Name: Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Lernen Sie die metabolische Charakterisierung polarisierter M1- und M2-Knochenmark-Makrophagen mittels Echtzeit-Extrazellulärer Flussanalyse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Glykolyse und mitochondrialer Funktion in Immunzellen.

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Jan Van den Bossche erhielt ein Junior Postdoc Stipendium von der Netherlands Heart Foundation (2013T003) und ein VENI Stipendium von ZonMW (91615052). Menno de Winther ist Established Investigator der Netherlands Heart Foundation (2007T067), wird durch ein Stipendium der Netherlands Heart Foundation (2010B022) unterstützt und ist Inhaber eines AMC-Stipendiums. Wir danken auch der niederländischen kardiovaskulären Forschungsinitiative, der niederländischen Föderation der Universitätskliniken, der niederländischen Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung und der Königlich Niederländischen Akademie der Wissenschaften für das GENIUS-Projekt "Generierung der besten evidenzbasierten pharmazeutischen Ziele für Atherosklerose" (CVON2011-19). Wir danken Seahorse Bioscience dafür, dass sie Open-Access-Publikationen möglich gemacht haben. Die Autoren danken Riekelt Houtkooper und Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, Niederlande) für ihre bisherige Unterstützung beim Seahorse-Analysegerät.

1. Anzucht und Polarisationsknochenmark-Makrophagen <ol><li> Tag 0: Isolieren Oberschenkel und Schienbein Knochen 6-10 Wochen alten Mäusen von Interesse (C57BL / 6 in diesem Test). </li><li> Entfernen Muskelgewebe aus den Knochen und legen Sie die Knochen in einer 9 cm Petrischale mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in eine 9 cm Petrischale mit 70% Ethanol gefüllt und schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden. </li><li> Übertragen Sie die Knochen in eine frische 9 cm Petrischale mit eiskaltem sterilem PBS gefüllt. </li><li> Schneiden Sie die Oberschenkel und Schienbein an beiden Enden mit einer sterilen Schere. </li><li> Spülen Sie die Knochen mit 10 ml eiskaltem sterilem PBS mit einem 10-ml-Spritze und einer 25 G-Nadel. Sammeln Sie das Knochenmark in einem 50-ml-Tube. </li><li> Übertragen Sie die Knochenmarkszellen zu einem neuen 50-ml-Röhrchen mit einer 23 G-Nadel. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer 25 G-Nadel. Anmerkung: Diese Schritte sind erforderlich, um Zellklumpen und Knochenreste zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Entsorgen Sie die supernatant und Resuspendieren der Zellen in 40 ml Zellkulturmedium (RPMI-1640 plus 2 mM L-Glutamin, 10% FCS, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml) und 15% filtriert L-929-Zellen ( ATCC, CCL-1) -conditioned Medium anstelle enthaltenden M-CSF (oder alternativ 10 ng / ml rekombinantem M-CSF von L-929-Zellen konditionierten Medium). Hinweis: Die Erzeugung von L-929-Zellen konditionierten Medium wurde zuvor in dieser Zeitschrift im Jahr 2013 11 detaillierte </li><li> Kultur die Zellen von einer Maus in zwei 15 cm Petrischalen (keine Zellkultur-behandelten Platten, da Makrophagen nicht aus diesem Kunststoff lösen) in 20 ml Kulturmedium pro Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator. </li><li> 10 ml frisches Zellkulturmedium an Tag 3, ohne Entfernen der 20 ml älteren Zellkulturmedium. </li><li> Ersetzen Sie die alte mittel jeder Platte mit 20 ml frischem Kulturmedium an Tag 6. Auf diese Weise wird nicht haftenden Zellen entfernt werden. </li><li> Tag 8: <ol><li> Trennen Sie die Zellen durch Inkubation 5 min bei 37 ° C in 10 ml einer Citratsalzlösung (135 mM Kaliumchlorid plus 15 mM Natriumcitrat in H 2 O, autoklaviert) und wasche mit 10 ml PBS. Graf reifen Knochenmark-Makrophagen (BMDM) am Tag 8 mit Hilfe eines Zellzählers. </li><li> Stellen Sie sicher, die Bildung von reifen (CD11b + F4 / 80 +) BMDM durch visuelle Inspektion oder durch Durchflusszytometrie. Block 10 5 Zellen, die mit anti-CD16 1/100 / CD32 in PBS für 20 min in 100 ul PBS, inkubiert mit 1/200 Anti CD11b-FITC und 1/200 Anti-F4 / 80-APC-Cy7 bei RT Wasch und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Hinweis:. Das Kultivieren der Maus Knochenmark-Makrophagen im Detail weiter oben in