Name: Sortierung der Streptomyces Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Sortierung myzelialer Pellets von Streptomyces nach Größe mit einem COPA-Flusszytometer. Diese Methode ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse von Wachstumsheterogenität in biotechnologischen Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Das Verfahren aus einem Zwei-Tage-alten Flüssigkultur gezüchtet analysieren und sortieren Streptomyces Pellets ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Details für das Verfahren sind nachstehend angegeben. 1. Growth (einschließlich der Erstellung von Medien und Puffer) <ol><li> Herstellung von 1 l 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2,4 g KH 2 PO 4 in 1 l destilliertem Wasser auf pH 7,4 eingestellt). Zum Zeitpunkt der Verwendung werden 100 ml 10-fach PBS und 900 ml destilliertem Wasser auf 1 Liter PBS erhalten. </li><li> Herstellung von 1 l YEME-Medium (3 g Difco-Hefeextrakt, 5 g Bacto-Pepton, Oxoid 3 g Malzextrakt, 10 g Glucose, 340 g Saccharose destilliertes Wasser bis zu 1 l) und 100 ml 2,5 M MgCl 2. Sterilisieren beide Lösungen durch Autoklavieren. Beachten Sie, dass auch andere Medien verwendet Streptomyces 4,14 werden. </li><li> 100 ml YEME Medium und 0,2 ml 2,5 M MgCl 2 einsterile 250 ml Erlenmeyerkolben mit Metallspiralfedern ausgestattet. Bereiten Sie so viele Flaschen wie Bakterienproben zu studieren. </li><li> Der Kolben Impfen mit 10 8 Sporen von Streptomyces, um eine Sporenkonzentration von 10 6 Sporen / ml zu erhalten. Wachsen die Bakterien, die für 2 Tage bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 UpM. </li></ol> 2. Sampling <ol><li> Übertragen einer 5 ml-Probe von jeder Kultur in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen unter Verwendung einer sterilen 5 ml Pipette. Schütteln Sie die Kultur, während die Probe, um sicherzustellen, dass die Stichprobe repräsentativ für die ganze Kultur. </li><li> Wenn Proben werden sofort mit COPAS analysiert keine Probenvorbereitung notwendig. Halten Sie die Probe auf Eis und gehen Sie zu Schritt 3.1 dieses Protokolls. Wenn Proben werden zu einem späteren Zeitpunkt analysiert, fixieren die Pellets in Schritten von 2,3 bis 2,5 des Protokolls beschrieben. Beachten Sie, dass Fixierung verhindert auch das Wachstum der Bakterien im Leitungssystem, wenn nicht richtig gereinigt nach analysEs. Stellen Sie sicher, dass die Fixierung mit Formaldehyd Downstream-Analysen nicht behindern. Zum Beispiel RNA nicht von Pilzpellets nach Fixierung mit Formaldehyd, isoliert werden. Im Gegensatz dazu wurde RNA erfolgreich nach der Fixierung mit 70% Ethanol 12 isoliert. </li><li> Add 600 ul 37% Formaldehyd zu 5 ml Probe zugeben und durch Invertieren 3x. Befestigen Sie die Proben auf Eis für 30 min. </li><li> Zentrifuge werden die Proben bei 2500 · g in einem Fest Rotor bei 4 ° C für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Pellets mit 5 ml PBS. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,4, so dass die Pellets mit PBS 2x gewaschen. Die Proben in PBS bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden. </li></ol> 3. COPAS Analyse <ol><li> Stellen Sie sicher, dass der COPAS Plus, der Pumpe, der Computer und die 488-nm-Argon-Laser eingeschaltet und starten Sie die Biosort Software. Obwohl eingeschaltet, wird der Laser im Bereitschaftsmodus ist. </li><li> Prüfen Sie, ob die Hülle Flüssigkeitsflasche ist voll und derAbfallflasche ist leer. </li><li> Klicken Sie auf &quot;START&quot; und dann &quot;RUN&quot;, um die 488-nm-Argon-Laser aus dem Standby, um einzuschalten. Nach ca. 60 Sekunden, wenn der Laser eingeschaltet ist, klicken Sie auf &#39;Fertig&#39;. </li><li> Überprüfen Sie die Druckmessgeräte. Der Druck für &#39;Mantel&#39;, &#39;Sample &quot;,&quot; Sorter &quot;und&quot; Clean&#39; rund 4,0, 0,5, 2,7 und 10,9 bzw. lesen sollte. </li><li> Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben &quot;Druck OK &#39;. Das System Primzahlen dann die Durchflusszelle und ist einsatzbereit. </li><li> Standardeinstellungen sind mit &quot;Verzögerung&quot; bei 11 und &#39;Breite&#39; 7 angenommen. Schwellenwerte werden bei 50 für &#39;Signal&#39; und 40 für &#39;TOF Mindest&#39; setzen, mit TOF, die die Time-of-flight. (Zur Vollständigkeit: Alle &#39;Gewinne&#39; auf 1 gesetzt, der Trigger auf EXT (Extinction) und in der Registerkarte &quot;Konfiguration&quot; unter Set &#39;Wählen Sie Scan-Rate &quot;2,50 MHz gewählt Zufall zu&quot; Verbesserte &quot;gesetzt ist.). </li><li> Entfernen übrig gebliebenen Wasser aus der Probe eine Tassed 0,1 ml von Streptomyces Probe aus Schritt 2.2 oder 2.5 in der Tasse zusammen mit PBS (ca. 50 ml). Stellen Sie sicher, dass die Probenschale richtig geschlossen ist. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Acquire&quot; Datenerfassung zu starten. Verwalten die Strömungsgeschwindigkeit zwischen 30-50 Ereignissen pro Sekunde erhalten. Wenn die Strömung zu hoch ist, fügen PBS auf der Probenschale. