Analyse von Proteindynamik mit Wasserstoffwechsel Massenspektrometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die bestätigende Flexibilität von Proteinen und deren Veränderungen als Reaktion auf Umwelt-, Ligandenbindungs- oder Proteinproteininteraktionen zu analysieren. Dies wird durch die Vorinkubation des interessierenden Proteins unter verschiedenen Bedingungen erreicht, von denen vermutet wird, dass sie die Bestätigung des Proteins beeinflussen, wie z. B. die Ligandenbindung. Das Reaktionsgemisch wird dann in Deuteriumoxid verdünnt, für verschiedene Zeitintervalle inkubiert und anschließend mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie analysiert, um den Grad des Einbaus von Deutero in das Peptidrückgrat zu bestimmen.

Amidgruppen, da Schutzgebiete den Einbau von Deuteros verringert haben, zeigt der Vergleich der Peptidspektren des Experiments in Abwesenheit und Vorhandensein eines Bindungspartners eine Verschiebung der OID der Spektren aufgrund des Gewichtsunterschieds zwischen Proton und Deuteron. Regionen, die nach Zugabe eines Bindungspartners einen ausgeprägten Schutz aufweisen, sind potenzielle Bindungsstellen. Abhängig von der Sequenzabdeckung und der Verfügbarkeit von überlappenden Peptiden können die Bindungsstellen auf wenige Aminosäuren eingegrenzt werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteinfaltung und der Proteindynamik zu beantworten, z. B. wie sich Proteine falten, wie sie sich entfalten, wie sie auf physikalische und chemische Einflüsse wie Temperaturanstieg oder Schwermetalle reagieren. Wie vergleichbare Bindungen und Protein-Protein-Wechselwirkungen die Bestätigung eines Proteins beeinflussen können. Es ist auch sehr wichtig für die Entwicklung von Proteinmedikamenten, zur Überprüfung der korrekten Faltung und für die allgemeine Qualitätskontrolle.

Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, auf mehrere Schwierigkeiten stoßen. Wenn das Protein beispielsweise von Pepsin nicht gut verdaut wird, ist die Sequenzabdeckung gering. Wenn das Protein sehr aggregationsanfällig ist, kann es während der Inkubation oder nach Zugabe des Quench-Puffers aggregieren, was zu niedrigen Signalintensitäten im Massenspektrometer führt.

In dieser Demonstration werden wir die Bindung des molekularen Hefe-Chaperons HP 90 an sein cos-Chaperon Sty one mittels Wasserstoffaustausch-Massenspektrometrie untersuchen. STY one bindet an HP 90 und erleichtert die Client-Bindung durch Hemmung der ABA-Aktivität von HB ninety. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Puffern, Proben und Kügelchen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Säulen für den Amidwasserstoffaustausch vorzubereiten, schrauben Sie eine Seite der Vorsäule ab und entfernen Sie den Filter fest.

Schrauben Sie den Packtrichter auf das offene Ende der Säule. Verwenden Sie einen 16-Zoll-Adapter, um eine leere Fünf-Milliliter-Spritze am unteren Auslass der Säule anzubringen. Stellen Sie sicher, dass es gasdicht an der Vorsäule befestigt ist.

Tragen Sie ein paar Tropfen Gülleperlenmaterial auf den Trichter auf. Ziehen Sie den Kolben der Spritze, um die Gülle durch den Trichter in die Vorsäule zu saugen. Tragen Sie mehr Gülleperlenmaterial auf den Trichter auf und setzen Sie den Vorgang fort, bis die Vorsäule vollständig mit Raupenmaterial gefüllt ist.

Entfernen Sie dann den Trichter, bevor Sie den Filter und den Filterring fest auf das offene Ende aufsetzen. Schrauben Sie die Säulenkappe auf die Vorsäule und entfernen Sie die Spritze von der anderen Seite. Verschließen Sie beide Enden der Vorsäulen mit Dübeln.

Um ein Austrocknen des Säulenmaterials zu vermeiden, um das System für die Wasserstoffaustausch-Massenspektrometrie einzurichten. Schließen Sie zunächst die Trap-Säule an das Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- oder HPLC-System an. Äquilibrieren Sie die Säule, indem Sie die Durchflussmenge von Pumpe A auf 0,4 Milliliter pro Minute mit 0,1 % Ameisensäure als Lösungsmittel einstellen.

