Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Analyse der zellulären Mechanismen der Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien mittels multispektraler bildgebender Durchflusszytometrie. Makrophagen werden zunächst mit Cytoklain D vorbehandelt, um die Aktinpolymerisation zu hemmen. Nanopartikel oder Salmonellen werden dem Makrophagen, der Monoschicht zugesetzt und inkubiert.

Dann werden die Makrophagen geerntet, fixiert und für die Analyse mit einem Bildstrom markiert. Multispektral bildgebende Durchflusszytometerzellen, die internalisierte Nanopartikel und/oder Salmonellen aufweisen, werden von solchen mit oberflächengebundenen Nanopartikeln und/oder Salmonellen unterschieden. Die daraus resultierenden Daten deuten darauf hin, dass sowohl Salmonellen als auch Nanopartikel nur von Zellen internalisiert werden, die nicht mit Cyto Klain behandelt wurden.

D, was darauf hindeutet, dass die Internalisierung aktinabhängig ist. Diese Technik hat mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden wie der Durchflusszytometrie und der konfokalen Mikroskopie. In erster Linie liefert es eine genaue Messung der Fluoreszenzsignalintensität und der räumlichen Auflösung zwischen verschiedenen zellulären Merkmalen bei hoher Geschwindigkeit.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen sowohl für die Forschung an Biomaterialien, Impfstoffen und Medikamenten als auch für eine Vielzahl von Studien zur Interaktion mit Krankheitserregern zu beantworten. Dazu gehört auch die Beschreibung der Internalisierungswege, die von Polyanhydrid-Nanopartikeln und Bakterien genutzt werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, oft Schwierigkeiten.

Es ist wichtig, Zeit mit der Titration der Farbstoffe zu verbringen, um optimale Fluoreszenzsignale zu erhalten. Auch das Kennenlernen der Software und das Erstellen von Analysevorlagen braucht Zeit. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir herausfanden, dass Polyhydro-Nanopartikel unter Verwendung von Mikroskopie und anderen Techniken pathogene Eigenschaften aufweisen, die Krankheitserreger nachahmen.

Wir wollten dann ein Hochdurchsatzsystem, um die Internalisierungsprozesse von Salmonellen und den Pollenhydrid-Nanopartikeln vor der Durchführung des Assays zu vergleichen. Alle Zellkulturen von Säugetieren und Bakterien sollten geerntet und Nanopartikelsuspensionen hergestellt werden. Beginnen Sie mit der Ernte konfluenter RA W2 64.7-Zellen mit einem Zellschaber.

Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Dann werden die Zellen in einer 24-Well-Kulturschale mit einer Dichte von fünf mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well in 0,5 Millilitern plattiert. Komplette DMEM-Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius und einem 5%CO2-Inkubator.

Zur Herstellung der Salmonella tarica verdünnen Sie Salmonellen in C-D-M-E-M, um eine Vielzahl von Infektionen von hundert pro RA W2 64,7 Zellen in einem 16 x 125 Millimeter großen Autoklav-Glaskulturröhrchen mit Schraubverschluss zu erhalten. Wiegen Sie anschließend unter Verwendung von sterilisiertem Molkenpapier fünf Milligramm 1%FITC-beladene Polyanhydrid-Nanopartikel ab, die wie von Rean-Kollegen in ihrer Veröffentlichung aus dem Jahr 2009 und pharmazeutischen Forschung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen beschrieben wurden. Geben Sie die Nanopartikel zu 0,5 Millilitern kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung und legen Sie sie auf Eis.

Halten Sie die Röhre auf Eis. Verwenden Sie einen Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor mit einer Mikrospitze, um die Suspension etwa 25 Sekunden lang bei vier bis sechs Joule zu beschallen. Jetzt, da alle benötigten Zellen und Reagenzien bereit sind, kann der Phagozytose-Assay durchgeführt werden.

