Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erzeugung von Makrophagen aus Urin und aus dem Knochenmark gewonnenen Zellkulturen. Dies wird zunächst durch die Entnahme des Knochenmarks aus den Hinterbeinen der Maus erreicht. Im zweiten Schritt werden die im Knochenmark residenten Makrophagen entnommen und anschließend die Knochenmarkzellen unter Makrophagendifferenzierungsbedingungen weiter kultiviert.

Wenn sich die Knochenmarkzellen dann zu Makrophagen differenziert haben, können sie für die experimentelle Analyse gesammelt werden. Letztendlich kann die konfokale Mikroskopie verwendet werden, um die Lokalisation von bakteriellem LPS in aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen und in sauren Kompartimenten zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Züchtung von Makrophagen, Zelllinien, besteht darin, dass eine große Anzahl von primären Makrophagen gewonnen werden kann.

visuelle Demonstration der Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Selbstproduktion schwer zu erlernen sind und Übung erfordern, und um Erfolg zu erzielen, desinfizieren Sie die Haut einer euthanasierten Maus mit 70%igem Ethanol. Machen Sie einen Schnitt an der Oberseite jedes Hinterbeins und ziehen Sie die Haut in Richtung Fuß, um den Muskel freizulegen. Schneiden Sie dann die Hinterbeine ab und verwenden Sie eine sterile Schere und Pinzette.

Um die Haut zu entfernen, legen Sie die Beine in eine sterile 35-Millimeter-Petrischale, die fünf Milliliter steriles Eis enthält. Kaltes PBS. Entfernen Sie alle Haut und Muskeln, die an den Knochen haften, und geben Sie die Knochen dann in eine neue sterile Petrischale, die fünf Milliliter Eis enthält.

Kaltes, steriles PBS. Waschen Sie die Knochen zweimal mit fünf weiteren Millilitern PBS und geben Sie sie dann in einen sterilen Mörser, der fünf Milliliter Eis enthält. Kaltes, steriles PBS.

Schneide nun das Schienbein am Gelenk vom Oberschenkelknochen ab und zertrümmere mit einem Stößel vorsichtig die Knochen. Den Überstand in eiskalten 15 Milliliter Röhrchen dreimal auffangen. Filtrieren Sie dann die Gewebesuspension durch ein 70-Mikron-Nylon-Zellsieb.

Um die festen Fragmente zu entfernen, schleudern Sie das Filtrat herunter und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Dissoziieren Sie das Pellet mit dem Lysepuffer der roten Blutkörperchen, fügen Sie nach 30 Sekunden 20 Milliliter eiskaltes vollständiges DMEM hinzu, um die Reaktion nach dem Zentrifugieren der Zellen zu stoppen, wir suspendieren das Pellet in 20 Millilitern mit 37 Grad Celsius, schließen DMEM ab und teilen dann die Zellsuspension auf zwei 100-Millimeter-Petrischalen auf. Inkubieren Sie die Schalen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und sammeln Sie dann die Überstände bei Raumtemperatur in 50-Milliliter-Röhrchen.

Nach dem Schleudern der Überstände wird das Pellet in 10 Millilitern vollständigem DMEM, ergänzt mit dem zuvor vorbereiteten L 9 29-Zellüberstand, wieder suspendiert und dann durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb filtriert. Das Filtrat wird in 140 Milliliter vollständiges DMEM- und L 9 29-Zellmedium gegeben, und dann werden 10 Milliliter der Zellsuspension pro Schale in 15 100-Millimeter-Petrischalen verteilt. Nach dreitägiger Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bei 10 Millilitern vollständigem DMEM plus L 9 29-Überstand und Inkubation der Zellen für weitere vier Tage.

Überwachung des Zellwachstums in regelmäßigen Abständen mit einem inversen Mikroskop, um die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen zu gewinnen, den Überstand zunächst zu aspirieren und zu verwerfen. Spülen Sie dann die Petrischalen zweimal mit vollständigem DMEM. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter 37 Grad Celsius vollständiges DMEM hinzu und lösen die Zellen mit einem Gummipolizisten vorsichtig ab, sammeln die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen in 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern dann die Zellen herunter.

Reanimation der Pellets in 20 Millilitern vollständigem DMEM. Zählen Sie abschließend die Zellen durch Triam-Blau-Ausschluss. Mit dieser Methode kann eine große Anzahl von Makrophagen in nur wenigen Tagen nach der Isolierung und Beschichtung der runden, nicht adhärenten Knochenmarkzellen abzüglich der im Knochenmark ansässigen Makrophagen, wie gerade gezeigt, gewonnen werden.

Diese repräsentativen BMDM-Vorläuferzellen wurden mit G-M-C-S-F inkubiert. Nach drei Tagen begannen die Zellen zu adhäsieren und sich zu Makrophagen zu differenzieren. Nach sieben Tagen wurde eine konfluente Monoschicht aus aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen beobachtet.

Die durchflusszytometrische Analyse von F, four 80 und H-L-A-D-R zeigte, dass die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen beide Marker exprimierten, was die Differenzierung der Knochenmarkzellen in Makrophagen bestätigt. Es sollten die sauren Fähigkeiten der aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen untersucht werden. Die Fähigkeit der Zellen, Latexgeschwindigkeiten zu internalisieren, wurde wie erwartet überwacht.

Es wurde bestimmt, dass die Anzahl der Kügelchen pro Zelle im Laufe der Zeit zunimmt, um ihr endozytäres Potenzial zu bewerten. Die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen wurden ebenfalls mit Coxiella kokultiviert. Es wurde beobachtet, dass das Burnett-Augen-LPS in Rot in einem Kompartiment lokalisiert ist, das das lysosomale assoziierte Membranprotein eins in blau, aber nicht Cathepsin D in grün beherbergt, was zeigt, dass das LPS in den späten Endosomen vorhanden war, die nicht in der Lage sind, mit Lysosomen zu fusionieren, wie es bei Makrophagen aus dem Knochenmark erwartet wird.

Die Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und deren Infektion wurden mit TMA Wiley Eye weiter analysiert. Wie erwartet waren die Bakterien in Rot nicht in dem Kompartiment lokalisiert, das KPS und D beherbergt, das wiederum in Grün erscheint. In diesem repräsentativen Immunoblot wurden aus dem Knochenmark stammende Makrophagen-Signaltransduktionswege untersucht, was zeigt, dass aus dem Knochenmark stammende Makrophagen wie Gewebe isolierte Makrophagen phosphorylierte P 38 alpha map kinase-Spiegel als Reaktion auf die Stimulation von esia coli LPS hochregulieren.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der zellulären Mikrobiologie zu beantworten, z. B. zu welchem intrazellulären Kompartiment mikrolokalisiert ist.