Name: Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Isolierung breitspektrumiger Antiviralstoffe aus chemischen Bibliotheken. Diese Methode nutzt rekombinante Masern- und Chikungunya-Viren mit Luciferase-Reporter zur Messung der Virusreplikation.

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Wir danken Dr. Yves L. Janin für seine wertvollen Kommentare und Anregungen. Wir möchten HH Gad für CHIK / Ren und C. Combredet für ihre technische Unterstützung danken. Pasteur Mala infectieuses (Programm STING zu POV-und HM-- Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur, dem Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), dem Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), dem Institut Carnot unterstützt L), der Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programm STING 2.0 auf POV) und der &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Chemical Library Project, Zuschüsse Nr. 06-222 I / R und I 09-1739 / R HM-L.). Die Arbeit an CHIKV / Ren wurde von den Projekt ArbOAS unterstützt (ANR Zuschuss-INTB 2010-1601-02).

1. Herstellung von 96-Well-Platten mit Tochter Verbindungen <ol><li> Bewegen Mutter 96 Vertiefungen-Platten, die 10 mM Stammlösungen von chemischen Verbindungen in DMSO von -20 ° C bis Raumtemperatur. 5x verdünnen Verbindungen in DMSO Zwischen 96-Well-Platten bei Verdünnung 2 mM zu erhalten. Verdünnung wird durch Pipettieren von 5 &amp;mgr; l in 20 &amp;mgr; l DMSO und Mischen gelöst. </li><li> Je 1 ul von Verdünnungsplatten in trockene Brunnen aus weißem, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese erste Reihe von Tochterplatten (D1) wird verwendet, um die Toxizität der Verbindungen bei einer Endkonzentration von 20 uM zu bewerten. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung. </li><li> Verdünnen Verbindungen wieder 1.10 durch Pipettieren von 4 ul Verdünnungsplatten in 36 ul DMSO und Mischen. Je 1 ul in trockene Brunnen aus weißen, flachen Boden, Barcode-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen. Diese zweite Gruppe von Tochterplatten (D2) wird verwendet, um die Hemmung der MV replicatio evaluierenn durch die Verbindungen in einer Endkonzentration von 2 uM. Speicher Tochterplatten bei -20 º C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Herstellung von Zellkulturen, um die Verbindung Toxizität ermitteln <ol><li> Wachsen HEK-293T-Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit stabilisierten L-Glutamin und 10% fötales Kälberserum (FCS), Streptomycin (100 ug / ml) und Penicillin (100 IU / ml). Die Zellen werden durch Trypsinierung alle 4-5 Tage passagiert und 1:10 verdünnt in einen frischen Kolben. Die Zellen sind in der log-Phase für Experimente sein. </li><li> Am Tag des Experiments zu erholen Zellen durch Trypsinierung und Zellzählung durchzuführen. Pellet-Zellen durch Zentrifugieren und Resuspendieren sie bei 3 × 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich. </li><li> Über Zellen zu einem Trog, und werden 100 ul Zellsuspension in D1-Platten, die Stachel chemische Zusammensetzungunds. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig geschüttelt, um die Sedimentation zu verhindern. </li><li> Spike Kontroll-Wells A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 und G12 mit 1 ul DMSO. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die lebenden Zellen (keine Toxizität) eingesetzt werden. Spike Kontrollvertiefungen B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 und H12 mit 1 ul DMSO und 2,5 ul einer 0,5% IGEPAL Lösung, um Zellen zu töten. Entsprechende Bohrungen werden als Referenz für die toten Zellen (hohe Toxizität) eingesetzt werden. </li><li> Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 3. Herstellung von Zellkulturen durch rMV2/Luc Infizierte <ol><li> Wachsen und wieder Zellen, wie in 2.1 und 2.2 beschrieben. Wieder resuspendieren Zellen bei 3 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium. Auffassung, daß 12,5 ml der Zellsuspension für jedes