dieser Zeitschrift, die von Ying et al 11 erschienen. </li></ol></li><li> Samen 50.000 Zellen (optimale Zellzahlen optimiert werden müssen) pro Vertiefung in einer Zellkulturmikroplatte in 100 &amp; mgr; l Kulturmedium. Saatgut nicht Zellen in Untergrundkorrektur Brunnen (A1, A12, H1, H12) und legte nur Medium (keine Zellen) in diesen Brunnen. Tipp: Halten Sie die Pipette in einem Winkel aKampf auf halber Höhe der Seite der Vertiefungen für die meisten homogenen Zellschicht. </li><li> Lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur in einer Zellkultur Haube für 1 Stunde zu begleichen. Dies wird auch zu fördern Zellverteilung und Randeffekte zu reduzieren. Überwachen Anhaften unter Verwendung eines Mikroskops und Kultur in ein 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Drei Stunden nach dem Plattieren stimulieren Zellen für 24 h mit 10 ng / ml LPS, oder 20 ng / ml rekombinantes Maus-IL-4 an M1 oder M2 Makrophagen erzeugen sind. Schließen unbehandelte naiv (M0) Makrophagen als Kontrolle. Beurteilen richtigen M1 und M2 Makrophagen Polarisation durch Messen LPS-induzierte Sekretion von IL-6, IL-12, TNF (ELISA) und IL-4-induzierte Arginase-1-Aktivität und / oder MMR (CD206) und MGL (CD301) Oberflächenexpression (Durchflusszytometrie), wie zuvor beschrieben, 3,11. Anmerkung: An diesem Punkt können die Zellen (vor) sein -behandelten pharmakologische Verbindungen von Interesse oder Makrophagen können mit anderen Faktoren stimuliert werden. Da könnte die Variation zwischen getrennten Vertiefungen subs seintantial, ist es ratsam, mindestens 4 und idealerweise 6 Vertiefungen pro Bedingung verwenden. </li></ol> 2. Herstellung der extrazellulären Flux Assay <ol><li> Hydrat der Sensorkartusche einen Tag vor der Durchführung des Assays: <ol><li> Legen Sie die Sensorkassette auf den Kopf neben der Versorgungsplatte. </li><li> Füllen jeder Vertiefung der Versorgungsplatte mit 200 ul Kalibrierlösung und senken Sie die Sensorkartusche auf die Versorgungsplatte Eintauchen der Sensoren in der Kalibrierlösung. </li><li> Stellen Sie sicher, das Kalibrierungslösung hoch genug ist, um die Sensoren eingetaucht und in eine nicht-CO 2 Inkubator bei 37ºC O / N zu halten. </li></ol></li><li> Vorbereitung Assaymedium am Tag des Assays wie folgt: <ol><li> Warm 50 ml XF Basismedium auf 37 ° C. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l 200 mM L-Glutamin, eine 2 mM Endkonzentration zu erhalten. </li><li> Einstellen des pH auf 7,4 mit 1 N NaOH und Sterilisieren mit einem 0,2 um Filter und halten das Assay-Medium bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium von den polarisierten Makrophagen und speichern Sie sie bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung (zB ELISA, um die ordnungsgemäße Makrophagenpolarisation zu untersuchen). Die Zellen mit 100 &amp; mgr; l Assay-Medium zu waschen, fügen Sie 180 ul Assay-Medium pro Vertiefung und unter dem Mikroskop die Zellen wurden nicht abgewaschen zu überprüfen. Setzen Sie den Zellkulturplatte in einem 37 ° C Inkubator ohne CO 2 für 1 h vor dem Testlauf. </li><li> Bereiten Sie 10 x Injektionsmischungen A bis D wie in Tabelle 1 auf 37 ° C beschrieben, warm, den pH-Wert auf 7,4 und Filter zu sterilisieren. <ol><li> Stellen alle Verbindungen, die in diesen Gemischen bei 10-facher Endkonzentration in der Zellkulturvertiefungen und diese Konzentrationen zu optimieren für jeden Zelltyp. </li></ol></li><li> Laden Sie die Sensorkartusche mit den mitgelieferten Ladeführungen mit angegebenen Volumen (Tabelle 1) der vorbereiteten 10x Spritzmischungen in Anschlüsse A, B, C und D, welche nach Süctively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Gemisch / Einspritzung </td><td> Verbindungen </td><td> Volume hinzugefügt zu 10x Mischung (ul) zu erhalten </td><td> Volume Assay-Medium (ml) </td><td> Volume während der Lauf injiziert (ul) </td><td> Endkonzentration im Test </td></tr><tr><td> EIN </td><td> 2,5 M (45%) Glucose </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> B </td><td> 5 mM Oligomycin A (OM) </td><td> 9 </td><td> 3.0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td> C </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM Natriumpyruvat-Lösung </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 mM Antimycin A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3.0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 &amp; mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM Rotenon (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1,25 &amp; mgr; M </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Injection Mischungen. 