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit zu niedrig ist, fügen Sie weitere Probe. </li><li> Wenn mindestens 2.500 Veranstaltungen werden gesammelt klicken Sie auf &#39;STOP&#39;. Um alle Daten klicken Sie auf &#39;Store&#39; speichern und speichern Sie Ihre Datei für die anschließende statistische Analyse. Die Biosort Software die Daten in vier Dateien zu speichern, von denen nur die. Txt-Datei wird für die nachfolgende Analyse verwendet werden. </li><li> Reinigen Sie die Probenschale, indem die Probe mit einer 50-ml-Spritze und Waschen mit Wasser 2x. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,10, bis alle Proben analysiert. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die. Txt-Datei und entsorgen Sie Daten mit einem EXT unter 25 (unter Verwendung von zum Beispiel MS Excel). Diesentspricht Schmutz und lose Hyphenfragmente (für Aspergillus niger alle Daten mit einem EXT weniger als 150 werden verworfen) 4,12. Dann speichern Sie alle TOFs in einer Spalte in einer einfachen Datei (für viele Datendateien kann dies in der Programmiersprache R, erhältlich von automatisiert werden: &quot;txt&quot;. <a href="http://www.r-project.org">http://www.r-project.org</a> ). </li><li> Stellen Sie sicher, SciLab (Version 5.3.2 oder neuer von http://www.scilab.org/) wird zusammen mit dem &quot;fittools &#39;Bibliothek, die verfügbar ist, zusammen mit der Anleitung aus installiert: http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual% 20fittools.pdf </li><li> Starten SciLab und führen die notwendigen Funktionen des fittools Bibliothek, um die Daten zu modellieren. Kurz: Installieren Sie die fittools Bibliothek, wie im Handbuch (nur einmal erforderlich) gezeigt. <ol><li> Laden Sie die fittools Bibliothek. </li><li> Lesen Sie die Daten (Datei &#39;. Txt&#39;) in SciLab. </li><li>Melden Sie transformieren die Daten (natürliche Logarithmus ist die Standardprotokollfunktion). </li><li> Setzen Sie das Modell der zwei Populationen zu den Daten. </li><li> Eine Grafik mit dem Histogramm und Modell (optional). </li><li> Bootstrap die Daten (1000 Wiederholungen). </li><li> Setzen Sie das Modell auf die Bootstrap-Datensätze. </li><li> Holen Sie sich das Konfidenzintervall Schätzungen der 5-Parameter. Damit werden die Informationen über die Beteiligung Fraktion (p) der Bevölkerung, ihre zwei Mittel (μ 1 und μ 2) und die zugehörigen Standardabweichungen (α 1 und α 2) zu liefern. Darüber hinaus sind die 95%-Konfidenzintervalle durch die Umrüstung mit dem Modell nach Bootstrapping (1000 Wiederholungen) 12,13,15 bestimmt. Wenn die Vertrauensintervalle der Einrichtung nicht überlappen und das Vertrauensintervall von p zwischen 0,025-0,975 die Datenmenge als eine Kombination von zwei Populationen von Normalverteilungen erklärt. (Beachten Sie, thbei der Teilnahme Fraktion von kleinen Pellets p, während der Beteiligung großer Pellets 1 -. p) Die Beziehung zwischen TOF und der Durchmesser eines Streptomyces Pellet gleich 0,57 × TOF + 159 &amp;mgr; m 4. </li></ol></li><li> Bei beiden Populationen sind die durchschnittlichen Nutzung TOFs als Sortierparameter in der COPAS als obere und untere gefunden verpflichtet, die kleinen und großen Pellets anschließend sortieren. Man beachte, dass auch andere Sortierparameter in Abhängigkeit von den Anforderungen des Anwenders ausgewählt werden. </li></ol> 5. Pellet Sortierung <ol><li> Laden Sie die Streptomyces Probe, die wie in Schritt 3.7 beschrieben sortiert werden muss. </li><li> Set &#39;Sortierung Limits&#39; und Angaben über die minimal (Lo) und maximal (Hallo) TOF-Werte. Alternativ können Sie einen Bereich, indem Sie &quot;Regionen&quot; und dann &quot;Definieren Tor Region &#39;, um die Pellets mit den gewünschten Abmessungen oder Eigenschaften auswählen. </li><li> Legen Sie eine 50-ml-Tube zusammeln mehrere Pellets, die die Sortierparameter erfüllen. Alternativ kann eine Mikrotiterplatte verwendet werden, um einzelne Pellets zu sortieren. Mehrere Pellets (10 4 -10 5) für die DNA-und Proteinextraktion benötigt wird. Eine einzelne Tablette ist ausreichend für qPCR-Analyse von Genexpression, sondern mehrere Pellets für RNA-Sequenzierung erforderlich. </li><li> Entscheiden Sie und stellen Sie die Anzahl der Pellets, die sortiert werden müssen, und klicken Sie auf &quot;Manuelle Sortierung&quot;, um für die ausgewählten Parameter zu sortieren. Wenn die festgelegten Betrag von Pellets erreicht ist, endet die Sortierung automatisch. </li><li> Entfernen übrig Probe mit einer 50 ml Spritze aus dem Probenbecher und waschen Sie die Tasse mit Wasser 2x. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, wenn andere Proben müssen sortiert werden. </li><li> Vor dem Herunterfahren des COPAS spülen Sie den Probenbecher mit Wasser, um die restlichen Pellets zu entfernen und reinigen Sie den Probenbecher mit 70% EtOH und / oder 2% Hypochlorit in Wasser. Führen Sie eine Probe von Chlorwasser, das gesamte System zu reinigen, und wiederholen Sie diese mit Wasser. Leere ter Behälter und sauber überlaufen oder den Filter, der in diesem Container befindet, zu ersetzen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf &quot;STOP&quot;, um den Druck aus dem System zu lösen. Wenn der Motor stoppt schließen Sie das Programm und klicken Sie auf &quot;Herunterfahren ohne Spülung. Dann schalten Sie den Computer aus, die COPAS, die Laser und die Pumpe. </li></ol>