Abschirmblech erforderlich. </li><li> Optional: Ergänzung Kulturmedium mit Uridin bei 20 ug / ml. Hinweis: Bei der Kontrolle von chemischen Bibliotheken für virale replication-Inhibitoren scheint es, dass Verbindungen, die auf frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese werden häufig getrennt 13,16,27,28. Die Zugabe von Uridin Kulturmedium dazu verwendet, um solche antiviralen Moleküle. In der Tat, dies effizient wieder her, wenn die virale Replikation aufwärts Enzyme der Pyrimidin-Biosynthese sind blockiert. </li><li> Sparen 01.10 Zellsuspension für Kontrollvertiefungen mit nicht-infizierten Zellen, und fahren Sie mit der Infektion mit Restvolumen. </li><li> Tauen Sie das entsprechende Volumen von rMV2/Luc Stammlösung. MV Stammlösungen sind in der Regel bei 10 6 -10 8 infektiöse Partikel pro ml. Kultur muss mit 0,1 infektiöse Teilchen rMV2/Luc pro Zielzellen, die mit 0,1 Multiplizität der Infektion (MOI) infiziert entspricht. Hinweis: rMV2/Luc von MV-Impfstoff (Schwarz-Stamm) abgeleitet ist und in einer Umgebung BSL2 manipuliert. </li><li> Fügen Sie den Virus auf Zellsuspension und vorsichtig mischen. Übertragen infizierten Zellen zu einem Trog, und werden 100&amp;mgr; l der infizierten Zellsuspension in den Spalten 2 bis 11 der D2-Platten, die Stachel chemischen Verbindungen. Zellsuspension innerhalb der Wanne wird regelmäßig vorsichtig gemischt. </li><li> In den Spalten 1 und 12 werden 100 &amp;mgr; l nicht-infizierten Zellen ein gut auf zwei. Infizierte Zellen werden in den anderen Vertiefungen verteilt. </li><li> Zellen, Inkubation für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 4. Luciferase Aktivität Maßnahmen und Datenanalyse <ol><li> Entfernen D1 Platten aus dem Inkubator, und festzustellen, Zelllebensfähigkeit durch Zugabe von 50 ul Luciferase-basierte Lebensfähigkeit Reagenz direkt an Kultur Brunnen. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Lesen Platten mit einem Luminometer. Integrationszeit ist auf 100 ms pro auch gesetzt. </li><li> Entfernen D2 Platten aus dem Inkubator, und bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität durch Zugabe von 50 ul der Luciferase-Substrat direkt an Kultur Brunnen. Inkubation für 6 min bei Raumtemperatur, und lesen Platten mit einem Luminometer, wie beschrieüber dem Bett. </li><li> Berechnen Sie einen Z&#39;-Faktor für jede Platte D1 der Toxizität Assay, um die Qualität des Bildschirms 29 zu rechtfertigen. Z &#39;= 1-3 * (σ + σ +-) / (μ + - μ-), wobei μ und σ + + entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für HEK-293T-Zellen, die mit DMSO allein (keine Toxizität), und μ-und σ-sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen mit IGEPAL behandelt, um Zellen zu töten Kultur Brunnen. Z &#39;voraussichtlich über 0,5, oder die entsprechende Platte wird verworfen. </li><li> Stellen Toxizität Schwelle bei μ + / 2. Entsorgen Sie Verbindungen mit Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (Abbildung 3A). </li><li> Berechnen Sie einen Z&#39;-Faktor für jede D2 Platte des antiviralen Test. Hier μ + σ + und entsprechen mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für infizierte Zellen mit DMSO allein kultiviert und μ-σ-und sind mittels Lumineszenz und Standardabweichungen für nicht-infizierte Zellen. Auch Platten mit Z &amp; #39; Werte unter 0,5 werden verworfen. </li><li> Berechnen Sie die Hemmung der Virusreplikation wie folgt: Prozentsatz der Hemmung = (μ + - Luciferase-Aktivität für die Verbindung X) / (μ + - μ-) * 100. Stellen Hemmschwelle bei 75%, und wählen Sie Verbindungen, die sowohl reduzieren Lumineszenz-Werte unter diesem Cut-off (3B) und sind nicht giftig nach in 4.4 beschriebenen Kriterien. </li></ol> 5. Sekundärbildschirm Toxizität und Breitspektrum antiviralen Aktivität <ol><li> Stellen serielle 1:2 Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung in DMSO, ausgehend von 500 um bis 4 um (8 Verdünnungen). Füllen weiß, Barcode-Gewebekulturplatten mit 50 &amp;mgr; l Kulturmedium. 