3. Bioenergetische Charakterisierung polarisierte M1 und M2 BMDM mit einem extrazellulären Flux Analyzer <ol><li> Erstellen Sie einen Test-Vorlage mit der Assay-Assistent mit 2 Minuten und MIX 3 Minuten MEASURE Zeiten und (mindestens) 3-Mix und Geschwindigkeitsmessungen Schleifen vor jedem der 4 Injektionen (Tabelle 1) und nach der letzten Injektion. Anmerkung: Diese Konzentrationen gelten für Knochenmark stammenden Makrophagen und Raw264.7 Makrophagenzellinien, sollte aber für jeden Zelltyp optimiert werden. Zugabe Pyruvat in FCCP Mischung benötigt wird, um eine maximale Atmungs Kraftstoff. </li><li> Starten Sie den Lauf durch Drücken der Start unten und folgen Sie den Anweisungen des Gerätes. Ersten Last das AutoRidge Platte mit den hydratisierten Sonden, um die Kalibrierung von Vorrichtungen und nächste Ladung der Zellplatte zu ermöglichen. </li><li> Nach der Verwendung sorgfältig verwerfen alle Assaymedium und Speichern der analysierten Zellkulturmikro bei -20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung unter Verwendung der Zell-Proliferation-Assay-Kit, wie im einzelnen durch den Hersteller beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, bereiten eine 1x Zell-Lyse-Puffer durch Verdünnen Komponente B 20-fach in destilliertem Wasser und verdünnte Verbindung A 400-fach in der 1x Zell-Lyse-Puffer. Fügen Sie 200 ul pro Vertiefung inkubieren 5 min bei RT und messen Fluoreszenz mit ~ 180 nm Anregung und ~ 520 nm Emissionsmaxima. Hinweis: Bei der Arbeit mit nicht-haftenden Zellen oder wenn schlechte Haftung ist ein Anliegen, das direkte Zellproliferation Kit kann als Alternative verwendet werden, da dieses Protokoll nicht löschen dabei alle Testmedium erfordert. Doch dies ist direkte Protokoll etwas weniger empfindlich gegenüber der in dieser Übung verwendete Protokoll. </li></ol></li><li> Nach Fluoreszenzmessung, zu normalisierendie Zellzahl in jeder Vertiefung als ein Verhältnis, in welchem ​​die durchschnittliche Zellzahl aller naiven Makrophagen Vertiefungen auf 1 gesetzt wird. Achtung: Die Proteinquantifizierung (zB unter Verwendung eines BCA-Assay) könnte als eine Alternative, um Zellen zählt Normalisierung verwendet werden. Doch in unseren Händen dieser Test war weniger empfindlich gegenüber dem Zellproliferationsassay-Kit. </li></ol>

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</ol>

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Das Ziel unserer Labor ist zu verstehen, wie Makrophagen-Polarisation und Funktion kann mit dem Ziel, den Ausgang von Arteriosklerose und anderen Entzündungskrankheiten 12 verbessern beeinflusst werden. Makrophagen Polarisation bewerten, misst man typischerweise die LPS (+ IFN &amp; ggr;) induzierte IL-4-induzierte Genexpression von M1 und M2 Markergene (qPCR), bestimmt IL-6, IL-12, TNF und NO-Sekretion (durch ELISA und Griess-Reaktion) und untersucht, IL-4-induzierte CD71, CD206, CD273 und CD301 Oberflächenexpression (durch Durchflusszytometrie) und Arginaseaktivität 3,13. Zusätzlich kann die Apoptose-Assays (von Annexin-V / PI-Färbung), Phagozytose Assays (mit fluoreszierenden Latexkügelchen und / oder pHrodo E. coli) und Schaumzellbildung Assays (von Dil-oxLDL-Aufnahme, LipidTOX neutralen Lipid-Färbung) durchgeführt werden soll evaluieren Makrophagen-Funktionalität 14. Zusätzlich kann die extrazelluläre Flussanalyse durchgeführt, um zu messen, Bioenergetik Profile der polarisierten mac werdenrophages als eine neue und alternative Funktionsanzeige. Dieses Manuskript zeigt, dass Makrophagen-Polarisation induziert Stoffwechsel Umprogrammierung mit LPS-induzierte Makrophagen Umstellung auf erhöhte Glykolyse als Energiequelle. Umgekehrt, IL-4-induzierte Makrophagen M2 verwenden mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung als die Hauptquelle von ATP. Wichtiger ist, metabolische Anpassung bietet nicht nur