<ol><li>Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHopwood%2C+DA+%22Streptomyces+in+nature+and+medicine%3A+the+antibiotic+makers%22">Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers</a>. , University Press. New York, Oxford. (2007).</li>
<li>van Wezel, G. P., McDowall, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+secondary+metabolism+of+Streptomyces%3A+new+links+and+experimental+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Rep%22%5BJournal%5D)">The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances.</a> Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).</li>
<li>Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+production+and+streptomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein production and streptomycetes.</a> J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).</li>
<li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+two+distinct+mycelial+populations+in+liquid-grown+Streptomyces+cultures+using+a+flow+cytometry-based+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).</li>
<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li>
<li>Davey, H. M., Winson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+quantify+microbial+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Issues+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity.</a> Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).</li>
<li>Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+flow+cytometry+in+industrial+microbiology+for+strain+improvement+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs.</a> Cytometry. 5, 145-150 (1984).</li>
<li>Bell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+method+for+rapid+selection+of+novel+industrial+yeast+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).</li>
<li>Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPulak%2C+R+%22C.+elegans%3A+methods+and+applications%22">C. elegans: methods and applications</a>. Strange, K. , Springer. 275-286 (2006).</li>
<li>Buszczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carnegie+protein+trap+library%3A+a+versatile+tool+for+Drosophila+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies.</a> Genetics. 175, 1505-1531 (2007).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Aspergillus+niger+microcolonies+in+liquid+shaken+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).</li>
<li>van Veluw, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+liquid+shaken+cultures+of+Aspergillus+niger+inoculated+with+melanised+conidia+or+conidia+of+pigmented+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Stud.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants.</a> Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).</li>
<li>Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKieser%2C+T+%22Practical+Streptomyces+Genetics%22">Practical Streptomyces Genetics</a>. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).</li>
<li>Vinck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyphal+differentiation+in+the+exploring+mycelium+of+Aspergillus+niger%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger.</a> Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).</li>
<li>Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pellet+morphology+during+submerged+growth+of+Streptomyces+tendae+by+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Durchflusszytometrie hat den Hochgeschwindigkeits-Analyse einer großen Anzahl von Einzelzellen, die zum Verständnis der Heterogenität in klonalen Populationen 6 beigetragen aktiviert. Regelmäßige Durchflusszytometrie nicht möglich ist für die Analyse der vielzelligen Myzelpellets von Streptomyceten und Pilze. Unsere Arbeit hat gezeigt, dass die Hochdurchsatzanalyse von Streptomyces Pellets ist machbar mit COPAS. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach, schnell und sehr gut reproduzierbar. Der kritische Parameter zu beachten, während des Betriebs des Gerätes, ist die Strömungsgeschwindigkeit, die 100 Veranstaltungen / sec (Schritt 3.8 dieses Protokolls) nicht überschreiten sollte. Wenn der Pellet-Konzentration und damit auch die Strömungsgeschwindigkeit zu hoch wird, werden die TOF-Werte falsch berechnet werden, da das Gerät nicht zu einzelnen Pellets zu erkennen. Ausreichend Verdünnen der Probe durch Zugabe von PBS überwindet dieses Problem. Begrenztheit Die COPAS Plus-Einsatz<html> d hat hier einen Düsendurchmesser von 1 mm, das zum Messen Teilchen mit einer Größe im Bereich von 30 bis 700 &amp;mgr; m ist. Diese Düse ermöglicht daher die Messung Pellets durch Streptomyceten gebildet. Im Fall von filamentösen Pilzen können die Mikrokolonien größer sein, welche die allgemeine Anwendbarkeit des COPAS plus begrenzt. Die COPAS XL können Partikel bis zu 1.500 um Größe zu messen, sondern die Empfindlichkeit im unteren Bereich mit einem Durchmesser von weniger im Vergleich zu dem des Plus-COPAS. Sowohl die Plus-und die COPAS COPAS XL nicht analysieren Teilchen kleiner als 30 um. Dies bedeutet, dass die einzelnen mikrobiellen Sporen oder Zellen können nicht analysiert werden. Darüber hinaus kann die COPAS nicht genau analysieren kleine Aggregate von Zellen oder Sporen und den sehr kleinen Mikrokolonien. Dazu sollten regelmäßige Zellanalysatoren verwendet werden. Diese Einschränkung wird durch die Biosorter der Union Biometrica, die Partikel im Bereich von 1-1,500 um analysieren zu überwinden. Der Kaufpreis ist aber höher. t &quot;&gt; Fehlerbehebung Die COPAS ist ein robustes Gerät, das einfach zu bedienen ist. Aber manchmal Pellets nicht nach dem Laden einer Probe in die Probenschale und Starten der Messung erfasst. Die Ursache ist in der Regel ein Rohr verstopft Eintrag, die leicht durch Drücken der &quot;sauberen&quot; Befehl gelöst werden können. Dadurch werden die Pellets von dem Rohrsystem zurück in den Probenbecher zu zwingen. Ein alternativer Grund könnte sein, dass der Deckel nicht richtig auf dem Probenbecher gelegt. Dies führt zu Druckverlust und die damit einhergehende fehlende Pellets zu erkennen. Bedeutung und zukünftige Richtungen Wir hier konzentrierte sich auf die Analyse der Pellet-Größe, aber die COPAS Setup ist auch in der Lage zu analysieren und auf Fluoreszenz Art und Dichte berechnet. Fluoreszenzdetektion ermöglicht es uns, die Genexpression basierend auf Reporter wie GFP analysieren. Weiterhin kann die Zusammensetzung der Zellen evaluiert werden. Noch leistungsfähiger ist die Möglichkeit, Pellets nach diesen Parameter zu trennenter. Sortiert Pellets können für Downstream-Analysen, einschließlich alle omics-Studien verwendet werden. In der Tat, wir vorher sortiert 60.000 große und 200.000 kleine Pellets, und gezeigt, dass das Proteom war signifikant unterschiedlich zwischen großen und kleinen Pellets 4. Diese Technologie bietet daher neue Leads zu Streptomyceten als Zellfabriken zu verbessern. Der entscheidende Vorteil des COPAS Technologie ist die Zeit. Frühere Studien an Zellpellets wurden unter Verwendung von Mikroskopie und dadurch die Anzahl von Pellets, die bis zu mehreren hundert 16 analysiert werden können, begrenzt. Mikroskopie Studien, die bereits die Existenz von zwei Populationen von Pellets in flüssigem Streptomyces-Kulturen angebaut 16 vorgeschlagen. In der Tat wurden zwei Populationen von Pellets unabhängig von den Kulturbedingungen in einer großen Anzahl von verschiedenen Streptomyceten 4 erfasst. Diese Größe ist nicht auf Heterogenität Faden Streptomyceten beschränkt, sondern wurde auch in Fadenpilze 12 beobachtet &lt;/ Sup&gt;. In allen Fällen werden die zugrunde liegenden Mechanismen der Heterogenität noch nicht bekannt. Die Möglichkeit, Pellets sortieren nach Größe und Fluoreszenz ermöglicht es uns, solche Mechanismen zu entschlüsseln.

