Eine Methode zur Bestimmung und Simulation von Durchlässigkeit und Diffusion in einem 3D Gewebe-Modell in einer Membran einfügen System für Multi-well-Platten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Permeabilität und die Diffusionskoeffizienten von 3D-Hautmodellen in einem kleinen Membraneinsatzsystem zu bestimmen. Diese Fragen können dazu beitragen, zentrale Fragen zum 3D-Hautgewebe-Engineering für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen zu beantworten, bei denen die Permeabilität und der Diffusionskoeffizient wesentliche Qualitätsfaktoren sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Messung dieses Koeffizienten innerhalb eines kleinen Multi-Well-Einsatzes ermöglicht.

Das kleine Membraneinsatzsystem in der Simulation kann für den Einsatz in Organen auf dem Schiff und anderen Anwendungen, die Membraneinsatzsysteme verwenden, weiter modifiziert werden. Um ein Agarose-Gel herzustellen, tragen Sie zunächst 28,6 Mikroliter frisch zubereitetes flüssiges Agarose-Gel mit einer Temperatur von 80 Grad Celsius auf jede Membran eines 96-Well-Membran-Inset-Systems auf. Nach 10 Minuten ist das Gel erstarrt und kann für einen Permeabilitätstest verwendet werden.

Um ein Kollagenzellmodell herzustellen, mischen Sie zunächst 125 Mikroliter HBSS und einen Milliliter Kollagen-R-Lösung auf Eis, gefolgt von einer Neutralisation mit Natriumhydroxid. Als nächstes fügen Sie der Mischung 125 Mikroliter primärer Fibroblasten hinzu, die in vollständigem Medium suspendiert sind. Und fügen Sie 28,6 Mikroliter der resultierenden Zelllösung in jede Vertiefung eines neuen 96-Well-Membraneinsatzsystems hinzu.

Geben Sie nach 30 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator 75 Mikroliter vollständiges Medium auf die Oberfläche des Gels und 300 Mikroliter vollständiges Medium auf den Boden jeder Vertiefung für eine Inkubation über Nacht im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 75 Mikroliter humane adulte Keratinozyten mit niedrigem Kalziumgehalt und hoher Temperatur in jedem Kollagenzellmodell und stellen Sie die Platte für weitere drei Tage in den Zellkultur-Inkubator. Am vierten Tag aspirieren Sie das Medium von der Oberfläche des Zellmodells und stellen Sie die Platte für weitere sieben Tage in den Inkubator zurück.

Um einen Permeabilitätstest durchzuführen, geben Sie 75 Mikroliter Spendersubstanz in ein kleines Well-Insert-Modellsystem von Interesse und geben Sie 300 Mikroliter Akzeptorsubstanz in den Boden jeder Vertiefung. Stellen Sie die Platte fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 Prozent Luftfeuchtigkeit und ca. 480 U/min auf einen Shaker, übertragen Sie das Membraneinsatzsystem einmal pro Stunde in eine leere 96-Well-Platte und messen Sie die diffuse Fluoreszenz in den unteren Wells der Experimentierplatte auf einem Plattenlesegerät. Öffnen Sie am Ende des Permeabilitätsexperiments die entsprechende Modellierungssoftware und starten Sie ein neues Modell.

Wählen Sie Modell-Assistent und 3D-Modell aus. Fügen Sie Transport verdünnter Spezies hinzu, und klicken Sie auf Studie. Wählen Sie dann Zeitabhängig und klicken Sie auf Fertig.

Klicken Sie unter Globale Definitionen mit der rechten Maustaste, um Parameter hinzuzufügen, und geben Sie die geometrischen und physikalischen Parameter in das Raster ein. Richten Sie die Geometrie des Membraneinfügesystems aus den Experimenten ein, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Definitionen, um zwei Domänensonden hinzuzufügen, wobei Sie eine Sonde als Akzeptordomäne und die andere als Donordomäne auswählen. Legen Sie beide Domänen auf den Durchschnitt mit einem Ausdruck C und einer Einheit von Mol pro kubiertem Meter fest.

Und stellen Sie den Diffusionskoeffizienten unter Transporteigenschaften eins und Transport von verdünnten Spezies ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport verdünnter Spezies, um eine zweite Transporteigenschaft mit zwei hinzuzufügen, und wählen Sie die zweite Barriere in der Domänenauswahl aus. Beim Transport verdünnter Spezies ist für den Anfangswert eins die Konzentration als Null zu definieren.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport verdünnter Spezies, um einen zweiten Anfangswert zwei hinzuzufügen, und wählen Sie den Donor als dritte Domäne aus. Stellen Sie die Konzentration als Anfangskonzentration der fluoreszierenden Donorsubstanz ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Transport der verdünnten Spezies, um eine Symmetrie hinzuzufügen, und wählen Sie alle Flächen der Berandungsauswahl aus, die die gesamte Geometrie widerspiegeln.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netz, um zwei freie Tetraeder hinzuzufügen und die zweite Barriere als Domäne festzulegen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den freien Tetraeder, um die Größe des vordefinierten Netzes zu extrafein hinzuzufügen. Im zweiten freien Tetraeder setzen Sie den Akzeptor und den Donor als Domänen und das vordefinierte Netz auf feiner.