Energie für die besonderen Anforderungen von M1 und M2 polarisierten Makrophagen. In der Tat, metabolische Veränderungen beeinflussen Metabolitenkonzentrationen, die direkte Aufsichtsbehörden des Makrophagen-Phänotyp 10,15,16 sind. Daher ist Makrophagen-Stoffwechsel nicht nur ein Merkmal, sondern auch einen Fahrer deutliche Makrophagen Polarisationszustände (wie hier in 2 gezeigt), und dieses neue Wissen unterstützt das schnelle Wachstum des immunometabolism Forschungsbereich während der letzten paar Jahre. Allerdings robuste Messungen von Stoffwechselprofilen in MakroPhagen blieb schwierig und hatte ihre Grenzen. In dieser Studie wird ein extrazelluläres Fluss-Analysator angewendet, um robust zu messen Glykolyse Glykolyse-Schutzgebiet, maximal glykolytischen Kapazität, nicht glykolytischen Versauerung, basale und maximale Atmung, die ATP-Produktion, Ersatzatemkapazität, Protonenleck und nicht-mitochondriale Atmung in Echtzeit in einer minimalen Menge an Makrophagen. Daher modifiziert und verbessert den Protokollen des Herstellers wie folgt wir. Die Standard Mito Stress Test (# 103015-100) schlägt mit Medium mit Glukose und Pyruvat und ein Protokoll mit 3 Injektionen (OM, FCCP, AA / Rot). Wir entscheiden uns, den Test mit Glucose / Pyruvat-freiem Medium zu starten, fügen Glucose als erste Injektion im Anschluss A (wie in der Glykolyse Stress Test # 103020-100) und fügen Pyruvat zusammen mit dem FCCP Entkoppler in Port C. Auf diese Weise alle relevanten Glykolyse Parameter aus den ECAR Messungen 1-9 und allen relevanten Informationen über mitochondri abgeleitetal-Funktion von OCR-Messungen 4-15. Man beachte, dass es kritisch ist, Pyruvat zusammen mit FCCP injizieren, um eine maximale Atmungs beim Entkuppeln Kraftstoff. Vor der Verwendung dieses kombinierte Protokoll sollte man auch sicherstellen, dass 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) senkt ECAR Ebenen nach dem Test zur Bestimmung der basalen Werte (1-3), und dass die aufgezeichneten ECAR Raten 4-6 sind in der Tat aufgrund Glykolyse. Zusätzlich sollte man verstehen, dass die Konzentrationen der Verbindung, und die Zellzahlen in diesem Manuskript verwendet gelten für Knochenmark stammenden Makrophagen und Raw264.7 Makrophagenzellinien und sollte für andere Zelltypen optimiert werden. Außerdem sollte man beachten, dass M-CSF, der verwendet wird, um Knochenmark stammenden Makrophagen erzeugen fördert eine M2 artige entzündungshemmende Phänotyp. Die vorgestellten Ergebnisse aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen kann daher nicht ohne weiteres vergleichbar, Messungen mit primärem Gewebe Makrophagen oder Makrophagen-Zelllinien, die M-CSF während der Zell culturi erfordern seinng. Im Vergleich zu bestehenden Methoden, dieses Protokoll erfordert nur minimale Mengen von Makrophagen und schnell liefert praktisch alle grundlegenden metabolischen Zelleigenschaften. Dies führt zu genügend überschüssige Zellen auf andere immunologische Tests und sogar die für Bioenergetik Profilierung verwendeten Zellen könnte noch für andere nach dem Test vorgesetzt werden durchzuführen. Außerdem ermöglicht die besondere 96-Well-Plattenformat Beurteilung mehrerer Bedingungen in Echtzeit gleichzeitig. Trotzdem kann die Variation zwischen den einzelnen Vertiefungen erheblich und daher die Verwendung von mindestens 4 Vertiefungen pro Zustand wird oft gewünscht. Taken diese Einschränkung berücksichtigen, können immer noch die beschriebenen extrazellulären Flussanalyse, um mehr als 10 Versuchsbedingungen ausgeführt (n = 6) auf einmal, die viel mehr als traditionelle Techniken ist. Insgesamt bietet dieser Artikel eine einfache und reproduzierbare Funktionstest, die Messung aller relevanten Glykolyse und mitochondriale param erlaubtmeter in polarisiert Makrophagen-Teilmengen. Diese Technik kann als eine zukünftige Anwendung auf Makrophagenfunktion zu beurteilen und die Auswirkungen der verschiedenen Manipulationen (zB Gen-knock down, neue Arzneimittel, etc.) auf (metabolische) Phänotyp der Makrophagen zu bewerten dienen. Als solche kann die extrazelluläre Durchflussdaten in Verbindung mit anderen Tests verwendet werden, um eingehende Charakterisierung des Makrophagenaktivierungszustand zu erlauben.