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die für ihre Kenntnisse bekannten Antibiotika bilden, wie auch Verbindungen, die als Immunsuppressiva oder zur Bekämpfung von Pilzinfektionen oder Krebs 1,2 verwendet werden können. Darüber hinaus sind diese Organismen produzieren Enzyme, die für eine Vielzahl von industriellen Anwendungen 3 von Interesse sind. Die meisten kommerziell interessante Verbindungen sind in Bioreaktoren hergestellt. Wachstum von Streptomyceten in Bioreaktoren ist durch die Bildung von komplexen Strukturen von miteinander verbundenen Hyphen, wie Klumpen oder Pellets bekannt ist. Diese multizellulären Strukturen sind sehr heterogen in Bezug auf Größe 4 und Größen, die mehr als eine Million Mal größer als ein einzellige Bakterium wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis sind zu erreichen. Obwohl Heterogenität wird als vorteilhaft Merkmal in natürlichen biologischen Systemen 5 betrachtet, wird es als ein Fallstrick Produktion in der Industrie. BioReaktor Kulturen haben reproduzierbar und kontrollierbar, die eine möglichst hohe Rendite zu erzielen sein. Ein detailliertes Verständnis der Rolle von jedem der Pellet-Typen in einem Bioreaktor ist daher von entscheidender Bedeutung für Streptomyceten als Zellfabrik zu verbessern. Durchflusszytometrie wird üblicherweise verwendet, um einzelne Zellen untersucht in einer Population 6. Durchflusszytometer kann multiInformationen durch gleichzeitiges Messen von Eigenschaften der Zellen (z. B. Größe, Dichte und multicolor Fluoreszenz) zu erwerben. Auf diese Weise können Zelleigenschaften korreliert werden, um dadurch das Verständnis der Heterogenität in einer Kultur und das Vorhandensein von verschiedenen Populationen von Zellen 6 beiträgt. Spezialisiertere Instrumente entsprechend benutzerdefinierten Parametern machte es möglich, Zellen zu sortieren. Zum Beispiel können Mutanten gescreent werden. Nach der Sortierung können solche mutierten Zellen für die weitere Charakterisierung kultiviert werden. Dies wurde bereits als nützlich erwiesen, unter anderem,zur Verbesserung der Produktivität der Stämme 7,8. Die Düsen Durchflusszytometer typischerweise ermöglichen die Passage von Zellen mit einem maximalen Durchmesser von etwa 10 &amp;mgr; m. Daher können Pellets von Streptomyceten nicht mit regelmäßigen Durchflusszytometer analysiert werden. Sie können jedoch mit der komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS) analysiert werden. Wie regelmäßige Durchflusszytometer kann COPAS multi Daten von Teilchen in einem Hochdurchsatz-Art und Weise zu erwerben. Abhängig von der Art der COPAS 10-1,500 &amp;mgr; m große Partikel analysiert werden. Darüber hinaus ermöglicht es für das Sortieren der einzelnen Partikel, die für den Anbau oder Downstream-Analysen verwendet werden können, wie die Isolierung von DNA, RNA oder Proteinen. COPAS wurde zunächst für die Analyse und Sortierung von kleinen mehrzelligen Organismen wie Nematoden Caenorhabditis elegans 9 und Drosophila-Embryonen und Larven 10 ausgebildet. Die Geräte sind auch für Zebrafisch 11 a eingesetztnd für Fadenpilze 12,13. Letztere Organismen bilden auch Myzelpellets, die sogar größer als diejenigen von Fadenbakterien gebildet sind. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Verwendung von COPAS ist auch denkbar Streptomyceten 4. Wir beschreiben hier die experimentelle Verfahren für die Verwendung der COPAS zu Pellet Heterogenität in Streptomyces coelicolor beurteilen, einschließlich Einzelheiten über die Methodik, um Pellets nach Größe zu sortieren. Beachten Sie jedoch, daß dieses Verfahren auch für die Analyse anderer Pellet bildenden Streptomyceten verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>COPAS Plus</td><td>Union Biometrica</td><td>PLUS</td><td>Durchflusszytometer für große Partikel inkl. Laser und Software</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>PBS Komponente</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>PBS Komponente</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>PBS Komponente</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td>PBS-Komponente</td></tr><tr><td>Difco Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>210933</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Oxoid-Malzextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXLP0039B</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>Medien Baustein</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td>Medienkomponenten. Nach dem Autoklavieren hinzufügen.</td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Fixierung von Pellets</td></tr><tr><td>Natriumhypochloritlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71696</td><td>Zur Reinigung des Instruments</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20816.367</td><td>Zur Reinigung des Instruments</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben (250 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>214-1132</td><td>Kulturkolben für die Züchtung Streptomyces</td></tr><tr><td>Springs</td><td>Verenfabriek De Spiraal</td><td>Custom-Made</td><td>Verwendet in Kulturkolben. RVS1.4401/Länge 210 mm/Durchmesser 17 mm/Rastermaß 5 mm</td></tr><tr><td>Steriles Zentrifugenröhrchen (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen (50 ml)</td><td>Sigma</td><td>Z683698</td><td></td></tr></tbody></table>