1 ul jeder Verbindung Verdünnung in Kulturvertiefungen. Zweimal wiederholen bis 3 Kulturplatten mit doppelten serielle Verdünnungen für jeden Treffer Verbindung haben. </li><li> Vorbereitung 37,5 ml einer HEK-293T-Zellsuspension bei 6 x 10 5 Zellen / ml in Kulturmedium, wie oben beschrieben (2.1 und 20,2). Dispense 2x 12,5 ml in Falcon-Röhrchen und infizieren Zellen entweder mit rMV2/Luc bei MOI = 0,1 oder rekombinanten CHIKV Renilla-Luciferase (CHIKV / Ren) Expression bei MOI = 0,2. Mischen durch Umdrehen. Hinweis: CHIKV / Ren ist aus einem Wildtyp-Stamm von CHIKV abgeleitet und sollte daher in einem BSL3 Umgebung manipuliert werden. Die Platten können aus BSL3 zu BSL1 einmal bewegt Renilla Substrat zur Kultur Brunnen hinzugefügt werden (siehe unten). </li><li> Geben Sie 50 ul von nicht-infizierten, rMV2/Luc-infected oder CHIKV / Ren-infizierten Zellen in Kulturplatten mit seriellen Verdünnungen von Hit-Verbindungen. Inkubiere 24 Stunden bei 37 ° C. </li><li> In 50 ul von Firefly Luziferase-Substrat zu Firefly Luziferase Aktivität in rMV2/Luc-infected Brunnen zu bestimmen. In 50 ul Renilla Luciferase Substrat Renilla Luciferase-Aktivität in CHIKV / Ren-infizierten Brunnen zu bestimmen. Schließlich, fügen Sie 50 ul Luciferase-Assay-Reagenz basiert Lebensfähigkeit zu nicht-infizierten Zellen zu Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. </li><li> Grundstücksdaten (Figure 4) und bestimmen getroffen Verbindung Konzentrationen, die MV-Replikation hemmen und CHIKV um 50%. Ignorieren Verbindung zeigt einige Toxizität in diesem Test. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier beschriebene Screening-Pipeline zielt auf die Auswahl-Verbindungen mit einem geeigneten Profil als Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren. Wenn eine Bibliothek von 10.000 Verbindungen wurde mit diesem Protokoll und oben erwähnten Filterkriterien angewendet wurden untersucht, dh die Hemmung der MV-Replikation überlegen 75%, 40 Verbindungen (0,4%) als positiv. Dabei etwa die Hälfte von ihnen zeigten eine Toxizität in der Luciferase-Basis-Lebensfähigkeitstest, und wurden deshalb nicht berücksichtigt. Sch...

RNA-Viren sind für eine Vielzahl von Infektionen beim Menschen verantwortlich und haben einen großen Einfluss auf die Bevölkerung weltweit, sowohl in Bezug auf die öffentliche Gesundheit und wirtschaftliche Kosten. Effizienten Impfstoffen gegen verschiedene menschliche RNA-Viren entwickelt worden und werden weithin als prophylaktische Behandlungen. Es besteht jedoch immer noch ein Mangel an kritischen therapeutische Arzneimittel gegen RNA-Virus-Infektionen. Tatsächlich sind effiziente Impfstoffe nicht verfügbar gegen wichtige menschliche Krankheitserreger wie Dengue-Virus, Hepatitis-C-Virus oder humanen Respiratory-Syncytial-Virus (HRSV). Außerdem sind RNA-Viren, die für die Mehrheit der neu auftretenden Krankheiten, die in der Frequenz wegen der globalen Austausch und menschlichen Auswirkungen auf ökologische Systeme erhöht haben verantwortlich. Gegen diese Bedrohung, die RNA-Viren darstellen, ist unser therapeutisches Arsenal äußerst begrenzt und relativ ineffizient 1-3. Gegenwärtige Therapien beruhen im wesentlichen auf rekombinanten Typ I-Interferone (IFN-α / β), um angeborene Immunität stimulieren basiert,oder die Verabreichung von Ribavirin. Obwohl die Wirkungsweise dieser Ribonukleosid analogen umstritten ist und wahrscheinlich von mehreren Mechanismen, der Hemmung der zellulären IMPDH (Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase), die die intrazelluläre GTP-Pools erschöpft ist eindeutig erforderlich 4. Ribavirin in Kombination mit pegyliertem IFN-α, ist die Haupt Behandlung gegen Hepatitis C-Virus. Allerdings sind die relativ geringe Wirksamkeit in vivo gegen die meisten RNA-Viren IFN-α / β und Ribavirin Behandlungen, wie sie effizient stumpfen IFN-α / β Signaltransduktion durch Expression von Virulenzfaktoren 5 und oft entkommen Ribavirin 3. Dieser Mehr der