Verbinden Sie nach der Kalibrierung des Massenspektrometers den Ausgang der HPLC mit der Quelle des Massenspektrometers. Um zuerst die peptischen Peptide zu bestimmen, schließen Sie die Pepin-Säule und dann die analytische Säule an das System an. Stellen Sie die Parameter für Chromatographie und Massenspektrometrie in der Steuerungssoftware ein, indem Sie den Gradiententyp und die Massenspektrometriemethode auswählen.

Wählen Sie einen langen Gradienten, um eine gute chromatographische Auflösung zu gewährleisten. Aktivieren Sie Tandem-Massenspektren auf dem Massenspektrometer. Bereiten Sie 100 bis 200 Pomo Hitzeschockprotein 90 oder HSP 90 in 100 Mikrolitern H zwei L Puffer vor.

Fügen Sie 100 Mikroliter Quench-Puffer hinzu und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren. Injizieren Sie die 200-Mikroliter-Probe mit einer Hamilton-Spritze in den Injektionsanschluss des Injektionsventils. Schalten Sie das Injektionsventil in die Injektionsposition und starten Sie das Chromatographieprogramm.

Als nächstes identifizieren Sie peptische Peptide des Hitzeschockproteins 90, indem Sie eine Datenbank nach den resultierenden Peptiden durchsuchen. Senken Sie die Systemtemperatur auf null Grad Celsius, indem Sie Eiswasser hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Schritt ohne Tandem-Massenspektrometrie und mit dem Gradienten, der für das eigentliche Wasserstoffaustauschexperiment verwendet wird.

Für das Hitzeschockprotein 90 und das STI-Protein verwenden Sie einen 10-minütigen Gradienten von 90 % Lösungsmittel, einem 10 % Lösungsmittel B auf 45 % Lösungsmittel, A 55 % Lösungsmittel B, bestimmen Sie die Retentionszeiten der identifizierten peptischen Peptide in dem verwendeten Gradienten und erstellen Sie eine Liste, die Peptidsequenz, Peptidladung, Zustand und Retentionszeit umfasst. Dies wird verwendet, um jedes Peptid nach Wasserstoffaustauschexperimenten zu identifizieren. Um Protein-Protein-Interaktionsgrenzflächen zu identifizieren, richten Sie zunächst die Gradienten- und Massenspektrometrie-Methode ein.

Verwenden Sie in der Steuerungssoftware einen 10-minütigen linearen Gradienten von 90 % Lösungsmittel, 10 % Lösungsmittel B bis 45 % Lösungsmittel. Eine 55%ige Lösungsmittel-B-Ladung ist eine Massenspektrometriemethode, die für den Nachweis von Masse-Ladungs-Verhältnissen zwischen 300 und 1.500 optimiert ist, obwohl die meisten Peptide unter dem Masse-Ladungs-Verhältnis von 1000 liegen. Stellen Sie das Einspritzventil in Laststellung und das Ventil mit sechs Anschlüssen.

Stellen Sie in der Beladeentsalzungsposition die Fördermenge der Beladepumpe auf 0,4 Milliliter pro Minute ein. Nach Ausführung der unveränderten Referenz und der 100%igen Kontrollprobe, wie im Textprotokoll beschrieben, werden 20 bis 100 Picomol Hitzeschockprotein 90 in einem Volumen von ein bis fünf Mikrolitern hergestellt. Fügen Sie temperaturangepassten Deuteriumoxidpuffer hinzu, um das Probenvolumen auf 100 Mikroliter zu bringen, inkubieren Sie genau den Zeitraum, der zuvor definiert wurde, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bei der Bestimmung des dynamischen Austauschbereichs dann 100 Mikroliter eiskalt zugeben, Quench-Puffer zugeben und zweimal hoch und runter pipettieren, die 200 Mikroliter schnell in das Injektionsventil der HPLC injizieren. Schalten Sie das Injektionsventil in die Injektionsposition und starten Sie sofort das Chromatographieprogramm. Schalten Sie das Ventil mit sechs Anschlüssen nach zwei Minuten von der Entsalzungsladeposition in die Eluierungsposition.

