Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, antivirale Breitbandmedikamente aus chemischen Bibliotheken unter Verwendung einer Kombination von in vitro zellbasierten Assays zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Verbindungen ausgewählt werden, die die In-vitro-Replikation eines rekombinanten Masernvirusstamms hemmen, der Luzifere als Reporter kodiert. Parallel dazu wird die Toxizität der Verbindung mit einem Luciferase-basierten Viabilitätsassay abgeschätzt.

Die kombinierten phänotypischen Daten aus beiden Assays werden zur Isolierung von HIIT-Molekülen verwendet. Die letzten Schritte bestehen darin, die HIIT-Verbindungen erneut auf Dosis-Wirkungs-Replikation, Hemmung von Masern und Hühner-Guna-Viren zu testen und die In-vitro-Toxizität genauer zu messen. Letztendlich werden antivirale Breitbandverbindungen identifiziert und durch das Screening validiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Standard-Virusreplikationsassays, die auf zytopathischen Effekten basieren, besteht darin, dass sie Lumineszenz als Auslesung verwendet und mit stark divergierenden Viren kombiniert, die Luciferase als Reporter exprimieren. Olivier Ellan, ein Techniker aus dem El Niemans-Team, und Marianne Luca Ori, eine Ingenieurin, die mit mir in der Forschungseinheit von Fredrik JI zusammenarbeitet, werden das Verfahren vorführen. Die 96-Well-Mutterplatten enthalten 10 millimolare Stammlösungen chemischer Verbindungen in DMSO.

Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verbindung auf neue 96-Well-Platten mit bereits 20 Mikrolitern DMSO in jeder Well, wodurch Zwischenverdünnungsplatten erstellt werden. Spritzen Sie nun einen Mikroliter dieser Verdünnungsplatten in trockene Vertiefungen mit weißer Barcode-Gewebekultur. 96-Well-Platten.

Dies sind die D-1-Platten und werden verwendet, um die Toxizität von Verbindungen bei 20 Mikromolaren zu bewerten. Lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Stellen Sie nun aus den Zwischenverdünnungsplatten neue Platten her, die 10-fach weiter verdünnt werden.

Nehmen Sie vier Mikroliter jeder verdünnten Verbindung und mischen Sie sie in Vertiefungen mit 36 Mikrolitern DMSO. Von diesen Platten wird ein Mikroliter pro Probe in trockene Vertiefungen mit weißer Gewebekultur mit flachem Boden mit Barcode überführt. 96-Well-Platten.

Dies sind die beiden D-Platten, die zur Bewertung der Hemmung der MV-Replikation verwendet werden. Lagern Sie sie ebenfalls bei minus 20 Grad Celsius. Alle vier bis fünf Tage werden HEK 2 93 T-Zellen in supplementiertem DMM mit stabilisiertem L-Glutamin gezüchtet, die Zellen durch Trypsin geleitet und eine 10. Verdünnung in frische Kolben vorgenommen.

Sammeln und zählen Sie die Zellen während ihrer logarithmischen Wachstumsphase für das Experiment. Resuspendieren Sie die Zellen bei 300.000 Zellen pro Milliliter. Für jede Platte, die gescreent werden soll, werden 12,5 Milliliter Zellen in dieser Verdünnung benötigt.

Bereiten Sie nun die Platten vor und spießen Sie einen Satz Kontrollvertiefungen mit einem Mikroliter DMSO. Spießen Sie einen zweiten Satz von Kontrollwells mit einem Mikroliter DMSO und 2,5 Mikrolitern einer 0,5%igen ipol-Lösung, um die Zellen abzutöten. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen Trog und geben Sie 100 Mikroliter in jede Vertiefung der D one Platten.

Rühren Sie die Suspension regelmäßig um, um Ablagerungen zu vermeiden. Dann die vorbereiteten Platten 24 Stunden lang inkubieren. Bereiten Sie die Zellen für die Platten vor, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

Das Kulturmedium kann mit Uridin ergänzt werden, um antivirale Moleküle herauszufiltern, die auf die frühen Schritte der Pyrimidin-Biosynthese abzielen, da diese recht häufig vorkommen. Bewahren Sie ein Zehntel der Zellsuspension für die Kontrollvertiefungen mit nicht infizierten Zellen auf und infizieren Sie das verbleibende Volumen. Tauen Sie genug auf.

RMV zwei luxuriöse Stammlösung, um die Kultur mit 0,1 infektiösen Partikeln pro Zielzelle für eine 0,1-Multiplizität der Infektion zu infizieren. Geben Sie das berechnete Virusvolumen in die Zellsuspension und mischen Sie es vorsichtig. Übertragen Sie die infizierten Zellen in einen Trog und geben Sie 100 Mikroliter infizierter Zellen auf die beiden D-Platten.

Die Spalten zwei bis 11, die die dotierten chemischen Verbindungen enthalten, und die positiven Kontrollvertiefungen in den Spalten eins und 12 sind regelmäßig anzuvisieren. Mischen Sie die Zellen im Trog vorsichtig in abwechselnden Reihen der Spalten eins und 12 und geben Sie 100 Mikroliter nicht infizierte Zellen ab. Inkubieren Sie nun die Platten für 24 Stunden.

Bestimmen Sie nach der Inkubationszeit die Lebensfähigkeit der D-Einplattenzellen. Mischen Sie 50 Mikroliter Luciferase-basiertes Viabilitätsreagenz in jede Vertiefung und warten Sie 10 Minuten. Dann lesen Sie die Platten mit einem Luminometer ab.

