Verwendung eines Hochdurchsatz- In-vitro- Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, biografische Biofilme für Zahnbelag mit mehreren Spezies zu erzeugen. Parallel zur Analyse wird dies erreicht, indem zunächst ein repräsentatives Medium und ein Inokulum erstellt werden. Das Inokulum wird dann nach einer Inkubation über Nacht in den Mikrofluidik-Chip eingeführt, wobei sich im Inneren des Mikrokanals ein Biofilm bildet.

Abschließend wird der Biofilm gewaschen und gefärbt für die in situ zweikonfokale Laser-Scanning-Mikroskopie oder Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Durchflusszellen besteht darin, dass es sich um ein Hochdurchsatzsystem handelt, das es ermöglicht, mehrere Experimente parallel durchzuführen, während weniger Materialien verwendet werden und keine künstlichen Labormedien erforderlich sind. Zu Beginn entnehmen Sie Speichelproben von einer Kohorte von fünf oder mehr Freiwilligen in einzelnen 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Ziehen Sie die Speichelproben in ein einzelnes Plastikbecherglas, das auf Eis steht. Vermeiden Sie die Verwendung von Glasbechern in diesem Setup, da Speichel-Biopolymere dazu neigen, an Glasoberflächen zu haften. Als nächstes fügen Sie der Probe di thio threes hole hinzu, bis ihre Endkonzentration 2,5 Millimolar beträgt.

Die Mischung 10 Minuten auf Eis rühren. Ziehen Sie den gesamten Inhalt in mehrere Plastikröhrchen. Führen Sie 30 Minuten lang ein Schleudern mit hoher Geschwindigkeit in einer gekühlten Zentrifuge mit hoher Geschwindigkeit durch, um Partikel aus der Probe zu trennen.

Füllen Sie den Speichelsatt in einen frischen, sterilen Behälter und entsorgen Sie die Pelletfraktion, um ein bakterienfreies Wachstumsmedium aus der Probe herzustellen. Verdünnen Sie zunächst die tagesschmutzfreie Probe mit drei Volumina deionisiertem Wasser. Dann mit einem 0,22-Mikro-Membranfilter mit geringer Proteinbindung.

Sterilisieren Sie den Speichel, während Sie die nachgefilterte Fraktion auf Eis gekühlt aufbewahren. Die sterilisierte Lösung eloquent und bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Sammeln Sie Speichelproben von einer Kohorte von fünf oder mehr Freiwilligen in sterilen 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Ziehen Sie die Speichelproben in ein bei Raumtemperatur vorsterilisiertes Kunststoffbecherglas oder ein 50-Milliliter-Röhrchen. Sterilisiertes Glycerin zu einem 25%igen Glycerin hinzufügen. 75%Speichelmischung ist erreicht.

Im Gegensatz zum Wachstumsmediumprotokoll, bei dem Verunreinigungen mit einem Filtrationsschritt entfernt wurden, ist hier eine sterile Technik wichtig, um eine Kontamination durch nicht-orale spezifische Bakterien oder Pilze zu verhindern. Mischen Sie die Speichelglycerinlösung. Aliquotieren Sie das Speichel-Glycerin-Gemisch gut und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Starten benötigt werden.

Kaufen oder fertigen Sie einen mikrofluidischen Chip mit Mikrokanal, der den hier gezeigten ähnelt, bevor Proben in den Mikrochip sowohl für das bakterielle negative Wachstumsmedium als auch für das bakterielle positive Inokulum auf dem Labortisch bei Raumtemperatur inokuliert werden. Wirbeln Sie jedes Röhrchen fünf Sekunden lang zum Mischen, bevor Sie mit dem Hauptexperiment fortfahren, und fügen Sie zunächst 100 Mikroliter des Wachstumsmediums aus dem Auslassbehälter der Mikrochips hinzu. Mit einer computergesteuerten Pumpe wird der mittlere Durchfluss durch den Mikrokanal für zwei Minuten gestartet.