sortierung der<em&gt; streptomyces</em&gt; zell pellets mit einem komplexen objekt parametric analyzer und sorter

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomyceten sind filamentöse Bodenbakterien, die in der Industrie zur Herstellung von Enzymen und Antibiotika verwendet werden. Wenn in Bioreaktoren gezüchtet, diese Organismen bilden Netzwerke von miteinander verbundenen Hyphen, als Pellets, die in der Größe heterogen sind bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode, um zu analysieren und sortieren Myzelpellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter (COPAS). Ausführliche Anweisungen für die Verwendung des Instruments und der Grund statistische Analyse der Daten. Wir beschreiben außerdem, wie Pellets können sortiert werden nach benutzerdefinierten Einstellungen, die Weiterverarbeitung ermöglicht, wie die Analyse der RNA-oder Proteingehalt. Mit dieser Methode kann der Mechanismus zugrunde liegende heterogene Wachstum angegangen werden. Dies wird entscheidend für die Verbesserung der Streptomyceten als Zellfabrik, in Anbetracht der Tatsache, dass die Produktivität korreliert mit Pelletgröße sein.

COPAS Messungen von Streptomyces Pellets Streptomyceten bilden Myzelpellets in Flüssigkulturen, die eine breite Palette von Größen haben. Um zu analysieren, Pelletgrößenverteilung, eine 2-Tage alten Flüssigkeit gewachsen Streptomyces coelicolor Kultur wurde in großen Partikel Durchflusszytometrie unter Verwendung eines COPAS Plus-Profiler mit einem 1-mm-Düse ausgerüstet unterzogen. Eine typische COPAS Ausgang ist ein Streudiagramm, wie in Abbildung 2A visualisiert. Die x-Achse stellt die Time-of-flight (TOF), die mit Pelletgröße (dh es länger dauert größeren Pellets, um den Laserstrahl passieren) korreliert. Die y-Achse zeigt die Extinktion, die die optische Dichte des Objekts darstellt. Jeder Punkt im Streudiagramm entspricht einem einzelnen Ereignis, dh einem einzigen Pellet Passieren des Laserstrahls. Wichtig ist, dass, wenn die Probe zu konzentriert ist (dh, wenn der Laser detektiert, mehr als 100 Ereignisse / sec), die COPAS häufig nicht zu erkennen einzelnen pellets. Dies führt zu falschen TOF-Werte, die zu hoch sind. Verdünnen der Probe reduziert die durchschnittliche TOF-Werte, bis zu einem Punkt, wo weitere Verdünnungs tut keinen Einfluss mehr TOF. Dieser Punkt ist erreicht, wenn etwa 100 Pellets / sec wurden analysiert. Die graphische Darstellung der Datenpunkte in ein Histogramm zeigt an, dass die Größen nicht normalverteilt sind (Abbildung 2B). Die Verteilung wird nach rechts verschoben sein. Melden Sie sich die Umwandlung der Datenmenge auch nicht zu einer Normalverteilung (Abbildung 2C) führen. Zu beurteilen, ob die Größenverteilung kann durch die Annahme einer Mischung von zwei Normalverteilungen die Daten mathematisch modelliert 12,15 erläutert. Modellierung der Tat gezeigt, dass die Größenverteilung kann durch die Annahme der Existenz von zwei verschiedenen Populationen von Pellets beschrieben. Die Bevölkerung von kleinen Pellets bestand aus 92% aller Pellets mit einer durchschnittlichen Größe von 248 um, während die Bevölkerung der großen pelkönnen (8% aller Pellets) hatte eine durchschnittliche Größe von 319 um (beachten Sie, dass zwei Populationen auszugehen, wenn der Teilnahmeanteil zwischen 2,5 bis 97,5%). Sortieren von Streptomyces Pellets nach Größe Mikrokolonien aus den Populationen von großen und kleinen Pellets wurden sortiert. Zu diesem Zweck wurden die durchschnittliche Pelletgrößen der zwei Populationen verwendet werden, um die Grenzen für die Sortierung definieren. Pellets kleiner als 248 &amp;mgr; m wurden als von dem kleinen Pellet Bevölkerung, während Pellets größer als 319 &amp;mgr; m, wurden als von der großen Pellet Population (Abbildung 3), um so zu begrenzen Sortieren von Pellets aus dem überlappenden Abschnitt der zwei Größen Distributionen. Die mikroskopische Analyse von sortierten Pellets zeigten ihre unterschiedlichen Größen (Abbildung 3). Die gesammelten Pellets können weitere DNA-, RNA-oder Protein-Trennungen verwendet werden. &lt;img alt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus zur Messung und Analyse Streptomyces Pellets mit COPAS. Einzelheiten siehe experimentellen Verfahren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig2.jpg" /> Abbildung 2. Pelletgröße Heterogenität in flüssiger wachsenen Streptomyces Kulturen. COPAS Analyse einer 2 Tage alten S. coelicolor YEME-Kultur (A) zeigt an, dass Pelletgrößen (als Flugzeit-Werte angegeben) sind in der Regel nicht zu verteilend (B), und auch wenn sich so log-transformiert (C). Stattdessen wurden zwei Populationen von Pellets, die in TOF unterscheiden (und damit Größe) nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51178/51178fig3.jpg" /> 3. Fraktionierung von Streptomyces Pellets je nach Größe. Pellets mit einer Größe kleiner als 248 um (in rosa gekennzeichnet) wurden als kleine Pellets sein, während Pellets mit einer Größe von mehr als 319 um (in blau dargestellt) wurden als große Pellets. Mikroskopische Analyse bestätigt den Unterschied in der Größe. Beachten Sie, dass bei diesen Größen wurden aus den log-transformierten Daten unter Verwendung der beschriebenen Beziehung zwischen TOF und d berechnetiameter eines Streptomyces-Pellet, die 0,57 × TOF + 159 um beträgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51178/51178fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Flüssig-grown Streptomyces-Kulturen werden durch Myzelpellets, die in der Größe heterogen sind gekennzeichnet. Wir beschreiben hier eine Methode, um zu analysieren und zu sortieren, wie Pellets in einem Hochdurchsatz-Weise. Diese Pellets können für weitere Analysen, die Leitungen zur Verfügung stellt, zu verstehen und zu steuern Wachstum Heterogenität verwendet werden.

