Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Das übergeordnete Ziel dieser extrazellulären Flussanalyse ist es, die metabolischen Eigenschaften von naiven M1- und M-, zwei polarisierten Knochenmark-Makrophagen zu bewerten. Diese Methode kann als Rahmen dienen, um zu untersuchen, wie bestimmte Zytokine, Verbindungen oder Genocodes den metabolischen Phänotyp von Makrophagen beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nur eine geringe Menge an Makrophagen benötigt.

Darüber hinaus misst es alle relevanten Glykolyse- und Mitochondrienparameter in einem einzigen Assay. Obwohl diese Methode einen Einblick in den metabolischen Phänotyp von Makrophagen aus dem Knochenmark bietet, kann sie auch auf alle Arten von Makrophagen oder Immunzellen angewendet werden. Wir hatten die Idee, diese Methode in J zu veröffentlichen, da wir häufig Anfragen von anderen Wissenschaftlern erhalten, sie bei ihren Assays für den metabolischen Zugang zum Zellfluss zu unterstützen. Überprüfen Sie am achten Tag der Kultur das Vorhandensein reifer Makrophagen durch visuelle Inspektion und inkubieren Sie die reifen aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen fünf Minuten lang in 10 Millilitern Citrat-Kochsalzlösung.

37 Grad Celsius, wenn sich die Zellen abgelöst haben. Waschen Sie die Kultur mit 10 Millilitern PBS und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen. Dann säen Sie fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen pro Vertiefung.

In einer XFE 96-Zellkultur die Mikrotiterplatte in 100 Mikroliter Kulturmedium pro Vertiefung auffüllen, wobei die Pipette in einem Winkel etwa auf halber Höhe der Seite jeder Vertiefung gehalten wird. Um die Zellen zu dosieren, geben Sie nur Medium in die Hintergrundkorrekturvertiefungen A eins, A 12, H eins und H 12. Lassen Sie die Zellen dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einer Zellkulturhaube ruhen.

Nach Bestätigung der Adhärenzkultur werden die Zellen in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gebracht. Stimulieren Sie drei Stunden nach dem Plattieren zwischen vier und sechs Wells mit Zellen pro Zustand, je nach Bedarf für 24 Stunden. Um die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen am Tag vor dem extrazellulären Flux-Assay zu polarisieren, legen Sie die Sensorkartusche kopfüber neben die Gebrauchsplatte und füllen Sie jede Platte mit 200 Mikrolitern Crin-Lösung.

Senken Sie anschließend die Sensorkassette auf die Versorgungsplatte ab, um die Sensoren in die Cain-Lösung zu tauchen, und stellen Sie sicher, dass der Cain-Lösungsstand hoch genug ist, um den Sensor unter Wasser zu halten. Legen Sie die Kartusche dann über Nacht in einen kohlendioxidfreien 37 Grad Celsius Inkubator. Entfernen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Überstand von den polarisierten Makrophagen und waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern frisch zubereitetem Assay

Mittel pro Vertiefung. Geben Sie 180 Mikroliter Testmedium in jede Vertiefung und überprüfen Sie mit dem Mikroskop, ob die Zellen nicht weggespült wurden. Wenn die Zellen noch befestigt sind, legen Sie die Platte vor dem Assay-Lauf eine Stunde lang in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator ohne Kohlendioxid, während die Zellen inkubiert werden.

Bereiten Sie 10 x Injektionsmassemischungen wie in der Tabelle angegeben vor und erwärmen Sie die Mischungen auf 37 Grad Celsius. Laden Sie dann die Sensorpatrone mit den entsprechenden Volumina der Verbindung und den Anschlüssen A, B, C und D unter Verwendung der mitgelieferten Ladeschablonen, um die Bioenergie der polarisierten Makrophagen durch einen extrazellulären Flussassay zu charakterisieren. Verwenden Sie den Assay-Assistenten, um eine Assay-Vorlage mit einer Messzeit von zwei Minuten und einer Messzeit von drei Minuten sowie mindestens drei Messschleifen für Mix und Rate vor jeder der vier Injektionen und nach der letzten Injektion zu erstellen.

Starten Sie dann den Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Geräts. Laden der Kartuschenplatte mit den hydratisierten Sonden, um die Kalibrierung durch das Gerät und die Zellplatte zu ermöglichen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, entsorgen Sie am Ende des Assays vorsichtig das gesamte Assay-Medium und lagern Sie die analysierte Zellkultur-Mikroplatte bis zur Normalisierung bei minus 20 Grad Celsius.

Um die Zellen mit dem Zellproliferations-Assay-Kit zu normalisieren, tauen Sie die Platte auf und inkubieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern frisch zubereitetem Zelllysepuffer pro Vertiefung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Messen Sie abschließend die Fluoreszenz mit etwa 480 Nanometer Anregung und etwa 520 Nanometer Emissionsmaxima. Unter Verwendung der erfassten Fluoreszenzmessungen wird das Verhältnis berechnet, in dem die durchschnittliche Zellzahl aller naiven Makrophagen-Wells auf eins eingestellt ist, und exportieren Sie diese Verhältnisse dann in die Seepferdchen-Wellenanalysesoftware.

Um die Daten zu normalisieren, liefert ein extrazellulärer Fluss-Assay in der Regel die extrazelluläre Versauerungsrate oder ECAR und die Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR-Diagramme, wie in dieser repräsentativen Abbildung gezeigt. Nach der Injektion von Glukose stellt der beobachtete Anstieg der ECAR die Glykolyserate dar. Der zusätzliche Anstieg des ECAR nach einer TP-Synthase-Hemmung mit allen Liga-Mycin liefert weitere Informationen über die glykolytische Reserve und Kapazität. Bei der Analyse der OCR-Werte erleichtert die CIN-Injektion die Berechnung des Sauerstoffverbrauchs, der für die mitochondriale A-TP-Synthese verwendet wird, FCCP entkoppelt die mitochondriale Atmung

Die entsprechenden OCR-Messungen liefern Daten über die maximale und freie Atemkapazität bei bekannter Fäulnis und Antimycin bei der Injektion, blockieren jedoch die mitochondrialen Komplexe eins und drei, wobei die verbleibende OCR den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch darstellt. Die Makrophagenaktivierung mit LPS induziert einen erhöhten glykolytischen Stoffwechsel. Die Unterschiede zwischen LPS und IL vier behandelten Makrophagen werden noch deutlicher, wenn man die Sauerstoffverbrauchsraten beobachtet.

Während der maximale oxidative Metabolismus in LPS-behandelten Makrophagen stark unterdrückt ist, induziert IL vier in M zwei Makrophagen eine robuste Atmung. Sobald der extrazelluläre Grippetest gemeistert ist, kann er in zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Vet zusammen mit FCCP zu injizieren, um eine maximale Atmung beim Abkuppeln zu fördern.

Nach dieser Technik können weitere Assays wie Eliza durchgeführt werden, um eine effiziente Makrophagenpolarisation zu beurteilen. Diese Technik ebnete Forschern aus der Immunologie den Weg, um die metabolischen Eigenschaften einer Vielzahl von Immunzellen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine extrazelluläre Flussanalyse durchführen, um den metabolischen Phänotyp von Makrophagen zu beurteilen.