Tatsache, dass Ribavirin Behandlung wichtiger Fragen Toxizität erhöhen, obwohl es vor kurzem gegen schwere Krankheit mit HRSV umstrittene Vorteile 6 genehmigt wurde. In jüngerer Zeit sind einige virusspezifischen Behandlungen wurden vermarktet, insbesondere gegen Influenzavirus mit der Entwicklung of Neuraminidase-Hemmer 3. Die große Vielfalt und dauerhafte Auftreten von RNA-Viren verhindert jedoch die Entwicklung von spezifischen Behandlungen gegen jeden von ihnen in relativ naher Zukunft. Insgesamt unterstreicht dies die Notwendigkeit für eine effiziente Strategien, um in der nahen Zukunft zu identifizieren und zu entwickeln, starke antivirale Moleküle. Es ist trivial zu sagen, dass ein Breitspektrum-Inhibitor aktiv gegen eine große Gruppe von RNA-Viren würde dieses Problem lösen. Obwohl ein solches Molekül ist immer noch ein Virologe Traum, unser besseres Verständnis der zellulären Abwehrmechanismen und angeborene Immunsystem nahe, dass einige Möglichkeiten gibt es 7,8. Mehrere akademischen und industriellen Laboratorien versuchen nun, Moleküle, die bestimmte Aspekte der zellulären Abwehrmechanismen oder Stoffwechselwege, die virale Replikation stumpf zu stimulieren. Obwohl solche Verbindungen wahrscheinlich zeigen erhebliche Nebenwirkungen, werden Behandlungen gegen akute Virusinfektionen zu verabreichened für eine relativ kurze Zeit, so dass sie trotz einer möglichen Toxizität auf lange Sicht akzeptabel. Verschiedene Strategien wurden entwickelt, um solche Breitspektrum-antiviralen Moleküle zu identifizieren. Einige Forschungsprogramme zielen auf die Suche nach Molekülen, die spezifische Abwehr oder Stoffwechselwege abzielen. Dazu gehören zum Beispiel Krankheitserreger Erkennungsrezeptoren auf eine antivirale Genexpression 9 entlocken und aktivieren antiviralen Faktoren wie RNaseL 10, Autophagie Maschinen Virus Abbau 11 zu fördern, Nucleosidsynthese Pfade 12,13, oder apoptotischen Kaskaden zum Tod von Virus-infizierten Zellen ausfallen 14. Andere Gruppen haben phänotypische Bildschirme, die nicht ziel basieren 13,15-17 entwickelt. In diesem Fall werden die antivirale Moleküle einfach durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, um die virale Replikation in einem gegebenen zellularen Systems blockieren. Die allgemeine Annahme ist, dass eine Verbindung Hemmung 2-3 unabhängigen RNA-Viren wäre ein geeignetes Profil für eine breit spectrum antiviralen Moleküls. Die Wirkungsweise der Trefferverbindungen mit einer solchen empirischen Ansatz gewählt wird erst in einem zweiten Zeitpunkt bestimmt und schließlich kann die Identifizierung von neuartigen zellulären Ziele für antivirale Medikamente führen. Interessant ist, dass eine retrospektive Analyse der von der US Food and Drug Administration zwischen 1999 und 2008 zugelassenen neuen Medikamenten hat gezeigt, dass im Allgemeinen, wie phänotypischen Screenings tendenziell besser als zielorientierte Ansätze durchführen, um first-in-class, niedermolekulare Medikamente 18 entdecken . Virusreplikation in Hochdurchsatz-Assays auf Zellbasis wird in der Regel von Virus zytopathische Effekte bestimmt. Zellen infiziert und in 96 - oder 384-Well-Platten in Gegenwart der getesteten Verbindungen. Nach einigen Tagen werden die Zellschichten fixiert und mit Farbstoffen, wie Kristallviolett gefärbt. Schließlich wird die Absorption mit einem Plattenlesegerät und Verbindungen Hemmung der viralen Replikation durch ihre Fähigkeit identifiziert, die Zellschichten her erhalten bestimmtm-Virus-induzierten zytopathischen Effekt. Alternativ werden viral-vermittelte zytopathischen Effekte mit Standard Lebensfähigkeit Assays wie MTS Reduktion beurteilt. Solche Assays sind hoch handhabbar und kostengünstig, aber leiden unter drei Hauptbeschränkungen. Erstens erfordern sie eine Virus-Zell-Kombination, bei der die virale Replikation ist zytopathischen in nur wenigen Tagen, aber dies ist nicht immer möglich, so fordern alternative Ansätze 19. Zweitens sind sie schlecht