Verwendung eines Hochdurchsatz-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zusammensetzungstreu wiedergebende, mehrspezifische Biofilme des Zahnbelags zu erzeugen. Parallel zur Analyse wird dies erreicht, indem zunächst ein repräsentatives Medium und Inokulum hergestellt werden. Danach wird das Inokulum nach einer Übernachtkultivierung auf den Mikrofluidik-Chip aufgebracht, wodurch sich innerhalb des Mikrokanals ein Biofilm bildet.

Schließlich wird der Biofilm gewaschen und für die in-situ-Zweifach-Konfokalmikroskopie oder die Epi-Fluoreszenzmikroskopie angefärbt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Durchflusszellen besteht darin, dass es sich um ein Hochdurchsatzsystem handelt, das parallele Durchführung mehrerer Experimente ermöglicht, wobei weniger Material verbraucht wird und keine künstlichen Labormedien benötigt werden. Sammeln Sie zunächst Speichelproben von einer Kohorte von fünf oder mehr Freiwilligen in einzelnen 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Die Speichelproben in einen einzigen Kunststoffbecher, der auf Eis steht, aufziehen. Verwenden Sie zur Vermeidung von Ablagerungen biologischer Polymere aus Speichel keine Glasbecher. Geben Sie anschließend Dithiothreitol zur Probe hinzu, bis die Endkonzentration 2,5 Millimolar beträgt.

Rühren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf Eis. Überführen Sie den gesamten Inhalt in mehrere Plastikröhrchen. Führen Sie eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation für 30 Minuten in einer auf vier Grad Celsius gekühlten Zentrifuge durch, um Partikel von der Probe zu trennen.

Überführen Sie die Speichelprobe in einen frischen, sterilen Behälter und entsorgen Sie die Pellet-Fraktion, um ein bakterienfreies Wachstumsmedium aus der Probe herzustellen. Verdünnen Sie die tagfrische, partikelfreie Probe zunächst mit drei Volumina deionisiertem Wasser. Anschließend filtrieren Sie die Probe mit einem 0,22 µm Niedrigproteingrenzflächen-Membranfilter.

Die Speichelflüssigkeit sterilisieren, wobei die filtrierte Fraktion weiterhin auf Eis gehalten wird. Die sterilisierte Lösung abpipettieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis sie benötigt wird. Speichelproben von einer Kohorte von fünf oder mehr Freiwilligen in sterilen 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen sammeln.

Ziehen Sie die Speichelproben in einen bei Raumtemperatur vorsterilisierten Plastikbecher oder 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie sterilisiertes Glycerol hinzu, bis eine Mischung aus 25 % Glycerol und 75 % Speichel erreicht ist.

Im Gegensatz zum Wachstumsmedium-Protokoll, bei dem Kontaminationen durch einen Filtrationsschritt entfernt wurden, ist hier die aseptische Technik wichtig, um eine Kontamination durch nicht orale, spezifische Bakterien oder Pilze zu verhindern. Mischen Sie die Speichel-Glycerin-Lösung gut durch. Portionieren Sie die Speichel-Glycerin-Mischung in Aliquots und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Kaufen oder fertigen Sie einen mikrofluidischen Chip mit Mikrokanälen an, die den hier gezeigten ähneln, bevor Proben bei Raumtemperatur auf der Laborbank sowohl in das bakterienfreie Wachstumsmedium als auch in den bakterienhaltigen Inokulum in den Mikrochip gegeben werden. Vortexen Sie jedes Röhrchen fünf Sekunden lang, um es zu mischen, bevor Sie mit dem Hauptexperiment fortfahren. Geben Sie zunächst 100 µL des Wachstumsmediums in das Auslassreservoir des Mikrochips. Beginnen Sie mithilfe einer computerkontrollierten Pumpe mit der Durchströmung des Mediums durch den Mikrokanal für zwei Minuten.

Überprüfen Sie bei Raumtemperatur visuell jeden Kanal auf eine ordnungsgemäße Flüssigkeitsfüllung. Inkubieren Sie den Mikrochip bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Dadurch wird die Mikrokanalwand mit einem biopolymeren Gerüst beschichtet, an dem sich der Biofilm während des Wachstums verankern wird.