Während Makrophagen spielen eine zentrale Rolle in nahezu allen Krankheiten, sind die molekularen Mechanismen, die ihren Phänotyp zu regeln noch immer nicht vollständig entwirrt. Makrophagen zeigen hohe Heterogenität und in Reaktion auf die Mikroumgebung annehmen unterschiedlichen Phänotypen 1. LPS (+ IFN &amp; ggr;) induzierte klassisch aktiviert M1 oder M (LPS) Makrophagen fördern Entzündung und zum Schutz des Wirtes gegen verschiedene Arten von mikrobiellen Bedrohungen 2. Andere nutzen IFNy alleine oder in Kombination mit TNF als Reize zu M1 Polarisierung hervorzurufen. IL-4 und / oder IL-13 induziert alternative Aktivierung von Makrophagen und diese M2 oder M (IL-4) -Zellen sind potente Suppressoren und Steuerungen der laufenden Immunreaktionen 3. Polarisierten Makrophagen zeigen eine deutliche Regulation des Zellstoffwechsels mit LPS-aktivierte Makrophagen M1 sich in einem Stoffwechselschalter, um eine verbesserte Glykolyse 4-6. Umgekehrt verbessert Fettsäureoxidation (FAO) und der mitochondrialen oxidative-Phosphorylierung (OXPHOS) bietet lang anhaltende Energie in IL-4-induzierte M2 Makrophagen 7-9. Somit verändert Stoffwechsel nicht nur eine Eigenschaft von Makrophagen polarisierte Teilmengen, es ist auch eine Voraussetzung für die richtige Polarisierung und Entzündungsregelung. Wichtig ist, dass die Inhibierung der Glykolyse oder OXPHOS / FAO wurde gezeigt, M1 oder M2 Aktivierung jeweils 8,10 beeinträchtigen. Als solches könnte die Identifizierung metabolische Veränderungen in Makrophagen als ein Werkzeug, um den Polarisationszustand und Entzündungspotential abgewogen werden. Eine konsequente Assay, der Makrophagen-Stoffwechsel Maßnahmen könnte daher verwendet werden, um vorherzusagen, ob ein Medikament, Gen-knock down oder einer anderen Behandlung wirkt Makrophagenpolarisation und Funktion. In diesem Video wird ein extrazelluläres Fluss-Analysator verwendet, um die Bioenergetik Profilen von naive, M1 und M2 Makrophagen zu charakterisieren. Dieses Manuskript Details ein optimiertes Protokoll, das die Messung erlaubtaller relevanten Parameter der Glykolyse (Glykolyse, maximal Glykolyse und glykolytischen Reserve) und die Funktion der Mitochondrien Eigenschaften (Gesamtatmung, basale mitochondriale Atmung, die ATP-Produktion, Protonenleck, maximal Atmung und Ersatzatemkapazität) in einem einzigen Assay. Mit diesem Versuchsaufbau kann Bioenergetik zwischen Kontrolle und &#39;verändert&#39; verglichen werden (zB Gen-knock down, transgene Überexpression oder pharmakologische Behandlung) Zellen.

<table><tbody><tr><td>23G und 25G Nadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>#300800 und #300600</td><td>Zu gespültem Knochenmark</td></tr><tr><td>10 ml Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>#307736</td><td>Zu gespültem Knochenmark</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Greiner</td><td>#639161</td><td>Zur Kultivierung von Knochenmarkzellen</td></tr><tr><td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit&nbsp;</td><td>Molekulare Sonden</td><td>#C7026</td><td>Für die Zellquantifizierung zu einem späteren Zeitpunkt (funktioniert nur für adhärente Zellen)</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Kit&nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>#35011</td><td>Für die Zellquantifizierung unmittelbar nach dem Assay (nicht adhärente Zellen)</td></tr><tr><td>XFe96 Zellkultur-Mikroplatte</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#101085-004</td><td>96-Well-Platte, in der Zellen kultiviert werden und in der der Assay durchgeführt wird</td></tr><tr><td>rekombinantes Maus-Interleukin-4 (IL-4)</td><td>Peprotech</td><td>#214-14-B</td><td>Wird zur Induktion alternativer Makrophagenaktivierung</td></tr> <tr><td>verwendetLipopolysaccharid (LPS)</td><td>Sigma</td><td>#L2637</td><td>Pro-inflammatorischer Stimulus</td></tr><tr><td>Seepferdchen-Sensor-Kartusche&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102416-100</td><td>Enthält die Sonden für die pH- und O2-Messung</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#100840-000</td><td>Erforderlich, um die Sonden über Nacht zu hydratisieren&nbsp;</td></tr><tr><td>XF Basis Medium&nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>#102353-100</td><td>Pufferfreies Medium, das eine effiziente Messung von pH-Änderungen ermöglicht</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>#G8769</td><td>Treibt die Glykolyse an, sobald es den Zellen zugesetzt</td></tr> wird <tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma</td><td>#75351</td><td>Hemmt die mitochondriale ATP-Synthase</td></tr><tr><td>FCCP( Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)Phenylhydrazon)</td><td>Sigma</td><td>#C2920</td><td>Entkoppelt die mitochondriale Atmung</td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvatlösung</td><td>Lonza</td><td>#BE13-115E</td><td>Ermöglicht eine maximale mitochondriale Atmung ohne Glykolyse</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674</td><td>Hemmt den Komplex III der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>#BE13-115EA8674R8875</td><td>Hemmt den Komplex I der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Casy Cell Counter</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#05 651 697 001</td><td>Instrument zur Zellzählung</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>eBioscience</td><td>#14-0161 Fc-Rezeptor-Block-Durchflusszytometrie</td><td></td></tr><tr><td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>#47-4801</td><td>Antikörper zur Färbung von Makrophagen</td></tr><tr><td>anti-CD11b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>#11-0112</td><td>Antikörper zur Färbung von Makrophagen</td></tr></tbody></table>

metabolische charakterisierung polarized m1 und m2-knochenmark-makrophagen über die echtzeit-extrazelluläre flußanalyse

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Spezifische Stoffwechselwege werden zunehmend als kritische Kennzeichen von Makrophagen-Untergruppen erkannt. Während LPS-induzierte klassisch aktivierte M1- oder M(LPS)-Makrophagen entzündungsfördernd sind, induziert IL-4 eine alternative Makrophagenaktivierung und diese sogenannten M2 oder M(IL-4) unterstützen die Auflösung von Entzündungen und die Wundheilung. Neuere Erkenntnisse zeigen die entscheidende Rolle der metabolischen Reprogrammierung bei der Regulation der Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. 