quantitative da sie auf einer indirekten Messung der Virusreplikation basiert. Schließlich können toxische Verbindungen wie positive Treffer erzielt werden und müssen daher mit einer Gegen Bildschirm messen Zelllebensfähigkeit beseitigt werden. Um einige dieser Hürden zu überwinden, wurden rekombinante Viren oder Replikons durch reverse Genetik entwickelt worden, Reporterproteine, wie EGFP oder Luciferase exprimieren, aus einer weiteren Transkriptionseinheit oder in Rahmen mit Virusprotein-Gene (einige Beispiele 20-23). Wenn diese Viren replizieren, Reporter proteins zusammen mit viralen Proteine ​​selbst hergestellt. Dies stellt eine sehr quantitative Assay die virale Replikation Messung und Bewertung der inhibitorischen Aktivität des Kandidaten-Moleküle. Dies gilt insbesondere für rekombinante Viren, die Luciferase (oder andere Enzyme, die Biolumineszenz), da dies Reportersystem weist einen weiten Dynamikbereich mit einer hohen Empfindlichkeit und praktisch ohne Hintergrund. Darüber hinaus gibt es keine Anregungslichtquelle, wodurch Interferenzen mit 24 Fluoreszenzverbindung. Hier haben wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Protokoll auf chemische Bibliotheken für Breitspektrum-Inhibitoren der RNA-Viren zu untersuchen. Die Verbindungen werden zuerst auf menschliche Zellen mit einem rekombinanten Masernvirus (MV) zum Ausdruck Firefly Luziferase 25 (rMV2/Luc, Bild 1, primären Bildschirm) infiziert getestet. MV gehört zu bestellen Mononegavirales und wird oft als eine prototypische Mitglied der Negativstrang RNA-Virus alsEs. Als solches ist MV-Genom als Matrize durch die virale Polymerase verwendet, um mRNA-Molekülen codiert für virale Proteine ​​zu synthetisieren. In dem rekombinanten MV-Stamm genannt rMV2/Luc wird die Luciferase-Expression von einer zusätzlichen Transkriptionseinheit zwischen P und M-Gene (Fig. 2A) einge ausgedrückt. Parallel Verbindungen für ihre Toxizität auf menschlichen Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Luciferase-Reagens, das, zur Quantifizierung von ATP getestet, die Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in Kultur (Fig. 1, primären Bildschirm). Gesamte chemischen Bibliotheken lassen sich mit diesen beiden Tests, um Verbindungen, die nicht giftig sind und MV-Replikation effizient zu blockieren wählen abgeschirmt werden. Dann werden Treffer für Dosis-Wirkungs-Hemmung der MV-Replikation, das Fehlen von Toxizität als auch für ihre Fähigkeit, Chikungunya-Virus (CHIKV) Replikation (Abbildung 1, sekundären Bildschirm) beeinträchtigen erneut getestet. CHIKV ist ein Mitglied der Familie und Togaviridae sein Genom ist apositive Einzelstrang-RNA-Molekül. Als solches ist es völlig unabhängig von Masern und Verbindungen Hemmung sowohl MV und CHIKV stehen eine große Chance, eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. CHIKV Nicht-Strukturproteine ​​werden von dem viralen Genom übersetzt, während Strukturproteine ​​werden durch Transkription und Translation einer subgenomischen mRNA-Molekül kodiert. Unsere in vitro-Assay für die Replikation CHIKV auf einem rekombinanten Stamm genannt CHIKV / Ren, die Renilla-Luciferase-Enzym als gespaltenen Teil der Nicht-Struktur Polyprotein durch eine Einsetzöffnung des Reportergens zwischen nsP3 und nsP4 Sequenzen 26 (Fig. 2B) auf der Basis drückt. Das Maß der Renilla-Luciferase-Aktivität erlaubt die Überwachung der viralen Replikation in einem frühen Stadium des Lebenszyklus CHIKV. Das Hochdurchsatz-Protokoll wurde verwendet, um schnell Verbindungen zu identifizieren mit einem geeigneten Profil für Breitspektrum antiviralen Medikamenten in einer kommerziellen Bibliothek von 10.000 MoleModule für die chemische Vielfalt bereichert. Die Verbindungen wurden im Wesentlichen folgende Lipinski-Regel von fünf, mit Molekulargewichten im Bereich von 250 bis 600 Dalton und log D-Werten unter 5. Die meisten dieser Moleküle wurden neue chemische Wirkstoffe in anderen kommerziellen Bibliotheken nicht verfügbar sind.