Legen Sie die Integrationszeit auf 100 Millisekunden pro Vertiefung fest. Bestimmen Sie als Nächstes die MV-Replikation in den beiden D-Platten, indem Sie 50 Mikroliter Glühwürmchen-Luzifer-Substrat in jede Vertiefung mischen und sechs Minuten bei Raumtemperatur warten. Konsultieren Sie dann einen Z-Faktor für jede D-Eins- und D-Zwei-Platte des Toxizitätsassays.

Fahren Sie fort, indem Sie die Hemmung der Virusreplikation berechnen. Hi-Verbindungen sind solche, die die Virusreplikation unter den angewendeten Grenzwert reduzieren und nicht für jede HI-Verbindung toxisch sind. Führen Sie serielle Verdünnungen in DMSO durch, beginnend bei 500 Mikromolaren und in halben Schritten bis hinunter zu vier Mikromolaren entlang einer Säule einer 96-Well-Platte, fügen Sie einen Mikroliter von der Verdünnungsplatte der Verbindung auf die weiße Gewebekulturplatte mit Barcode hinzu.

Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um einen dreifachen Satz Testplatten zu erstellen. Füllen Sie anschließend Gewebekulturplatten mit 50 Mikrolitern Nährmedium. Bereiten Sie nun 37,5 Milliliter HEK 2 93 T-Zellen vor, suspendiert in supplementiertem TM EM bei 600.000 Zellen pro Milliliter.

Beladen Sie zwei 15-Milliliter-Röhrchen mit 12,5 Millilitern der Zellsuspension. Jeder infiziert ein Röhrchen mit Zellen mit RMV, zwei Luke bei einer Infektionsmultiplizität von 0,1. Infizieren Sie das zweite Zellröhrchen mit rekombinantem Schnittlauch, der Vanilleluzifer exprimiert.

Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion von 0,2. Mischen Sie beide Röhrchen mit virusinfizierten Zellen durch Inversion. Dies sollte in einem Labor der Biosicherheitsstufe drei durchgeführt werden, da die Pathogenität des Schnittlauchs nun die nicht infizierten Zellen und die Gruppen infizierter Zellen in ihren eigenen Satz von HIIT-Verbindungsplatten lädt.

Geben Sie 50 Mikroliter Zellen pro Vertiefung ab und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie am nächsten Tag 50 Mikroliter Glühwürmchen-Luziferase in jede Vertiefung von RMV-infizierten Zellen. In ähnlicher Weise fügen Sie 50 Mikroliter ran vanilla Lucifer Substrat zu den mit Chick V Ren infizierten Zellen zu den nicht infizierten Kontrollzellen hinzu und fügen Sie 50 Mikroliter Kreuzblütler Basenlebensfähigkeit hinzu.

Fahren Sie mit dem Reagenz fort, indem Sie die Konzentrationen von Hi-Verbindungen bestimmen, die die MV- und Chick V-Replikation um 50 % hemmen. Diese Screening-Pipeline beruht auf der Auswahl von Verbindungen, die keine signifikante zelluläre Toxizität aufweisen und sowohl die MV- als auch die Chick V-Replikation hemmen, wie im primären bzw. sekundären Screening bestimmt, sie nutzt rekombinante Viren, die Glühwürmchen exprimieren, oder Vanilla-Luzifer. Als Reporter.

Die Toxizität der Verbindungen wird mit einem kommerziellen, auf Luziferen basierenden Assay bewertet, bei dem die Lumineszenz mit lebenden Zellen auf dieser Platte korreliert. 21 Verbindungen wurden auf der Grundlage eines von den Positivkontrollwells festgelegten Schwellenwerts als toxisch eingestuft. Die antivirale Aktivität wurde zuerst mit RMV two gemessen.

Luke Lumineszenz wurde mit dem Grenzwert verglichen, der von Kontrollbohrungen festgelegt wird. Hier wurde festgestellt, dass vier Verbindungen in der Lage waren, die virale Replikation um mehr als 75 % zu hemmen. Zwei davon erwiesen sich als giftig für alle HIIT-Verbindungen.

Die halbmaximale Hemmkonzentration wurde sowohl auf MV- als auch auf Chick VRNA-Viren bestimmt, die Luciferase exprimieren. Diese beiden Viren sind nicht miteinander verwandt und machen den Bildschirm somit robuster. Parallel dazu wurde das Fehlen einer zellulären Toxizität ausgewählter Verbindungen in einem Dosis-Wirkungs-Experiment bestätigt.

Insgesamt wurden 13 nicht-toxische Verbindungen aus einer chemischen Bibliothek von 10.000 Molekülen identifiziert. Diese Verbindungen waren sowohl in Bezug auf die chemische Struktur als auch auf die biologische Aktivität neu. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten fielen die Verbindungen in drei chemische Familien.

Als Referenz wurden halbe maximale Hemmkonzentrationswerte mit einer Substanz mit starker antiviraler Aktivität erhalten. Wenn man sich diese Werte ansieht, trennt weniger als eine Größenordnung das Referenzmolekül von den meisten aktiven Treffern, die durch das Screening identifiziert wurden. Dies zeigt die relativ starke antivirale Aktivität der ausgewählten Verbindungen, sobald sie beherrscht sind.

Diese Technik kann verwendet werden, um große chemische Bibliotheken in einer Hochdurchsatzeinstellung zu screenen und Sätze kleiner Moleküle auszuwählen und nach antiviralen Breitbandmedikamenten zu greifen.