In diesem Manuskript wird ein extrazellulärer Flussanalysator angewendet, um die metabolischen Eigenschaften von naiven, M1- und M2-polarisierten Maus-Knochenmark-Makrophagen zu bewerten. Dieses Instrument verwendet pH- und Sauerstoffsensoren, um die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) zu messen, die mit dem glykolytischen und mitochondrialen oxidativen Stoffwechsel in Verbindung gebracht werden können. Auf diese Weise können sowohl die Glykolyse als auch der mitochondriale oxidative Stoffwechsel in Echtzeit in einem einzigen Assay gemessen werden.
Mit dieser Technik zeigen wir hier, dass inflammatorische M1-Makrophagen einen verstärkten glykolytischen Stoffwechsel und eine reduzierte mitochondriale Aktivität aufweisen. Umgekehrt weisen antiinflammatorische M2-Makrophagen eine hohe mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) auf und zeichnen sich durch eine erhöhte freie Atmungskapazität (SRC) aus. 
Der vorgestellte funktionelle Assay dient als Rahmen, um zu untersuchen, wie bestimmte Zytokine, pharmakologische Verbindungen, Gen-Knockouts oder andere Eingriffe den metabolischen Phänotyp und den Entzündungsstatus des Makrophagen beeinflussen.

Nach Beendigung der extrazellulären Flusstest und Zellquantifizierung, können Daten für Zellzahl normiert und analysiert werden. Dies wird typischerweise ergeben ECAR und OCR-Plots, wie in 1A und 1B gezeigt. Nach der Injektion von Glucose (A), die Erhöhung der ECAR repräsentiert die Glykolyse Rate. Die zusätzliche Erhöhung ECAR nach ATP-Synthase-Hemmung mit Oligomycin (B) gibt Auskunft über die Glykolyse-Rücklage und Kapazität (Abbildung 1A). Bei der Analyse der OCR Werte oligomycin Einspritzung (B) ermöglicht die Berechnung der Sauerstoffverbrauch für mitochondriale ATP-Synthese eingesetzt. FCCP (C) entkoppelt die mitochondriale Atmung und die entsprechenden OCR Messungen ergeben Daten über die maximale und Ersatzatemkapazität. Schließlich Injektion von Rotenon (Rot) und Antimycin A (AA) zu blockieren mitochondrialer Komplex I und III und die Rest OCR steht für die nicht-mitochondriale Sauerstoff Nachteileumption (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Abbildung 1: aus einer XF Extracellular Flux Assays abgeleiteten metabolischen Parameter. (A) Die folgenden Parameter der zellulären Glykolyse von den ECAR Werten berechnet (in mph / min): Glykolyse, maximal glykolytischen Kapazität und glykolytischen Reserve. (B) OCR-Messungen (in pMol / min) werden verwendet, um die folgenden grundlegenden Parameter der Mitochondrienfunktion berechnen: Basalatmung, ATP-Produktion, Protonenleck, maximale Atmungs und Ersatzatemkapazität. Gluc = Glucose; OM = Oligomycin A; FCCP = Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) phenylhydrazon; AA = Antimycin A; Rot = Rotenon <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Nach dem Lauf ECAR und OCR-Messungen 1 till 15 für jede Vertiefung kann nach Excel exportiert werden und von den ECAR Messungen die folgenden glykolytische Parameter können wie folgt berechnet werden: Nicht glykolytischen Versauerung = durchschnittl. ECAR (1,2,3) Glykolyse = durchschnittl. ECAR (4,5,6) - durchschnittl. ECAR (1,2,3) Maximale glykolytischen Kapazität = durchschnittl. ECAR (7,8,9) - durchschnittl. ECAR (1,2,3) Glykolytischen Reserve = durchschnittl. ECAR (7,8,9) - durchschnittl. ECAR (4,5,6) Von den OCR Raten kann die nächste metabolischen Eigenschaften ermittelt werden: Non-mitochondriale Atmung = durchschnittl. OCR (13,14,15) Basalatmung = durchschnittl. OCR (4,5,6) - durchschnittl. OCR (13,14,15) ATP-Produktion = durchschnittl. OCR (4,5,6) - durchschnittl. OCR (7,8,9) Protonenleck =durchschnittl. OCR (7,8,9) - durchschnittl. OCR (13,14,15) Maximale Atmungs = durchschnittl. OCR (10,11,12) - durchschnittl. OCR (13,14,15) Ersatzatemkapazität (SRC) = durchschnittl. OCR (10,11,12) - durchschnittl. OCR (4,5,6) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Fig. 2: metabolischen Eigenschaften von naiven (M0), LPS (M1) und IL-4 (M2) polarisiert Makrophagen Für jede Messung der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) von 8 einzelnen Vertiefungen dargestellt. (A) Die extrazelluläre Ansäuerung Raten (ECAR, in mph / min) und (B) Sauerstoffverbrauchsraten (OCR, in pMol / min) sind differentiell polarisiert (M1 und M2) und naiv Makrophagen (M0) gemessen. Alle Messungen wurden für die Zellzahl normalisiert (wie bei CyQUANT gemessen) und der durchschnittliche Zellzahl der naiven Makrophagen wurde auf 1 gesetzt InProjektions A = Glucose; B = Oligomycin; C = FCCP; D = Antimycin A + Rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Wie in 2A gezeigt ist, induziert die Aktivierung von Makrophagen mit LPS erhöht glykolytischen Metabolismus. Die Unterschiede zwischen LPS und IL-4-behandelten Makrophagen sind noch deutlicher, wenn man Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) in 2B. Tat, während die maximale oxidativen Metabolismus ist sehr in M (LPS) unterdrückt, IL-4 induziert die basale und insbesondere maximal Atmung M2 Makrophagen. Man sollte beachten, dass eine erhöhte glykolytische ist ziemlich einzigartig zu M (LPS) Makrophagen und ist nicht notwendigerweise ein Merkmal M1 Makrophagen, da M (IFNy) Makrophagen nicht angezeigt verbessern Glykolyse. Insgesamt zeigt dieses extrazellulären Flussanalyse that IL-4-induzierte M2 Makrophagen werden durch verbesserte oxidativen Stoffwechsel gekennzeichnet und vor allem eine hohe Ersatzatemkapazität (SRC), während LPS-aktivierten Makrophagen-Display verbessert glykolytischen Stoffwechsel und keine Ersatzatemkapazität besitzen.

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Das übergeordnete Ziel dieser extrazellulären Flussanalyse besteht darin, die metabolischen Eigenschaften von naiven M1- und M2-polarisierten, aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen zu bewerten. Diese Methode kann als Grundlage dienen, um zu untersuchen, wie bestimmte Zytokine, Verbindungen oder Gen-Konstrukte den metabolischen Phänotyp von Makrophagen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie nur eine geringe Anzahl an Makrophagen erfordert.Außerdem werden alle relevanten Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in einem einzigen Test gemessen. Obwohl diese Methode Einblicke in das metabolische Phänotyp von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen ermöglicht, kann sie ebenso auf alle Arten von Makrophagen oder Immunzellen angewendet werden. Wir kamen auf die Idee, diese Methode in J zu veröffentlichen, da wir häufig Anfragen von anderen Wissenschaftlern erhalten, um ihnen bei ihren metabolischen Zellfluss-Assays zu helfen. Am achten Tag der Kultur überprüfen Sie durch visuelle Inspektion das Vorhandensein ausgereifter Makrophagen und inkubieren die reifen, aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen in 10 Milliliter Citrat-Pufferlösung für fünf Minuten.37 Grad Celsius, sobald sich die Zellen gelöst haben. Spülen Sie die Kultur mit 10 Milliliter PBS und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Dann säen Sie fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Vertiefung aus.In einer XFE 96-Zellkultur-Mikroplatte mit je 100 µL Kulturmedium pro Vertiefung, wobei die Pipette schräg etwa auf halber Höhe an der Seitenwand jeder Vertiefung gehalten wird. Um die Zellen abzugeben, fügen Sie ausschließlich Medium in die Hintergrundkorrektur-Vertiefungen A1, A12, H1 und H12 hinzu. Anschließend lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Zellkulturbank ruhen.Nach Bestätigung der Anheftung der Kultur werden die Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Drei Stunden nach der Aussaat stimulieren Sie entsprechend vier bis sechs Vertiefungen pro Bedingung für 24 Stunden. Um die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen am Tag vor dem extrazellulären Fluss-Assay zu polarisieren, stellen Sie die Sensorpatrone verkehrt herum neben die Hilfsplatte und füllen jedes Plattenloch mit 200 Mikroliter Crin-Lösung.Danach den Sensorcartridge vorsichtig auf die Nutzplatte setzen, um die Sensoren in die Cain-Lösung einzutauchen, und überprüfen, ob der Flüssigkeitsstand der Cain-Lösung ausreicht, um die Sensoren vollständig untergetaucht zu halten. Anschließend den Cartridge über Nacht in einen inkubator ohne Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius stellen. Am nächsten Tag das Überstandmedium vorsichtig von den polarisierten Makrophagen entfernen und die Zellen mit 100 