tiermodelle skalieren, indem wir die optimierten Ergebnisse einfach entsprechend der Größe der Tiere multiplizieren. Diese mausgroße Lungen-Bioengineering-Plattform ermöglicht es Forschern, ihre Stammzellen effizient zu testen. Diese genetisch veränderten Zellen können wertvoll oder teuer für die gesamte Lungentechnik sein. Darüber hinaus können von Patienten stammende Zellen auch verwendet werden, um Krankheitsmodelle in vitro zu erstellen.

Zu den aktuellen Bemühungen gehört die Erprobung mehrerer Arten von gentechnisch veränderten Stammzellen und Vorläuferzellen, um das erforderliche Proliferationspotenzial und die unterschiedliche Kapazität für das Lungenbioengineering herauszufinden. Sobald geeignete Zellen identifiziert sind, wird diese Forschung auf ein größeres Tiermodell wie Schweine ausgeweitet.

[Erzähler] Legen Sie die euthanasierte Maus zunächst in Rückenlage auf einen Operationstisch und fixieren Sie die Gliedmaßen. Sprühen Sie 70% Ethanol gleichmäßig auf die Brust- und Bauchoberfläche, um sie zu sterilisieren. Öffnen Sie anschließend die Bauchhöhle entlang der Mittellinie, die sich bis zum Hals erstreckt, mit einer Edelstahlschere und spalten Sie das Brustbein. Trennen Sie das Zwerchfell von der Brustwand. Schneiden Sie die ventrale Brustwand ab, um die Brusthöhlen freizulegen und den Thymus zu entfernen. Mit einer 4/0-Seidennaht legen Sie die untere Hohlvene und die rechte obere Hohlvene an. Schneiden Sie die Bauchschlagader mit einer Edelstahlschere zur Drainage ab. Injizieren Sie mit einer sterilen Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, drei Milliliter steriles PBS in den rechten Ventrikel, indem Sie die Ventrikelwand punktieren. Verwenden Sie eine Dumont-Pinzette, um eine 4/0-Seidennaht um die Hauptpulmonalarterie zu schlingen. Schneiden Sie anschließend mit einer Federschere ein zwei Millimeter großes Fenster unter den Pulmonalarterienklappen auf, um Zugang zur rechten Ventrikelwand zu erhalten. Führen Sie den Lungenarterienkatheter durch das Fenster ein und sichern Sie ihn mit der vorgeschlaufenen 4/0-Seidennaht. Injizieren Sie langsam zwei Milliliter PBS durch den Lungenarterienkatheter mit einer Fünf-Milliliter-Spritze. Kanülieren Sie die Luftröhre mit einem Trachealkatheter und binden Sie sie mit einer 4/0-Seidennaht fest. Injizieren Sie nun langsam zwei Milliliter Luft durch den Trachealkatheter mit einer leeren Fünf-Milliliter-Spritze. Halten Sie die Luft 10 Sekunden lang an, um sicherzustellen, dass keine Luft aus der Lunge austritt. Entfernen Sie die Endblockade von Herz und Lunge. Als nächstes wird der resezierte Herz-Lungen-Block zur Dezellularisierung der Lunge in eine Petrischale aus Kunststoff mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern mit deionisiertem Wasser übertragen. Inkubieren Sie den Block eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Injizieren Sie nach der Inkubation mit einer Fünf-Milliliter-Spritze dreimal zwei Milliliter steriles deionisiertes Wasser durch den Trachealkatheter. Pausieren Sie nach jeder Injektion, damit die Flüssigkeit austreten kann, wenn die Lunge zurückweicht. Injizieren Sie auf ähnliche Weise zwei Milliliter Wasser durch den Lungenarterienkatheter. Injizieren Sie zwei Milliliter 0,1 % ige Triton X-100-Lösung in den Tracheal- und den Lungenarterienkatheter. Übertragen Sie den Herz-Lungen-Block in eine Petrischale und inkubieren Sie ihn statisch in Triton X-100-Lösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die Triton X-100-Lösung aus der Lunge zu entfernen, injizieren Sie am nächsten Tag zwei Milliliter deionisiertes Wasser in den Trachealkatheter und den Lungenarterienkatheter und wiederholen Sie diese mit zwei Millilitern 2%iger Desoxycholatlösung. Nachdem Sie die Desoxycholatlösung aus der Lunge entfernt haben, injizieren Sie zwei Milliliter einer molaren Natriumchloridlösung in den Tracheal- und den