Sortierung der

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mycel-Pellets, die von fadenförmigen Streptomyces gebildet werden, nach ihrer Größe zu sortieren, und zwar mithilfe eines COPA-Flusszytometers für große Partikel. Dies wird zunächst durch das Wachstum und anschließende Probenehmen des gewünschten Bakterienstamms erreicht. Im zweiten Schritt wird der Probenstamm mittels COPPA gemessen.

Die Daten werden anschließend in silico analysiert und die Myzel-Pellets entsprechend benutzerdefinierter Parameter sortiert. Letztlich können diese Analysen zur weiteren Charakterisierung der Heterogenität der Pelletgröße verwendet werden. Obwohl diese Methode für Streptomyces angewendet werden kann, ist sie ebenfalls auf andere Organismen wie fadenförmige Pilze übertragbar. Die Demonstration dieses Verfahrens übernimmt MaRous Petrus, ein Doktorand aus unserem Labor.

Zunächst kultivieren Sie die Ansätze, indem Sie 100 Milliliter Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium und 0,2 Milliliter einer 2,5-molaren Magnesiumchloridlösung einem sterilen 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben zusetzen, der mit Metallfedern zur Durchmischung für jede Bakterienprobe ausgestattet ist. Inokulieren Sie anschließend jeden Kolben mit 1 × 10⁸ Sporen von Streptomyces, um eine Sporenkonzentration von 1 × 10⁶ Sporen pro Milliliter zu erreichen, und kultivieren Sie die Bakterien bei 30 °C unter Schütteln mit 180 U/min. Nach zwei Tagen entnehmen Sie mithilfe einer sterilen 5-Milliliter-Pipette je eine 5-Milliliter-Probe aus jeder Kultur, wobei Sie den Kolben vorher vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Danach jede Probe in einzelne kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen abfüllen. Um die Proben mittels Copus-Analyse auszuwerten, sicherstellen, dass der Copus-Plus-Pumpen-Computer und der 488-Nanometer-Argonlaser eingeschaltet sind, und dann die Bio-Source-Software öffnen. Überprüfen, ob die Umhüllungsflüssigkeitsflasche voll und die Abfallflasche leer ist, und anschließend auf „Start“ klicken und laufen lassen.

Um den 488 Nanometer Argonlaser vom Standby- in den eingeschalteten Zustand zu wechseln, nach etwa 60 Sekunden ist der Laser betriebsbereit. Klicken Sie auf „Fertig“ und überprüfen Sie anschließend die Druckanzeigen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Druck.

Okay, und danach, nachdem das System die Durchflusszelle geprimt hat, bestätigen Sie, dass die Verzögerungseinstellung bei 11 und die Breite bei sieben liegt. Stellen Sie die Schwellenwerte auf 50 für das Signal und 40 für die minimale Flugzeit ein. Entfernen Sie dann das verbleibende Wasser aus dem Probenbehälter.

Gegeben Sie etwa 50 Milliliter PBS hinzu, und geben Sie dann 0,1 Milliliter einer der Strep-Demy-Proben in die Küvette. Stellen Sie sicher, dass die Küvette ordnungsgemäß verschlossen ist, und klicken Sie anschließend auf „Erfassen“, um mit der Datensammlung zu beginnen. Regeln Sie die Fließgeschwindigkeit so, dass zwischen 30 und 50 Ereignisse pro Sekunde erfasst werden, nachdem mindestens 2.500 Ereignisse gesammelt wurden.

Klicken, anhalten und dann speichern Sie die Daten zur anschließenden statistischen Analyse, um bakterielle Pellets für jede Probe zu sortieren. Legen Sie zunächst die Sortiergrenzen fest und geben Sie Details zu den minimalen und maximalen Flugzeitwerten ein. Alternativ wählen Sie Bereiche aus und definieren dann den Gatterbereich, um einen Bereich zur Auswahl der Pellets mit den gewünschten Abmessungen und Eigenschaften zu erstellen.

Platzieren Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen, um die Pellets zu sammeln, die den Sortierparametern entsprechen. Stellen Sie anschließend die Anzahl der zu sortierenden Pellets ein und klicken Sie manuell auf „Sortieren“, um nach den ausgewählten Parametern zu sortieren. Entfernen Sie nach dem Sortiervorgang die verbliebene Probe und spülen Sie die Probenkammer zweimal mit Wasser aus.

Bevor Sie das Gerät ausschalten, reinigen Sie die Probenkammer mit 70 % Ethanol. Führen Sie das System nun zweimal durch: einmal mit chlorhaltigem Wasser und einmal mit reinem Wasser, und leeren Sie anschließend den Überlaufbehälter. Klicken Sie nach der Reinigung auf „Stop“, um den Druck aus dem System abzulassen.

Wenn der Motor stoppt, schließen Sie das Programm und klicken Sie auf Herunterfahren, ohne zu spülen. Schalten Sie dann den Computer, die Copa, den Laser und die Pumpe streptomyces form aus. Mycel-Pellets und Flüssigkulturen, die eine breite Größenpalette aufweisen.

Um die Größenverteilung der Pellets zu analysieren, wurde eine zwei Tage alte, in Flüssigkultur gezüchtete Streptomyces cila color-Kultur einer Durchflusszytometrie für große Partikel unter Verwendung eines Copus Plus Profilers mit einer 1-Millimeter-Düse unterzogen. Hier ist ein typisches Streudiagramm des Copus-Ausgangssignals dargestellt. Die x-Achse repräsentiert die Flugzeit.

Je größer das Partikel, desto länger dauert es, bis es den Laserstrahl durchquert hat. Die Y-Achse zeigt die Extinktion an, die die optische Dichte des Objekts repräsentiert, wobei jeder Punkt einem einzelnen Partikel entspricht, das den Laserstrahl passiert. Die Auftragung der Datenpunkte in ein Histogramm zeigte, dass die Größenverteilung in dieser repräsentativen Probe nicht normalverteilt war.

Die Verteilung schien nach rechts verschoben zu sein. Auch die log-Transformation des Datensatzes führte nicht zu einer Normalverteilung. Um zu überprüfen, ob die Größenverteilung durch Annahme eines Gemischs aus zwei Normalverteilungen erklärt werden könnte, wurde die Daten mathematisch modelliert. Die Modellierung zeigte tatsächlich eine Population kleiner Pellets, die 92 % aller Pellets ausmachten und eine durchschnittliche Größe von 248 Mikrometern aufwiesen, sowie eine Population größerer Pellets, die 8 % aller Pellets umfassten und eine durchschnittliche Größe von 319 Mikrometern hatten.

Hier wird eine repräsentative Analyse von Mikrokolonien gezeigt, die aus den Populationen der großen und kleinen Pellets sortiert wurden. Die durchschnittlichen Pelletgrößen der beiden Populationen wurden verwendet, um die Grenzen für die Sortierung festzulegen, um die Sortierung von Pellets aus dem überlappenden Bereich der beiden Größenverteilungen einzuschränken: Pellets kleiner als 248 Mikrometer galten als Teil der Population der kleinen Pellets, während Pellets größer als 319 Mikrometer als Teil der Population der großen Pellets betrachtet wurden. Die mikroskopische Analyse der sortierten Pellets bestätigte deren unterschiedliche Größen nach diesem Verfahren.

Andere Methoden wie die Next-Generation-Sequenzierung oder die Proteomik können durchgeführt werden, um die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Heterogenität aufzuklären.