Sortierung der<em&gt; Streptomyces</em&gt; Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mycel-Pellets, die von fadenförmigen Streptomyces gebildet werden, nach ihrer Größe zu sortieren, und zwar mithilfe eines COPA-Flusszytometers für große Partikel. Dies wird zunächst durch das Wachstum und anschließende Probenehmen des gewünschten Bakterienstamms erreicht. Im zweiten Schritt wird der Probenstamm mittels COPPA gemessen. Die Daten werden anschließend in silico analysiert und die Myzel-Pellets entsprechend benutzerdefinierter Parameter sortiert. Letztlich können diese Analysen zur weiteren Charakterisierung der Heterogenität der Pelletgröße verwendet werden. Obwohl diese Methode für Streptomyces angewendet werden kann, ist sie ebenfalls auf andere Organismen wie fadenförmige Pilze übertragbar. Die Demonstration dieses Verfahrens übernimmt MaRous Petrus, ein Doktorand aus unserem Labor.Zunächst kultivieren Sie die Ansätze, indem Sie 100 Milliliter Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium und 0,2 Milliliter einer 2,5-molaren Magnesiumchloridlösung einem sterilen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben zusetzen, der mit Metallfedern zur Durchmischung für jede Bakterienprobe ausgestattet ist. Inokulieren Sie anschließend jeden Kolben mit 1 × 10⁸ Sporen von Streptomyces, um eine Sporenkonzentration von 1 × 10⁶ Sporen pro Milliliter zu erreichen, und kultivieren Sie die Bakterien bei 30 °C unter Schütteln mit 180 U/min. Nach zwei Tagen entnehmen Sie mithilfe einer sterilen 5-Milliliter-Pipette je eine 5-Milliliter-Probe aus jeder Kultur, wobei Sie den Kolben vorher vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.Danach jede Probe in einzelne kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen abfüllen. Um die Proben mittels Copus-Analyse auszuwerten, sicherstellen, dass der Copus-Plus-Pumpen-Computer und der 488-Nanometer-Argonlaser eingeschaltet sind, und dann die Bio-Source-Software öffnen. Überprüfen, ob die Umhüllungsflüssigkeitsflasche voll und die Abfallflasche leer ist, und anschließend auf „Start“ klicken und laufen lassen.Um den 488 Nanometer Argonlaser vom Standby- in den eingeschalteten Zustand zu wechseln, nach etwa 60 Sekunden ist der Laser betriebsbereit. Klicken Sie auf „Fertig“ und überprüfen Sie anschließend die Druckanzeigen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Druck.Okay, und danach, nachdem das System die Durchflusszelle geprimt hat, bestätigen Sie, dass die Verzögerungseinstellung bei 11 und die Breite bei sieben liegt. Stellen Sie die Schwellenwerte auf 50 für das Signal und 40 für die minimale Flugzeit ein. Entfernen Sie dann das verbleibende Wasser aus dem Probenbehälter.Gegeben Sie etwa 50 Milliliter PBS hinzu, und geben Sie dann 0,1 Milliliter einer der Strep-Demy-Proben in die Küvette. Stellen Sie sicher, dass die Küvette ordnungsgemäß verschlossen ist, und klicken Sie anschließend auf „Erfassen“, um mit der Datensammlung zu beginnen. Regeln Sie die Fließgeschwindigkeit so, dass zwischen 30 und 50 Ereignisse pro Sekunde erfasst werden, nachdem mindestens 2.500 Ereignisse gesammelt wurden.Klicken, anhalten und dann speichern Sie die Daten zur anschließenden statistischen Analyse, um bakterielle Pellets für jede Probe zu sortieren. Legen Sie zunächst die Sortiergrenzen fest und geben Sie Details zu den minimalen und maximalen Flugzeitwerten ein. Alternativ wählen Sie Bereiche aus und definieren