Markieren Sie 24, Well-Gewebekulturplatten mit kultivierten RA W2 64,7-Zellen zur Vorbereitung des Assays auf der ersten Platte. Jede der folgenden Proben wird in dreifacher Ausfertigung untersucht, Cyto und D mit Nanopartikeln, Cyto und D mit Salmonellen, Medium mit Nanopartikeln, Medium mit nur Salmonellen-Nanopartikeln, nur Salmonellen und AF sechs 60-Färbezellen, die nur vier Grad Celsius kontrolliert werden, werden auf der zweiten Platte getestet und umfassen Medium plus Nanopartikel und Medium plus Salmonellen-Inkubation bei dieser niedrigen Temperatur, Verlangsamen Sie zelluläre Prozesse wie die Phagozytose eine Stunde vor der Induktion. Geben Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto und D und C-D-M-E-M in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Nanopartikelsuspension vortexen und 10 Mikroliter in die entsprechenden Vertiefungen geben. Dann die Salmonellen vortexen und bei einem MOI von 100 in die entsprechenden Vertiefungen geben. Klopfen Sie zum Mixen ein paar Mal auf den Teller.

Platzieren Sie dann die Probenplatten bei 37 Grad Celsius und die negativen Kontrollplatten bei vier Grad Celsius für 45 Minuten. Nach der Inkubation legen Sie die Platten auf Eis, waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS ohne Kalzium und Magnesium, indem Sie das alte Medium aspirieren und verwerfen, um ungebundene Partikel, Salmonellen und abgestorbene oder abgelöste Zellen zu entfernen. Verwendung von Blütenblatt-Magnesium.

Pre-PBS ist in diesem Stadium unerlässlich, da es die Zellablösung vom Substrat erleichtert. Um die Zellen zu ernten, fügen Sie 250 Mikroliter eiskaltes PBS hinzu und kratzen Sie vorsichtig die Vertiefungen ab, pipettieren Sie die geernteten Zellen in silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss und bewahren Sie sie auf Eis auf. Waschen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter Kaltwaschpuffer hinzufügen, und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250 mal G. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, entfernen Sie den Restpuffer, indem Sie das umgedrehte Mikrozentrifugenröhrchen auf Papier klopfen.

Befestigen Sie das Zellpellet mit einem Handtuch, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig über ein Reagenzglasgestell schieben. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 100 Mikroliter 4%-para-Formaldehyd in PBS hinzu und lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang stehen. Waschen Sie die Zellen bei Raumtemperatur, indem Sie einen Milliliter Dauerwellen-Waschpuffer hinzufügen, und zentrifugieren Sie sie dann 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250 mal G.

Nach dem Verwerfen des Überstands wird der Restpuffer wie zuvor entfernt. Dann zum Färben der RA W2 64,7 Zellen. Für Aktin fügen Sie 15 Minuten lang 100 Mikroliter Perm-Waschpuffer hinzu, der Alexa Fluora foid in sechs 60 enthält.

Bei Raumtemperatur sollten die ungefärbten Proben mit Dauerwelle inkubiert werden, Waschpuffer ohne Phin. Nach dem Färben waschen und zentrifugieren Sie die Zellen erneut, resuspendieren Sie sie dann in 50 Mikrolitern PBS mit 1%PFA und lagern Sie sie bis zur Gewinnung im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Einschalten, Bildstream und Starten.

Inspirieren und initialisieren Sie die Fluidik im Dateimenü. Wählen Sie Load default template (Standardvorlage laden) aus. Wählen Sie in der Bildergalerie im Menü Ansicht die Option Alle aus und drücken Sie Run Setup, um die Bildgebung der Perlen zu starten. Passen Sie bei Bedarf die Kernverfolgung so an, dass die Bilder seitlich zentriert werden.

Wählen Sie den Hellfeldkanal aus und klicken Sie auf Intensität einstellen. Warten Sie, bis der Variationskoeffizient der Strömungsgeschwindigkeit konstant kleiner als 0,2 % ist. Klicken Sie auf der Registerkarte "Unterstützung" auf "Alle starten", um Kalibrierungen und Tests durchzuführen und zu überprüfen, ob alle in der Software bestanden wurden. Klicken Sie auf Probe laden.

Wenn Sie dazu aufgefordert werden, setzen Sie das Fläschchen mit der hellsten Probe auf. Wenn sich alle Fluorochrome im Probenlader befinden, wählen Sie eine 40-fache Vergrößerung. Sobald die Geräteeinstellungen festgelegt sind, ändern Sie sie nicht für das gesamte Experiment.