Danach manuell das verbleibende Medium aus dem Auslassreservoir absaugen und diese Fraktion in das Einlassreservoir überführen, wo sie nun als hydrodynamische Ausgleichsbelastung wirkt. Nach der Ablagerung des Biopolymer-Scaffolds 100 Mikroliter der bakteriellen Positivinokulation zum Auslassreservoir hinzufügen. Den Mikrochip auf eine 37 °C heiße Heizplatte stellen und einen mittleren Scherumkehrfluss einleiten.

Bewegen Sie die Flüssigkeit vom Auslass- zum Einlassreservoir genau sechs Sekunden lang. Schalten Sie dann die Pumpe aus und inkubieren Sie den Chip 40 Minuten lang unter statischen Bedingungen bei 37 Grad Celsius, um die Anheftung von Bakterien oder Pilzen an den Seitenwänden des Mikrokanals zu fördern. Entfernen Sie anschließend mit einer Pipette das gesamte Inokulum aus dem Auslassreservoir und verwerfen Sie es. Füllen Sie dasselbe Reservoir erneut auf, indem Sie ein Milliliter bakterienfreies Wachstumsmedium hinzufügen.

Die Mikrochip bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Stunden unter geringer Scherströmung inkubieren, um das Biofilmmuster innerhalb des Kanals während des Übernachtwachstums zu fördern. Alle Lösungen aus den Einlass- und Auslassreservoiren abpipettieren. 100 Mikroliter PBS im Einlassreservoir auftragen und den Mikrokanal 20 Minuten lang spülen.

Bei geringer Vorwärtsströmung von dem Einlass zum Auslass ist der Biofilm nun bereit für die Live-Dead-Färbung. Unmittelbar vor der Biofilmfärbung bereiten Sie pro zu färbendem Kanal 100 Mikroliter der in der Textanleitung beschriebenen Vitalitätsfärbelösung vor. Schützen Sie diese Lösung bis zum Zeitpunkt der Verwendung vor Lichteinfluss und saugen Sie zunächst die restliche Flüssigkeit aus dem Einlass ab, bevor Sie das gleiche Reservoir mit 100 Mikrolitern der Vitalitätsfärbelösung auffüllen.

Danach die Färbungslösung 45 Minuten lang durch den Mikrokanal leiten. Bei niedriger Fließgeschwindigkeit und Raumtemperatur sicherstellen, dass der Chip vor Lichteinfall geschützt ist. Die restliche Flüssigkeit aus dem Zulaufreservoir absaugen und dieses mit 100 Mikrolitern PBS auffüllen.

Spülen Sie den Mikrokanal 20 Minuten lang bei niedrigem Scherfluss und Raumtemperatur, um überschüssige, nicht gebundene Farbstoffe zu entfernen. Der angefärbte Biofilm ist nun bereit für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der dreidimensionalen Architektur des Biofilms. Mithilfe horizontaler Scans mit einem konfokalen Mikroskop können digitale Rekonstruktionen erstellt werden, um die gesamte Filmstruktur aus jedem beliebigen schrägen Winkel zu betrachten.

Außerdem kann die Live-Dead-Färbungsanalyse auf denselben Datensatz angewendet werden, um die räumliche Abhängigkeit der Zellviabilität innerhalb des Biofilms in Abhängigkeit von verschiedenen chemischen Behandlungen zu untersuchen. Nachdem der Biofilm abgebildet wurde, können Zellen aus ungefärbten Kanälen extrahiert werden. Mithilfe von destilliertem Wasser, das bei hohem Scherfluss eingesetzt wird, kann die Biofilmflora anschließend aus der genomischen DNA durch 454-Pyrosequenzierung identifiziert werden.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden, wie das Hinzufügen verschiedener Arten oder Verbindungen, angewendet werden, um unterschiedliche Fragen zu beantworten, beispielsweise was mit Multispezies-Biofilmen unter verschiedenen Bedingungen geschieht.