Raumtemperatur jeden Kanal visuell inspizieren, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit richtig gefüllt ist. Inkubieren Sie den Mikrochip 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dadurch werden die Seitenwände des Mikrokanals mit einem Biopolymergerüst beschichtet, an dem sich der Biofilm während des Wachstums festsetzt.

Anschließend saugen Sie das restliche Medium manuell aus dem Auslassbehälter an und übertragen diese Fraktion, die nun als hydrodynamische Ausgleichslast in den Einlaufbehälter wirkt. Nach der Ablagerung des Biopolymer-Gerüsts werden 100 Mikroliter des positiven Inokulums des Bakteriums in das Auslassreservoir gegeben. Platzieren Sie den Mikrochip auf einer 37 Grad Celsius heißen Platte und beginnen Sie mit dem Rückfluss mit mittlerer Scherung.

Fahrt vom Auslass zum Einlassbehälter für genau sechs Sekunden. Schalten Sie dann die Pumpe aus und inkubieren Sie den Chip unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten, um die Anheftung von Bakterien oder Pilzen an den Seitenwänden des Mikrokanals zu erleichtern. Entfernen und entsorgen Sie anschließend das gesamte Inokulum mit einer Pipette aus dem Auslassreservoir und füllen Sie dasselbe Reservoir mit einem Milliliter bakterienfreiem Wachstumsmedium neu.

Inkubieren Sie den Mikrochip etwa 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius bei geringer Strömung, um das Wachstum des Intra-Channel-Biofilms nach dem Wachstum über Nacht zu fördern. Pipettieren Sie alle Lösungen sowohl aus dem Einlass- als auch aus dem Auslassbehälter heraus. Geben Sie 100 Mikroliter PBS auf das Einlassreservoir und waschen Sie den Mikrokanal 20 Minuten lang.

Bei geringer Vorwärtsströmung vom Einlass zum Auslass ist der Biofilm nun bereit für die Lebendfärbung. Bereiten Sie kurz vor der Biofilmfärbung 100 Mikroliter der Viabilitätsfärbemischung vor, wie sie im Textprotokoll für jeden zu färbenden Kanal enthalten ist. Schützen Sie diese Lösung vor Lichteinwirkung, bis sie zum Färben des Biofilms benötigt wird, saugen Sie die gesamte verbleibende Flüssigkeit aus dem Einlass ab und füllen Sie denselben Behälter mit 100 Mikrolitern der Viabilitätsfärbemischung auf.

Schieben Sie dann die Färbelösung 45 Minuten lang durch den Mikrokanal. Bei niedrigem Scharfluss bei Raumtemperatur ist darauf zu achten, den Chip vor Lichteinwirkung zu schützen. Saugen Sie die restliche Flüssigkeit aus dem Einlassbehälter an und füllen Sie ihn mit 100 Mikrolitern PBS auf.

Waschen Sie den Mikrokanal 20 Minuten lang bei niedrigem Durchfluss bei Raumtemperatur, um überschüssige, ungebundene Farbstoffe zu entfernen. Der gefärbte Biofilm ist nun bereit für die Fluoreszenzmikroskopie, um die dreidimensionale Architektur der Biofilme zu untersuchen. Digitale Rekonstruktionen mittels horizontaler Scans mit einem konfokalen Mikroskop können verwendet werden, um die gesamte Filmstruktur aus jedem schrägen Winkel zu betrachten.

Darüber hinaus kann die Analyse der Lebendtotfärbung auf denselben Datensatz angewendet werden, um die räumliche Abhängigkeit der Zellviabilität innerhalb des Biofilms in Abhängigkeit von verschiedenen chemischen Behandlungen zu untersuchen. Sobald der Biofilm abgebildet wurde, können Zellen aus ungefärbten Kanälen extrahiert werden. Unter Verwendung von destilliertem Wasser, das bei hoher Scherströmung betrieben wird, kann die Biofilmflora dann durch 4 5 4 Pyrosequenzierung aus der genomischen DNA identifiziert werden.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie das Hinzufügen verschiedener Spezies oder Verbindungen, können durchgeführt werden, um verschiedene Fragen zu beantworten, z. B. was mit den Multispezies-Biofilmen unter verschiedenen Bedingungen passiert.