Mikroliter frisch zubereiteter Assay-Lösung waschen.Medium pro Mulde. Geben Sie 180 Mikroliter Assay-Medium in jede Mulde und überprüfen Sie mithilfe des Mikroskops, ob die Zellen nicht abgespült wurden. Wenn die Zellen noch angeheftet sind, stellen Sie die Platte eine Stunde vor Beginn des Assays in den 37-Grad-Celsius-Brutschrank ohne Kohlendioxid, während die Zellen inkubieren.Bereiten Sie 10 x Injektionsverbindungsmischungen gemäß der Angabe in der Tabelle vor und erwärmen Sie die Mischungen auf 37 Grad Celsius. Laden Sie dann die Sensorpatrone mit den entsprechenden Volumina der Verbindung und den Anschlüssen A, B, C und D unter Verwendung der beigefügten Ladeanleitungen, um die Bioenergie der polarisierten Makrophagen mittels extrazellulärem Fluss-Assay zu charakterisieren. Verwenden Sie den Assistenten, um eine Assay-Vorlage mit zwei Minuten Mischzeit und drei Minuten Messzeit sowie mindestens drei Misch- und Messzyklen vor jeder der vier Injektionen und nach der letzten Injektion zu erstellen.Starten Sie anschließend den Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Geräts. Laden Sie die Kartuschenplatte mit den hydratisierten Sonden, um die Kalibrierung durch das Gerät und die Zellplatte zu ermöglichen. Entsorgen Sie am Ende des Assays, wie angegeben, vorsichtig das gesamte Assay-Medium und lagern Sie die analysierte Zellkultur-Mikroplatte bei minus 20 Grad Celsius, bis die Normalisierung erfolgt.Um die Zellen mit dem Zellproliferations-Assay-Kit zu normalisieren, tauen Sie die Platte auf und inkubieren die Zellen pro Vertiefung mit 200 Mikroliter frisch zubereiteter Zelllysepufferlösung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Messen Sie abschließend die Fluoreszenz mit einer Anregung bei etwa 480 Nanometern und einem Emissionsmaximum bei etwa 520 Nanometern. Verwenden Sie die erfassten Fluoreszenzmesswerte, um das Verhältnis zu berechnen, bei dem die durchschnittliche Zellanzahl aller Vertiefungen mit naiven Makrophagen auf eins gesetzt wird, und exportieren Sie diese Verhältnisse anschließend in die Seahorse-Wave-Analyse-Software.Um die Daten zu normalisieren, liefert ein extrazellulärer Fluss-Assay typischerweise Diagramme der extrazellulären Säureproduktionsrate oder ECAR und der Sauerstoffverbrauchsrate, oder OCR, wie in dieser repräsentativen Abbildung nach der Injektion von Glukose gezeigt. Der beobachtete Anstieg der ECAR stellt die Glykolyserate dar. Der zusätzliche Anstieg der ECAR nach einer TP-Synthase-Hemmung mit Oligomycin liefert weitere Informationen über die glykolytische Reserve und Kapazität. Bei der Analyse der OCR-Werte ermöglicht die CIN-Injektion die Berechnung des Sauerstoffverbrauchs, der für die mitochondriale A TP-Synthese genutzt wird; FCCP entkoppelt die mitochondriale Atmung.Die entsprechenden OCR-Messungen liefern Daten über die maximale und die zusätzliche respiratorische Kapazität; Rotenon und Antimycin A hemmen jedoch die mitochondrialen Komplexe I und III, wobei die verbleibende OCR den nicht mitochondrialen Sauerstoffverbrauch repräsentiert. Die Aktivierung von Makrophagen mit LPS führt zu einem erhöhten glykolytischen Stoffwechsel. Die Unterschiede zwischen LPS- und IL-4-behandelten Makrophagen werden noch deutlicher, wenn die Sauerstoffverbrauchsraten betrachtet werden.Tatsächlich ist der maximale oxidative Stoffwechsel in mit LPS behandelten Makrophagen stark unterdrückt, während IL-4 eine starke Atmung in M2-Makrophagen induziert. Wenn man die Methode einmal beherrscht, kann der extrazelluläre Flu-Assay innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Oligomycin gemeinsam mit FCCP zu injizieren, um die maximale Atmung nach der Entkopplung zu unterstützen.Nach dieser Technik können zusätzliche Analysen wie ELISA durchgeführt werden, um die Effizienz der Makrophagenpolarisierung zu bewerten. Diese Technik ebnete Immunologieforschern den Weg, die metabolischen Eigenschaften einer breiten Palette von Immunzellen zu untersuchen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Analyse des extrazellulären Flusses durchführt, um das metabolische Phänotyp von Makrophagen zu beurteilen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

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