Klicken Sie dann unter Studie eins auf Berechnen, um die Simulation zu starten. Um den Diffusionskoeffizienten an die von der Diffusionssimulation generierten Daten anzupassen, öffnen Sie das Menü "Hellseher hinzufügen" und wählen Sie "Mathematik". Lokalisieren Sie Optimierung und Empfindlichkeit.

Wählen Sie Optimierung aus und klicken Sie auf Zur Komponente hinzufügen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf Definitionen, um Variablen hinzuzufügen, und geben Sie die Variablen aus Tabelle drei manuell ein. Klicken Sie anschließend im Menü der Komponentenkopplung mit der rechten Maustaste auf Definitionen, fügen Sie durchschnittlich eins hinzu, gefolgt von der manuellen Hinzufügung des Akzeptors als Operatorname, und wählen Sie Domäne eins aus.

Exportieren Sie die experimentellen Daten in ein neues Textdokument. Verwenden Sie ein Semikolon, um die Daten in Spalten zu unterteilen, und einen Zeilenumbruch, um die Daten in Zeilen zu unterteilen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Optimierung, um das globale Ziel der kleinsten Quadrate hinzuzufügen, und hängen Sie das Textdokument an die experimentellen Daten an.

Klicken Sie auf globales Ziel der kleinsten Quadrate, um die erste Spalte als Zeitspalte und die zweite Spalte als Wertspalte eins zu definieren. Geben Sie in der Spalte Ausdruck des Werts die Variable C ein.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Optimierung, um die globale Steuervariable eins hinzuzufügen. Und deklarieren Sie die D-Unterstrichsuche als Variable mit einem Anfangswert von eins, einer Untergrenze von Null und einer Obergrenze von 1.000.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Studie eins, um eine Optimierung hinzuzufügen. Und wählen Sie SNOPT als Optimierungslösermethode aus. Legen Sie die Optimalitätstoleranz auf eins hoch minus acht fest.

Stellen Sie dann den Diffusionskoeffizienten für die Barriere auf D ein.Stellen Sie die Simulationszeit in der Untersuchungseinstellung von null Sekunden auf 22.000 Sekunden mit einem Intervall von 100 Sekunden ein, und klicken Sie auf Berechnen, um mit der Parameteroptimierung zu beginnen. Die histologische Analyse eines Kollagenzellmodells zeigt eine leichte Färbung der Fibroblasten innerhalb der zentralen Matrix. An der Spitze der Kollagenmatrix ist eine Schicht zu beobachten, die viele Kerne enthält, die wahrscheinlich aus menschlichen erwachsenen Keratinozyten mit niedrigem Kalziumgehalt und hoher Temperatur bestehen.

Unter Verwendung von Fluorescein-Natriumsalz und Fluorescein-Isothyocyanat-Dextran wird der Einfluss der Molekülgröße der diffundierenden Substanz überprüft, was zeigt, dass bei kleinen Molekülgrößen die Simulation und die experimentellen Daten für beide Moleküle gut übereinstimmen. Größere Molekülgrößen erzeugen jedoch in Simulationen höhere Abweichungen in den Kurvenverläufen, was eine Verzögerung zu Beginn und einen stärkeren Anstieg im späteren Verlauf der Graphen zeigt. Tatsächlich nimmt der Permeationskoeffizient mit zunehmender Molekülgröße ab, wobei sich die simulierten Koeffizienten ähnlich wie die experimentellen Permeabilitätskoeffizienten verhalten.

Bemerkenswert ist, dass die meisten Modelle, die humane adulte kalziumarme Hochtemperatur-Keratinozyten verwenden, niedrigere Permeations- und Diffusionskoeffizienten aufweisen als Modelle ohne menschliche adulte adulte kalziumarme Hochtemperatur-Keratinozyten. Das Kollagen-Sim-Modell kann in 11 bis 12 Tagen erstellt werden, und die Permeationsmessung kann in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, die Randbedingungen wie die Temperatur, das Füllvolumen, die Konzentration der aufgetragenen Substanz, die Luftfeuchtigkeit und den Membranprozess konstant zu halten, um die Variation des Permeationskoeffizienten zu reduzieren.

Mit Hilfe dieser Modulsimulation kann der experimentelle Aufwand reduziert und die Langzeitleistung vorhergesagt werden. Es kann auch an andere Permeationsgeräte oder Organbesitzsysteme angepasst werden. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der pharmazeutischen und kosmetischen Anwendungen sowie der Interaktionsentwicklung im Tissue Engineering den Weg, um die Diffusionspermeationsprozesse in künstlichen Geweben zu erforschen.