Sortierung der Streptomyces Zell Pellets mit einem komplexen Objekt Parametric Analyzer und Sorter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Myzelpellets, die aus filamentösen Streptomyces gebildet werden, nach Größe zu sortieren, wobei ein COPA-Durchflusszytometer mit großen Partikeln verwendet wird. Dies geschieht zunächst durch das Wachstum und die anschließende Probenahme des gewünschten Bakterienstammes. Im zweiten Schritt wird die Probendehnung mittels Coppa gemessen.

Anschließend werden die Daten in silico analysiert und die Myzelpellets nach benutzerdefinierten Parametern sortiert. Letztendlich können diese Analysen verwendet werden, um die Heterogenität der Pelletgröße weiter zu charakterisieren. Obwohl diese Methode bei Streptomyces angewendet werden kann, kann sie auch auf andere Organismen wie filamentöse Pilze angewendet werden, wobei MaRous Petrus, ein Doktorand aus unserem Labor, dieses Verfahren demonstrieren wird.

Zuerst züchten Sie die Kulturen, indem Sie 100 Milliliter Hefeextrakt, Malzextraktmedium und 0,2 Milliliter 2,5 molare Magnesiumchlorid in einen sterilen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben geben, der für jede Bakterienprobe mit Metallspiralfedern ausgestattet ist. Dann wird jeder Kolben mit einer mal 10 zu den acht Sporen von Streptomyces geimpft, um eine Sporenkonzentration von eins mal 10 zu den sechs Sporen pro Milliliter zu erhalten, und die Bakterien werden bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 180 Umdrehungen pro Minute gezüchtet. Verwenden Sie nach zwei Tagen eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um eine Fünf-Milliliter-Probe aus jeder Kultur zu entnehmen, während Sie den Kolben vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Geben Sie dann jede Probe in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen ab. Um die Proben durch die Copus-Analyse auszuwerten, vergewissern Sie sich, dass der Copus Plus-Pumpencomputer und der 488-Nanometer-Argonlaser eingeschaltet sind, und öffnen Sie dann die Bioquellensoftware. Vergewissern Sie sich, dass die Scheidenflüssigkeitsflasche voll und die Abfallflasche leer ist, und klicken Sie dann auf Start und Ausführen.

Um den 488-Nanometer-Argonnenlaser nach ca. 60 Sekunden vom Standby- auf den Einschaltmodus zu schalten, steht der Laser bereit. Klicken Sie auf "Fertig" und überprüfen Sie dann die Manometer. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben dem Druck.

Okay, und nachdem das System die Durchflusszelle vorbereitet hat, bestätigen Sie, dass die Verzögerungseinstellung bei 11 und die Breite bei sieben liegt. Legen Sie die Schwellenwerte auf 50 für das Signal und 40 für die minimale Flugzeit fest. Entfernen Sie dann das übrig gebliebene Wasser aus dem Probenbecher.

Fügen Sie etwa 50 Milliliter PBS hinzu und geben Sie dann 0,1 Milliliter einer der Streptokokkenproben in den Becher. Vergewissern Sie sich, dass der Becher richtig geschlossen ist, und klicken Sie dann auf Erfassen, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Verwalten Sie die Flussgeschwindigkeit, um zwischen 30 und 50 Ereignisse pro Sekunde zu erhalten, wenn mindestens 2.500 Ereignisse erfasst wurden.

Klicken Sie auf , stoppen und dann speichern, um die Daten für die nachfolgende statistische Analyse zum Sortieren der Bakterienpellets für jede Probe zu speichern. Legen Sie zunächst Sortiergrenzen fest und geben Sie Details zu den minimalen und maximalen Time-of-Flight-Werten ein. Alternativ können Sie Bereiche auswählen und dann den Angussbereich definieren, um einen Bereich für die Auswahl der Pellets mit den gewünschten Abmessungen und Eigenschaften zu erstellen.

Platzieren Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen, um die Pellets zu sammeln, die den Sortierparametern entsprechen. Legen Sie dann die Anzahl der zu sortierenden Pellets fest und klicken Sie auf Manuell sortieren, um nach den ausgewählten Parametern zu sortieren. Entfernen Sie nach dem Sortieren die übrig gebliebene Probe und spülen Sie den Probenbecher zweimal mit Wasser aus.

Reinigen Sie den Probenbecher vor dem Herunterfahren des Behälters mit 70 % Ethanol. Führen Sie nun das System zweimal aus. Einmal mit chloriertem Wasser und einmal mit klarem Wasser, dann leeren Sie den Überlaufbehälter Klicken Sie nach der Reinigung auf Stopp, um den Druck aus dem System abzulassen.

Wenn der Motor stoppt, schließen Sie das Programm und klicken Sie auf Herunterfahren ohne Spülen. Schalten Sie dann den Computer aus, es bilden sich die Copa, der Laser und die Pumpe. Myzelpellets und Flüssigkulturen, die eine große Auswahl an Größen haben.

Um die Größenverteilung der Pellets zu analysieren, wurde eine zwei Tage alte, in Flüssigkeit gezüchtete Streptomyces cila-Farbkultur einer Durchflusszytometrie mit großen Partikeln unter Verwendung eines Copus plus Profilers unterzogen, der mit einer Ein-Millimeter-Düse ausgestattet war. Hier wird ein typisches Streudiagramm für die Copus-Ausgabe gezeigt. Die x-Achse stellt die Laufzeit dar.

Je größer die Appellate ist, desto länger dauert es, den Laserstrahl zu passieren. Die Y-Achse zeigt die Extinktionsstörung an, die die optische Dichte des Objekts darstellt, wobei jeder Punkt in der einem einzelnen Kügelchen entspricht, das den Laserstrahl durchläuft. Das Darstellen der Datenpunkte in einem Histogramm zeigte, dass die Größen dieser repräsentativen Stichprobe nicht normalverteilt waren.

Die Verteilung schien nach rechts verzerrt zu sein. Die Transformation des Datensatzes führte auch nicht zu einer Normalverteilung Um zu beurteilen, ob die Größenverteilung unter der Annahme einer Mischung aus zwei Normalverteilungen erklärt werden kann, wurden die Daten mathematisch modelliert. Die Modellierung ergab in der Tat eine Population kleiner Pellets, die aus 92 % aller Pellets mit einer durchschnittlichen Größe von 248 Mikrometern bestand, und eine Population von großen Pellets, die 8 % aller Pellets mit einer durchschnittlichen Größe von 319 Mikrometern ausmachten.

Hier wird eine repräsentative Analyse von Mikrokolonien gezeigt, die aus den großen und kleinen Pelletpopulationen sortiert wurden. Die durchschnittlichen Pelletgrößen der beiden Populationen wurden verwendet, um die Grenzen für die Sortierung zu definieren, um die Sortierung der Pellets aus dem überlappenden Teil der beiden Größenverteilungen zu begrenzen: Pellets, die kleiner als 248 Mikrometer sind, wurden als aus der kleinen Pelletpopulation stammend angesehen, während Pellets, die größer als 319 Mikrometer sind, als aus der großen Pelletpopulation stammend angesehen werden. Die mikroskopische Analyse der sortierten Pellets bestätigte ihre unterschiedlichen Größen Nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie Next Generation Sequencing oder Proteomik können durchgeführt werden, um die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Heterogenität zu entschlüsseln.