Intra-Lymphknoten-Injektion von biologisch abbaubaren Polymerpartikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomaterial-Impfstoffpartikel mit Hilfe einer Direktinjektionstechnik in die Lymphknoten abzulagern. Zuerst werden die lipidstabilisierten Polymerpartikel mit einer Doppelemulsionsmethode synthetisiert. Anschließend werden die Partikel gewaschen und die Materialeigenschaften wie Größe, Ladung, Beladung oder Stabilität gemessen.

Als nächstes verabreichen Sie einen Tracer-Farbstoff an der Schwanzbasis der Maus, um eine Visualisierung nach der Drainage des Farbstoffs in den Lymphknoten zu ermöglichen. Der letzte Schritt besteht darin, den D-markierten Lymphknoten zu identifizieren und ein kleines Volumen an Polymerpartikeln an dieser Stelle zu injizieren. Histologie, Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie können verwendet werden, um das Vorhandensein und die Verteilung von Partikeln in den leistenförmigen Lymphknoten zu bestätigen.

Die Kombination der direkten Injektion von Lymphknoten mit Biomaterialien für die Impfung ermöglicht eine strenge Kontrolle über die Kombinationen und Dosen der Impfstoffkomponenten in der Mikroumgebung der Lymphknoten und ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung der Fracht in diesen Geweben. Alle Impfstoffe müssen die Lymphknoten erreichen, um wirksam zu sein. Daher ist es wichtig zu definieren, wie sich Biomaterialien und eingebaute Immunsignale auf die lokale Lymphknotensignalisierung auswirken, um diese Ereignisse mit der systemischen Immunantwort in Verbindung zu bringen.

Dieses Wissen wird uns helfen, besser zu verstehen, wie Biomaterial-Impfstoffe auf traditionellen Wegen verabreicht werden. Obwohl die intralymphale Verabreichung von Biomaterialien als Instrument dient, um die Auswirkungen von Biomaterialien auf die Organisation von Lymphknoten zu untersuchen, bietet diese Plattform auch eine angewandte Möglichkeit, neue therapeutische Impfstoffe und Immuntherapien zu entwickeln, die auf Krebs und Autoimmunerkrankungen abzielen. Für Mikropartikel wird die organische Phase, die das Polymer, das Lipid und andere wasserunlösliche Fracht enthält, auf Eis mit 12 Watt beschallt.

Um die Wasser- und Ölemulsion herzustellen, fügen Sie 500 Mikroliter destilliertes H2O oder H2O hinzu, das ein Milligramm Peptidprotein oder eine andere wasserlösliche Fracht enthält. Fahre 30 Sekunden lang mit der Unzucht fort. Bewegen Sie das Fläschchen vorsichtig von einer Seite zur anderen um die Atorspitze herum, um eine vollständige Emulgierung zu gewährleisten.

Bereiten Sie nun die Wasser- und Öl-in-Wasser-Emulsion vor, indem Sie die Wasser-Öl-Emulsion drei Minuten lang bei 16.000 U/min in 40 Milliliter homogenisiertes H2O gießen. Fügen Sie als Nächstes einen magnetischen Rührstab hinzu und rühren Sie die Wasser- und Öl-in-Wasser-Emulsion über Nacht um, um das überschüssige Lösungsmittel nach der Entfernung des Lösungsmittels über Nacht zu entfernen. Gießen Sie die Emulsion durch ein 40-Mikron-Nylon-Mesh-Zellsieb für fünf Minuten in eine konische 50-Milliliter-Röhrchenzentrifuge, dekantieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Partikelpellet in einem Milliliter Wasser und übertragen Sie die suspendierten Partikel in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Sammeln Sie die Partikel durch eine fünfminütige Zentrifugation. Messen Sie die Partikelgröße durch Laserbeugung oder Lichtstreuung. Wenn das Volumen des Wassers, das der Fraktionszelle zugesetzt wird, ausreichend ist, um es auszurichten und auszublenden. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Partikelsuspension in die Fraktionszelle.

Schließen Sie die Fachklappe des Partikelgrößenanalysators. Messen Sie dann die Partikelgröße für PLGA. Verwenden Sie einen Brechungsindex von 1,60.

Verwenden Sie die Software-Schnittstelle, um den Partikeldurchmesser anhand einer Zahlenbasis einen Tag vor der Injektion zu berechnen. Betäuben Sie die Maus nach einem von der IAUCC zugelassenen Tierprotokoll. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zeh.

Kneifreflextests und Überwachung der Atmung, um eine Atemfrequenz von 100 bis 120 Atemzügen pro Minute zu gewährleisten. Rasieren Sie die Haare am Rutenansatz und am Hinterviertel. Entferne die Haare von der Bauchseite des Tieres und seitlich um die Rückenseite herum knapp über dem Gelenk des Hinterbeins.