<table><tbody><tr><td>Freedom EVO-Plattform</td><td>TECAN</td><td></td><td>Roboterplattform</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatten aus Polystyrol-Zellkulturen, weiß</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>Luciferase-basierter Viabilitätsassay</td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Reagenz mit Glühwürmchen-Luziferase Substrat</td></tr><tr><td>Renilla-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td>Reagenz mit Renilla Luciferase Substrat</td></tr><tr><td>Britelite plus Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6016761</td><td>Reagenz mit Glühwürmchen-Luziferase Substrat. Kann als Alternative zum Brigh-Glo-Reagenz verwendet werden, um die Luziferase-Aktivität zu bestimmen.</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening für breitspektrum-chemische inhibitoren der rna-viren

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA-Viren sind für die wichtigsten Krankheiten wie Grippe, Bronchitis, Dengue-Fieber, Hepatitis C oder Masern verantwortlich. Sie stellen auch eine neue Bedrohung wegen der erhöhten weltweiten Austausch und die menschlichen Populationen durchdringen mehr und mehr natürliche Ökosysteme. Ein gutes Beispiel für eine solche Situation ist Schwellen Chikungunya-Virus-Epidemien von 2005-2006 in den Indischen Ozean. Jüngsten Fortschritte im Verständnis der zellulären Wege Steuern virale Replikation zeigen, dass Verbindungen, die auf Wirtszellfunktionen anstatt das Virus selbst, könnte eine große Gruppe von RNA-Viren hemmen. Einige antiviralen Breitband-Verbindungen mit Host-zielorientierte Tests identifiziert worden. Aber die Hemmung der Virusreplikation in Zellkulturen unter Verwendung von Reduktion der cytopathischen Effekte als Auslese immer noch eine überragende Screening-Strategie. Solche funktionellen Bildschirme wurden durch die Entwicklung von rekombinanten Viren Reporter exprimieren verbesserter Enzyme ca.Pable der Biolumineszenz wie Luciferase. In dem vorliegenden Bericht haben wir detailliert eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die rekombinanten Masern-und Chikungunya-Viren mit zellulären Lebensfähigkeitstests kombiniert, um Verbindungen mit einem antiviralen Breitband-Profil zu identifizieren.

Dieses Screening-Pipeline setzt zunächst auf die Auswahl von Verbindungen, die MV-Replikation hemmen und keine signifikante zelluläre Toxizität (Abbildung 1, primären Bildschirm) nicht zeigen. Es nutzt Luciferase-basierte Assays zur Zelltoxizität und die Hemmung der viralen Replikation zu bestimmen. Alle Pipettierschritte und Datenerfassung in einem Hochdurchsatzeinstellung mit einer Roboter-Plattform ausgeführt werden. Zytotoxizität von Verbindungen unter Verwendung eines L...

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Breitbandantiviratika aus chemischen Bibliotheken mithilfe einer Kombination aus zellbasierten In-vitro-Assays zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Verbindungen ausgewählt werden, die die In-vitro-Vermehrung eines rekombinanten Stammes des Masernvirus hemmen, der Luciferase als Reporter kodiert. Parallel dazu wird die Toxizität der Verbindung mithilfe eines auf Luciferase basierenden Vitalitätsassays geschätzt.Die kombinierten phänotypischen Daten aus beiden Assays werden zur Isolierung von HIT-Molekülen verwendet. Die abschließenden Schritte bestehen darin, die HIT-Verbindungen erneut auf Dosis-Wirkungs-Kurven zur Replikationshemmung von Masern- und Chikungunya-Virus zu testen und die in-vitro-Toxizität genauer zu bestimmen. Letztendlich werden breitbandwirksame antivirale Verbindungen durch den Screen identifiziert und validiert.