Lungenarterienkatheter. Inkubieren Sie den Herz-Lungen-Block eine Stunde lang. Nach der Entfernung der Natriumchloridlösung mit entionisiertem Wasser injizieren Sie zwei Milliliter DNase I Arbeitslösung in die Tracheal- und Lungenarterienkatheter. Inkubieren Sie den Herz-Lungen-Block eine Stunde lang. Injizieren Sie steriles PBS in die Tracheal- und Lungenarterienkatheter, um die DNase I-Lösung zu entfernen. Bestätigen Sie nach der Dezellularisierung, dass die Lunge weiß und an den Rändern transparent ist. Geben Sie 70 Milliliter Endothelzellwachstumsmedium 2 oder EGM-2-Kulturmedium in den Glasbehälter und setzen Sie den Silikonstopfen auf den Behälter, um ihn zu verschließen. Montieren Sie einen Silikonstopfen, einen Glaskanister, einen GL45-Schraubverschluss mit Schlauch, eine autoklavierbare 250-Milliliter-Glasflasche und einen L/S 14-Schlauch mit Köderanschlüssen unter Verwendung von Dreiwege-Absperrhähnen. Führen Sie eine 20-Gauge-Nadel in das Silikonseptum des GL45-Schraubverschlusses ein. Füllen Sie die Schläuche A, B und C mit Nährmedien mit einer 10-Milliliter-Spritze, die an die Absperrhähne eins und drei angeschlossen ist. Befestigen Sie den Lungenarterienkatheter des dezellularisierten Herz-Lungen-Blocks über eine Köderverschraubung an Schlauch C. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Katheter oder Schlauch befinden. Für die schwerkraftgetriebene Injektion von Endothelzellen legen Sie ein Zellreservoir mit menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) auf einen Magnetrührer und stellen Sie sicher, dass sich das Reservoir 30 Zentimeter über der Organkammer befindet. Schalten Sie den Magnetrührer mit einer Drehzahl von 120 U/min ein. Öffnen Sie die Absperrhähne eins und zwei, damit die Zellsuspension über die Schläuche A, C und den Pulmonalarterienkatheter in das dezellularisierte Gerüst fließen kann. Für die Perfusion der Organkultur stellen Sie die Organkammer in einen Kohlendioxid-Inkubator. Befestigen Sie den Schlauch B an einem Pumpenkopf, der mit einer pulsierenden Pumpe verbunden ist. Schließen Sie die Glastür des Inkubators. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch richtig zwischen der Tür und der Gummidichtung positioniert ist. Inkubieren Sie das dezellularisierte Gerüst drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Endothelzellen im Gerüst ansiedeln können. Starten Sie die Pumpe mit einer Geschwindigkeit von sechs U/min, was zu einer Medienperfusion von zwei Millilitern pro Minute mit L/S 14-Schläuchen führt. Beobachten Sie, wie sich die dezellularisierte Lunge aufgrund der Medienperfusion leicht ausdehnt. Schließen Sie dann die Inkubatortür. Um den Medienwechsel durchzuführen, stoppen Sie den Pumpenantrieb. Befestigen Sie eine sterile 50-Milliliter-Spritze an den Absperrhahn drei und entnehmen Sie 50 Milliliter des Mediums aus der Kammer. Füllen Sie eine weitere sterile 50-Milliliter-Spritze mit 50 Millilitern vorgewärmtem Medium. Die Lösung wird in einen Glasbehälter injiziert und das Medium über den Absperrhahn drei in die Kammer geleitet, wobei sichergestellt wird, dass der Absperrhahn ordnungsgemäß geschaltet ist. Starten Sie die pulsierende Pumpe neu. Entnehmen Sie den regulularisierten Herz-Lungen-Block nach zwei Tagen Perfusionsorgankultur. Die Lungen der Maus erschienen nach der Dezellularisierung weiß und durchscheinend, was auf die Entfernung zellulärer Komponenten hinweist, während die gesamte Lungenstruktur erhalten blieb. Die histologische Analyse von dezellularisierten Mauslungen ergab intakte Alveolarstrukturen ohne verbleibende zelluläre Bestandteile. Rezellularisierte Mäuselungen mit drei mal 10 hoch sieben HUVECs zeigten nach zwei Tagen perfusionsbasierter Bioreaktorkultur eine homogene Verteilung der HUVECs. HUVECs wanderten in periphere Alveolarbereiche und bildeten ein kapillarartiges Netzwerk, wie es bei regulularisierten Lungen beobachtet wird.