Verwenden Sie für jede Farbstoffinjektion eine Mikropipette, um 10 Mikroliter Farbstofflösung in ein Mikrozentrier-Fuge-Röhrchen zu überführen, und aspirieren Sie die gesamten 10 Mikroliter durch eine 31-Gauge-Nadel in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze. Injizieren Sie nun 10 Mikroliter Färbelösung subkutan auf jede Seite der Schwanzbasis zum Laden zwischen den Injektionen. Tragen Sie eine milde Enthaarungscreme auf, um die restlichen Haare zu entfernen.

Achten Sie darauf, den Bereich zwischen dem Hinterbein und dem Bauch zu beschichten. Nach drei Minuten verwenden Sie eine feuchte, behandschuhte Hand mit warmem H two oh und reiben Sie die Enthaarungscreme sanft in die Haut ein. Wiederholen Sie den Vorgang sofort, um das überschüssige Enthaarungsmittel zu entfernen.

Befeuchten Sie anschließend ein weiches Tuch oder Papiertuch mit warmem Wasser und wischen Sie mit einer einzigen Bewegung den unteren Teil der Maus ab. Legen Sie die Maus zur Erholung unter eine Wärmelampe und halten Sie sie dann wieder mindestens 12 Stunden lang. Untersuchen Sie die anästhesierte Maus, um die Drainage von Spuren oder Farbstoffen in jeden leistenförmigen Lymphknoten zu bestätigen.

Der Lymphknoten sollte als dunkler Fleck in der Nähe des Hinterschenkels und des Bauches sichtbar sein. Resuspension nun die Partikel in destilliertem Wasser in der gewünschten Injektionskonzentration für jede Injektion. Verwenden Sie eine Mikropipette, um 10 Mikroliter Partikellösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.

Aspirieren Sie die gesamten 10 Mikroliter in eine 31-Gauge-Insulinnadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist. Ziehe die Haut straff um den gefärbten Lymphknoten mit der Nadel in einem 90-Grad-Winkel zur Haut. Dringen Sie bis zu einer Tiefe von einem Millimeter in die Haut ein.

Injizieren Sie langsam das gesamte Volumen und überwachen Sie die sichtbare Lymphknotenvergrößerung. Lassen Sie die Maus unter einer Wärmelampe erholen und kehren Sie dann zur Halterung zurück oder führen Sie zusätzliche Tests durch. Bestätigen Sie zunächst die Partikelsynthese und die Größenverteilung.

Das Syntheseprotokoll der Emulsionslösungsmittelverdampfung kann durch visuelle Inspektion der endgültigen Emulsionen qualitativ bewertet werden. Erzeugt. Emulsionen sollten eine homogene Suspension sein, die frei von sichtbaren Aggregaten ist. Die Partikelgrößenverteilung der Teile kann durch Laserbeugung bestätigt werden, oder die Partikelproben mit dynamischer Lichtstreuung sollten eine monomodale Verteilung aufweisen.

Eine weitere qualitative Bewertung der Partikelsynthese kann durch Modifikation des Protokolls erreicht werden, um eine oder mehrere fluoreszierende Ladungen, wie beispielsweise ein fluoreszierendes Peptid oder einen lipophilen Farbstoff, einzubeziehen. Farbstoff kann verwendet werden, um den Lymphknoten für die Partikelinjektion zu lokalisieren und gezielt zu behandeln Während des Trainings können Mäuse nach der Farbstoffinjektion eingeschläfert und eine Autopsie durchgeführt werden, um sich mit den Lymphknotenpositionen vertraut zu machen. Die Partikelverteilung innerhalb der t- und b-Zellzonen des infizierten Lymphknotens wird durch konfokale Mikroskopie von geschnittenen und gefärbten Lymphknoten bestätigt.

Unterschiede in den Partikeleigenschaften wie z. B. der Größe können in den Lymphknoten nach der Injektion und der Bildgebung durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik über einen Zeitraum von zwei Tagen durchgeführt werden. Die Partikelsynthese und die Tierpräparation erfolgen am ersten Tag. Die Charakterisierung der Partikelwäsche und die Intralymphknoteninjektion werden am zweiten Tag durchgeführt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine Spur oder ein Farbstoff verwendet werden kann, um die Leistenlymphknoten von Mäusen sichtbar zu machen und zu injizieren. Diese Technik ermöglicht die nicht-chirurgische Verabreichung von Impfstoffträgern aus Biomaterial direkt an den Lymphknoten mit einem Maß an Kontrolle, das bisher nicht möglich war. Die direkte Verabreichung von Biomaterialien an Lymphknoten wird es Wissenschaftlern und Ingenieuren sowie der Immunologie und Impfstoffentwicklung ermöglichen, die grundlegenden Wechselwirkungen von Biomaterialien, Impfstoffen und Immunsignalen mit dem Lymphknoten zu erforschen und ein neues Licht auf die Mechanismen zu werfen, durch die diese Materialien die Immunität stimulieren und formen.