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie standardmäßigen Virusvermehrungsassays, die auf zytopathischen Effekten basieren, liegt darin, dass sie Lumineszenz als Nachweismethode verwendet und zwei stark voneinander abweichende Viren kombiniert, die Luciferase als Reportergen exprimieren. Die Durchführung des Verfahrens wird Olivier Helynck, ein Techniker aus dem Team von Helene Munier-Lehmann, sowie Marianne Lucas-Hourani, eine Ingenieurin, die gemeinsam mit mir in der Forschungsgruppe von Frédéric Tangy arbeitet, demonstrieren.Erwärmen Sie zunächst die 96-Loch-Mutterplatten, die 10-Millimolar-Stammlösungen chemischer Verbindungen in DMSO enthalten, auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 5 µL jeder Verbindung in neue 96-Loch-Platten, die bereits 20 µL DMSO pro Loch enthalten, um so Verdünnungsplatten herzustellen. Pipettieren Sie anschließend 1 µL dieser Verdünnungsplatten in trockene Löcher weißer, mit Barcode versehener 96-Loch-Zellkulturplatten.Dies sind die D-Eins-Platten, die zur Bewertung der Toxizität von Verbindungen bei 20 Mikromolar verwendet werden. Lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Stellen Sie nun neue Platten aus den Verdünnungs-Zwischenplatten her, die zusätzlich 10-fach verdünnt werden.Entnehmen Sie vier Mikroliter jeder verdünnten Verbindung und mischen Sie sie in Vertiefungen mit 36 Mikrolitern DMSO. Überführen Sie aus diesen Platten je ein Mikroliter pro Probe in trockene Vertiefungen weißer, flachbodiger, barcodierter Gewebekultur-96-Well-Platten.Dies sind die D-Zwei-Platten, die zur Beurteilung der Hemmung der MV-Replikation verwendet werden. Lagern Sie sie ebenfalls bei minus 20 Grad Celsius.Züchten Sie HEK-293-T-Zellen in supplementiertem DMEM mit stabilisiertem L-Glutamin. Passagieren Sie die Zellen alle vier bis fünf Tage mittels Trypsin und verdünnen Sie sie im Verhältnis 1:10 in frische Kolben.Während der logarithmischen Wachstumsphase die Zellen für das Experiment sammeln und zählen. Die Zellen in einer Konzentration von 300.000 Zellen pro Milliliter resuspendieren. Für jede Platte, die untersucht werden soll, werden 12,5 Milliliter Zellen in dieser Verdünnung benötigt.Bereiten Sie nun die Platten vor. Geben Sie in einen Satz von Kontrollwells jeweils ein Mikroliter DMSO. Geben Sie in einen zweiten Satz von Kontrollwells jeweils ein Mikroliter DMSO und 2,5 Mikroliter einer 0,5%igen IGEPAL-Lösung, um die Zellen abzutöten. Überführen Sie die Zellsuspension in einen Vorratsbehälter und geben Sie jeweils 100 Mikroliter in jede Vertiefung der D-one-Platten.Rühren Sie die Suspension regelmäßig um, um eine Sedimentation zu vermeiden. Inkubieren Sie die vorbereiteten Platten anschließend 24 Stunden lang. Bereiten Sie die Zellen für die Platten wie im vorherigen Abschnitt beschrieben vor. Das Kulturmedium kann mit Uridin ergänzt werden, um antivirale Substanzen auszuschließen, die die frühen Schritte der Pyrimidinbiosynthese hemmen, da diese relativ häufig vorkommen. Heben Sie ein Zehntel der Zellsuspension für die Kontrollgefäße mit nicht infizierten Zellen auf und infizieren Sie das verbleibende Volumen. Tauen Sie ausreichend rMV2-luc-Stammlösung auf, um die Kultur mit 0,1 infektiösen Partikeln pro Zielzelle für eine Multiplizität der Infektion von 0,1 zu infizieren. Geben Sie das berechnete Volumen des Virus zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie vorsichtig. Überführen Sie die infizierten Zellen in einen Vorratsbehälter und geben Sie jeweils 100 Mikroliter infizierter Zellen in die D-zwei-Platten. Ziel sind die Spalten zwei bis elf, die die gespikten chemischen Verbindungen enthalten, sowie die positiven Kontrollgefäße in den Spalten eins und zwölf. Mischen Sie die Zellen im Vorratsbehälter regelmäßig und vorsichtig. In abwechselnden Reihen der Spalten eins und zwölf geben Sie jeweils 100 Mikroliter nicht infizierter Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Platten anschließend 24 Stunden lang.Nach der Inkubationszeit die Vitalität der Zellen in der D-one-Platte bestimmen. 50 Mikroliter Luciferase-basierten Vitalitätsreagenz in jede Vertiefung geben und 10 Minuten warten. Anschließend die Platten mit einem Luminometer auslesen. Die Integrationszeit auf 100 Millisekunden pro Vertiefung einstellen.Als Nächstes bestimmen Sie die MV-Replikation in den D-zwei-Platten, indem Sie 50 Mikroliter Firefly-Luciferase-Substrat in jede Vertiefung geben und sechs Minuten bei Raumtemperatur warten. Anschließend überprüfen Sie einen Z-Faktor für jede D-eins- und D-zwei-Platte des Toxizitätsassays. Fahren Sie fort, indem Sie die Hemmung der Virusreplikation berechnen. HIT-Verbindungen sind solche, die die Virusreplikation unter den festgelegten Grenzwert senken und nicht toxisch sind.Für jede HIT-Verbindung stellen Sie serielle Verdünnungen in DMSO her, beginnend bei 500 Mikromolar und in