Tun Sie dies für jedes Protein einzeln, um den Deuteron-Einbau in jedes Peptid in Abwesenheit des interagierenden Proteins zu bestimmen, um die Wechselwirkungsoberfläche zu bestimmen, mischen Sie das Wärmeschockprotein 90 mit einem mindestens zweifachen Überschuss an STI eins, um das Gleichgewicht in den gebundenen Zustand zu verschieben, inkubiert die gewünschte Temperatur, bis die Komplexbildung im Gleichgewicht ist. Nach der Inkubation fügen Sie temperaturangepassten Deuteriumoxidpuffer hinzu, um das Probenvolumen auf 100 Mikroliter zu erhöhen, und inkubieren Sie genau für einen definierten Zeitraum. Fügen Sie dann 100 Mikroliter eiskalten Quench-Puffer hinzu und pipettieren Sie zweimal auf und ab, injizieren Sie das Protein schnell und laufen Sie wie zuvor.

Analysieren Sie die gewonnenen Daten mit geeigneter Software und nutzen Sie die ermittelten Retentionszeiten, um jedes Peptid in der Analyse zu finden. Berechnen Sie die OID der Isotopenverteilung für das unveränderte Protein und für die Wasserstoffaustauschexperimente, vergleichen Sie den Einbau von Deuteros des Zielproteins allein und mit einem Überschuss an Bindungspartner. Dies kann automatisch mit kommerzieller Software oder manuell mit dem Tabellenkalkulationsprogramm M erfolgen, die direkte Proteinprotein-Interaktion zwischen HS P 90 und STI one wurde durch den Vergleich der STI one Peptidspektren in Abwesenheit und Anwesenheit von HS P 90 nach Deuteriumoxid-Markierung getestet.

Das resultierende Differenzdiagramm zeigt, dass die meisten Peptide in TPR 2 A und TPR zwei B einen starken Schutz in Gegenwart von HS P 90 zeigen, was darauf hindeutet, dass diese Regionen mit HS P 90 interagieren. Der Schutz in TPR zwei A kann leicht aus der Kristallstruktur von STY one TPR two A TPR two B im Komplex mit einem HS P 90-Peptid rationalisiert werden, das entsprechend der Anzahl der Amyloid-Protonen, die vor dem DEUTERO-Einbau geschützt sind, gefärbt ist. Ein solch eindeutiger Schutz bei Protein-Protein-Wechselwirkungen wird nicht immer beobachtet.

Der Schutz in HSP 90 in Gegenwart von STI one ist nicht so ausgeprägt und nicht so lokalisiert wie bei STI one. Alle Peptide zeigen einen leicht erhöhten Schutz vor dem Einbau von Deutero. Hier ist eine Cartoon-Darstellung der Hefe HS P 90 dargestellt, die entsprechend der Anzahl der Amli-Protonen gefärbt ist, die vor dem Einbau von Deuteronen geschützt sind, STY one stabilisiert HS P 90 global, da keine Region des Proteins mehr Flexibilität in ihrer Gegenwart zeigt.

Es ist nicht klar, ob dieser verminderte Deuteroneneinbau auf eine direkte Wechselwirkung mit dem Gerstenkorn oder auf allosterische Effekte zurückzuführen ist. Bei der Bestätigung der kontinuierlichen Markierung von HSP 90 wurden Wasserstoffaustausch und Massenspektrometrie eingesetzt, um die Dynamik verschiedener Proteinregionen zu untersuchen. Hier sind die Spektren der Peptide 43 bis 62 aus der Nukleotidbindungsdomäne von HSP 90 dargestellt.

In Gegenwart und Abwesenheit von STI one zeigen die Peptidspektren einen zeitabhängigen Einbau von Deuterium, der mit längerer Inkubation zunimmt. Der Schutzgrad ändert sich während der Inkubationszeit, wobei sich bei kürzeren Inkubationszeiten ein größerer Unterschied und bei längsten Zeitpunkten fast ähnliche Wechselkurse zeigen. Dies deutet auf einen geringeren Grad der Stabilisierung oder einen Bereich dynamischer Wechselwirkungen mit häufiger Dissoziation und Sossoziation hin.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Bedingungen akribisch konstant zu halten und alles bereit zu haben, bevor Sie mit der Austauschreaktion beginnen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden verwendet werden, um zusätzliche Fragen wie die Position von Interaktionsstellen in Proteinkomplexen zu beantworten.