dann den Gatterbereich, um einen Bereich zur Auswahl der Pellets mit den gewünschten Abmessungen und Eigenschaften zu erstellen.Platzieren Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen, um die Pellets zu sammeln, die den Sortierparametern entsprechen. Stellen Sie anschließend die Anzahl der zu sortierenden Pellets ein und klicken Sie manuell auf „Sortieren“, um nach den ausgewählten Parametern zu sortieren. Entfernen Sie nach dem Sortiervorgang die verbliebene Probe und spülen Sie die Probenkammer zweimal mit Wasser aus.Bevor Sie das Gerät ausschalten, reinigen Sie die Probenkammer mit 70 % Ethanol. Führen Sie das System nun zweimal durch: einmal mit chlorhaltigem Wasser und einmal mit reinem Wasser, und leeren Sie anschließend den Überlaufbehälter. Klicken Sie nach der Reinigung auf „Stop“, um den Druck aus dem System abzulassen.Wenn der Motor stoppt, schließen Sie das Programm und klicken Sie auf Herunterfahren, ohne zu spülen. Schalten Sie dann den Computer, die Copa, den Laser und die Pumpe streptomyces form aus. Mycel-Pellets und Flüssigkulturen, die eine breite Größenpalette aufweisen.Um die Größenverteilung der Pellets zu analysieren, wurde eine zwei Tage alte, in Flüssigkultur gezüchtete Streptomyces cila color-Kultur einer Durchflusszytometrie für große Partikel unter Verwendung eines Copus Plus Profilers mit einer 1-Millimeter-Düse unterzogen. Hier ist ein typisches Streudiagramm des Copus-Ausgangssignals dargestellt. Die x-Achse repräsentiert die Flugzeit.Je größer das Partikel, desto länger dauert es, bis es den Laserstrahl durchquert hat. Die Y-Achse zeigt die Extinktion an, die die optische Dichte des Objekts repräsentiert, wobei jeder Punkt einem einzelnen Partikel entspricht, das den Laserstrahl passiert. Die Auftragung der Datenpunkte in ein Histogramm zeigte, dass die Größenverteilung in dieser repräsentativen Probe nicht normalverteilt war.Die Verteilung schien nach rechts verschoben zu sein. Auch die log-Transformation des Datensatzes führte nicht zu einer Normalverteilung. Um zu überprüfen, ob die Größenverteilung durch Annahme eines Gemischs aus zwei Normalverteilungen erklärt werden könnte, wurde die Daten mathematisch modelliert. Die Modellierung zeigte tatsächlich eine Population kleiner Pellets, die 92 % aller Pellets ausmachten und eine durchschnittliche Größe von 248 Mikrometern aufwiesen, sowie eine Population größerer Pellets, die 8 % aller Pellets umfassten und eine durchschnittliche Größe von 319 Mikrometern hatten.Hier wird eine repr&auml;sentative Analyse von Mikrokolonien gezeigt, die aus den Populationen der gro&szlig;en und kleinen Pellets sortiert wurden. Die durchschnittlichen Pelletgr&ouml;&szlig;en der beiden Populationen wurden verwendet, um die Grenzen f&uuml;r die Sortierung festzulegen, um die Sortierung von Pellets aus dem &uuml;berlappenden Bereich der beiden Gr&ouml;&szlig;enverteilungen einzuschr&auml;nken: Pellets kleiner als 248 Mikrometer galten als Teil der Population der kleinen Pellets, w&auml;hrend Pellets gr&ouml;&szlig;er als 319 Mikrometer als Teil der Population der gro&szlig;en Pellets betrachtet wurden. Die mikroskopische Analyse der sortierten Pellets best&auml;tigte deren unterschiedliche Gr&ouml;&szlig;en nach diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung oder die Proteomik können durchgeführt werden, um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Heterogenität aufzuklären.