Halbstufen bis hinunter zu vier Mikromolar entlang einer Spalte einer 96-Loch-Platte. Geben Sie ein Mikroliter aus der Verdünnungsplatte der Verbindung in die weiß markierte, mit Strichcode versehene Zellkulturplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um einen Triplikat-Satz von Testplatten zu erstellen. Füllen Sie anschließend die Zellkulturplatten mit 50 Mikrolitern Kulturmedium auf. Bereiten Sie nun 37,5 Milliliter HEK-293T-Zellen vor, die in supplementiertem DMEM bei 600.000 Zellen pro Milliliter suspendiert sind.Füllen Sie zwei 15-Milliliter-Röhrchen jeweils mit 12,5 Milliliter der Zellsuspension. Infizieren Sie ein Röhrchen mit Zellen mit rMV2/luc bei einer Multiplizität der Infektion von 0,1. Infizieren Sie das zweite Röhrchen mit Zellen mit einem rekombinanten chikV, das Renilla-Luciferase exprimiert. Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion von 0,2. Mischen Sie beide Röhrchen mit virusinfizierten Zellen durch Vorsichtiges Umstülpen. Dies sollte in einem Biosicherheitslabor der Stufe drei erfolgen, aufgrund der Pathogenität von chikV.Laden Sie nun die nicht infizierten Zellen und die Sätze der infizierten Zellen in ihre eigenen Sätze von HIT-Verbindungsplatten.Geben Sie 50 Mikroliter Zellen pro Vertiefung ab und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag geben Sie 50 Mikroliter Firefly-Luciferase zu jeder Vertiefung mit rMV2/luc-infizierten Zellen hinzu. Ebenso geben Sie 50 Mikroliter Renilla-Lucifer-Substrat zu den mit ChikV-Ren infizierten Zellen hinzu. Zu den nicht infizierten Kontrollzellen geben Sie 50 Mikroliter eines auf Luciferase basierenden Vitalitätsreagenz hinzu. Bestimmen Sie anschließend die Konzentrationen der HIT-Verbindungen, die die Replikation von MV und ChikV um 50 % hemmen. Verwerfen Sie außerdem Verbindungen, die zelluläre Toxizität zeigen. Diese Screening-Pipeline basiert auf der Auswahl von Verbindungen, die keine signifikante zelluläre Toxizität aufweisen und sowohl die Replikation von MV als auch die von ChikV hemmen, wie in den primären und sekundären Screenings festgestellt. Sie nutzt rekombinante Viren, die Feuer- oder Renillaluciferase als Reporter exprimieren. Die Toxizität von Verbindungen wird mithilfe eines kommerziellen auf Luciferase basierenden Assays bewertet, bei dem die Lumineszenz mit der Anzahl lebender Zellen korreliert. Auf dieser Platte wurden 21 Verbindungen basierend auf einer durch die positiven Kontrollbrunnen festgelegten Schwelle als toxisch eingestuft.Die antivirale Aktivität wurde zunächst mithilfe von rMV2/luc gemessen. Die Lumineszenz wurde mit der Grenze der Kontrollbrunnen verglichen. Dabei zeigte sich, dass vier Verbindungen die virale Replikation um mehr als 75 % hemmen konnten. In einem anderen Test erwiesen sich zwei dieser Verbindungen als toxisch. Für alle HIT-Verbindungen wurde die halbmaximale Hemmkonzentration sowohl für das MV- als auch für das ChikV-RNA-Virus, die beide Luciferase exprimieren, bestimmt. Diese beiden Viren sind nicht verwandt, wodurch der Test robuster wird. Parallel dazu wurde die fehlende zelluläre Toxizität ausgewählter Verbindungen in einem Dosis-Wirkungs-Experiment bestätigt.Insgesamt wurden 13 nichttoxische Verbindungen aus einer chemischen Bibliothek mit 10.000 Molekülen identifiziert. Diese Verbindungen waren sowohl hinsichtlich ihrer chemischen Struktur als auch ihrer biologischen Aktivität neuartig. Basierend auf strukturellen Ähnlichkeiten konnten die Verbindungen drei chemischen Familien zugeordnet werden. Zum Vergleich wurden die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration mit Brequinar, einer Substanz mit starker antiviraler Aktivität, ermittelt. Bei Betrachtung dieser Werte zeigte sich, dass weniger als eine Größenordnung das Referenzmolekül von den aktivsten HITs trennte, die mittels des Screenings identifiziert wurden. Dies verdeutlicht die vergleichsweise starke antivirale Aktivität der ausgewählten Verbindungen. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um große chemische Bibliotheken im Hochdurchsatzverfahren zu screenen und Gruppen kleiner Moleküle anzureichern, die breitbandige Antivirale aufweisen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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