sorting-streptomyces-cell-pellets-using-complex-object-parametric

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Kim, H. et al., Multi-Enzym-Screening mit einem Hochdurchsatz genetischen Enzym-Screening-System. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert eine genetische Screening-Methode zur Erkennung der Enzymexpression unter Verwendung metagenomischer Fosmidbibliotheken und chromogener Substrate. Die Durchflusszytometrie identifiziert und isoliert einzelne Zellen, die farbige Produkte produzieren, was eine Hochdurchsatzselektion aktiver enzymexpressiver Zellen ermöglicht.

Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads (BEST) ersetzt die manuellen Prozesse zu isolieren, zu stören und Abstand Tetraden. BESTE isoliert Tetraden durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung auf Agarplatten, trennt die Sporen durch Schütteln mit Glasperlen, und bestimmt, welche zufällig angeordnet Kolonien wurden aus der gleichen ursprünglichen Tetrade mit Molekular Barcodes abgeleitet.

BEST: Barcode Aktiviert Sequenzierung Tetrads

Wir beschreiben eine Sortierstrategie für Mausspermatiden mittels Durchflusszytometrie. Die Spermatiden werden in vier hochreine Populationen eingeteilt, darunter runde (Spermiogenese-Schritte 1-9), früh-elongierende (Spermiogenese-Schritte 10-12), spät-elongierende (Spermiogenese-Schritte 13-14) und längliche Spermatiden (Spermiogenese-Schritte 15-16). DNA-Färbung, Größe und Granulosität werden als Selektionsparameter verwendet.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken ist eine bewährte Technik für Entdeckung von Peptid Affinität Reagenzien, eine robuste Alternative zu Antikörpern. Die halbautomatische Sortiermethode hierin wurde gestrafft, Biopanning um das Auftreten von Fehlalarmen zu verringern. Hier zeigen wir den Denkprozess und Techniken Bewertung der Kandidaten und nachgelagerte Analyse zu minimieren.

Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Automatisierung der posttranslationalen Analyse einzelzelliger Histon-Modifikationen unter Verwendung einer isotopischen Zweiplex-Markierungsstrategie und der ArgC-Verdauung. Dieser Workflow ermöglicht quantitative, reproduzierbare und hochsensible Profilierung der Chromatinheterogenität und epigenetischen Antworten bei Einzelzellauflösung.

Automatisierte Probenvorbereitung für die multiplexierte Analyse einzelzelliger Histon-Posttranslationalen Modifikationen (sc-hPTM2)

Erfahren Sie die Sortierung myzelialer Pellets von Streptomyces nach Größe mit einem COPA-Flusszytometer. Diese Methode ermöglicht die Hochdurchsatzanalyse von Wachstumsheterogenität in biotechnologischen Anwendungen.

Sortierung der

Weitere Videos entdecken