Schalten Sie jeden Laser im Experiment ein, indem Sie auf die Lasersymbole in der Software klicken, und stellen Sie die Laserleistung so ein, dass jedes Fluorochrom maximale Pixelwerte zwischen 104.000 Zählungen hat, die in den Streudiagrammen gemessen werden. Um das Sammeln unerwünschter Objekte zu verhindern, klicken Sie in der Software auf das Fenster mit dem Zellklassifikator. Um dann nur Zellendaten zu erfassen, wählen Sie den unteren Bereichsgrenzkanal eins für Hellfeld aus und legen Sie den Wert auf 50 Mikrometer fest. Objekte mit einer Fläche von weniger als 50 Mikrometern gelten als Ablagerungen und werden nicht erfasst.

Wählen Sie die zu sammelnden Kanäle aus, indem Sie hier in der Software auf die entsprechenden Kanalsymbole klicken. Die Kanäle 1, 2, 3, 4, 5 und sechs werden auf der Registerkarte "Setup" ausgewählt. Geben Sie die Dateinummer und den Zielordner ein.

Legen Sie die Sequenznummer auf eins und die Anzahl der abzurufenden Ereignisse auf 5.000 fest. Klicken Sie auf Ausführen, Erfassen, um die erste Experimentdatendatei zu erfassen und zu speichern. Klicken Sie auf FLL, und führen Sie die nächste experimentelle Stichprobe aus.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Versuchsproben entnommen wurden. Um die Steuerelemente auszuführen, klicken Sie anschließend auf Kompositionseinstellungen. Dadurch werden das Hellfeld- und der Streulaser ausgeschaltet und die Sammlung aller Fluoreszenzkanäle auf der Registerkarte "Erfassen" aktiviert.

Ändern Sie den Eingabewert in 500. Platzieren Sie dann das Steuerrohr und klicken Sie auf Ausführen. Erwerben Sie, um 500 positive Zellen in einfach gefärbten Kontrollen zu sammeln.

Wiederholen Sie dies für jedes Fluorochrom im Experiment, um eine Kompensationsmatrix zu entwickeln. Sobald alle Beispielbilder erfasst wurden, starten Sie die Ideenanalysesoftware auf einem separaten Analysecomputer, indem Sie auf das Ideensymbol auf dem Desktop doppelklicken. Doppelklicken Sie auf den Internalisierungsassistenten und laden Sie eine der Testbeispiel-RIF-Dateien.

In einem Popup-Fenster finden Sie Anweisungen zum Laden der Testdateien. Folgen Sie den Anweisungen und klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Klicken Sie anschließend auf Neue Matrix.

Dadurch wird der Kompensations-Assistent gestartet. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie die Datendateien für die einfarbigen Steuerelemente aus, um sie hinzuzufügen. Klicken Sie im Assistenten auf Weiter und befolgen Sie die Anweisungen, bis die Kompensationsmatrixdatei gespeichert und in das Feld in Schritt zwei des Internalisierungsassistenten geladen wurde.

Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen, bis eine DAF-Datei generiert wird. Legen Sie die Eigenschaften der Bildanzeige fest, indem Sie die Bildkanäle auswählen, die während der Aufnahme verwendet werden. Klicken Sie auf Kanal zwei für FITC und Kanal fünf für AF six 60.

Hellfeld und Seitenstreuung sind standardmäßig ausgewählt. Wählen Sie den Hellfeldkanal O eins aus, um die Zellgrenze zu bilden, und den Kanal O2, in dem Nanopartikel oder Bakterien gesammelt wurden, damit die internalisierende Sonde die Einzelzellpopulation definiert, wird ein Streudiagramm des Hellfeldbereichs zum Hellfeldaspektverhältnis aller Zellen erzeugt. Für die Hochdurchsatzanalyse mehrerer Datendateien ist eine Vorlagendatei erforderlich, daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Gatter bei der Erstellung einer Vorlagendatei sorgfältig zu definieren.

Jeder Punkt stellt die Werte für ein einzelnes Zellenbild dar. Klicken Sie auf eine einzelne. in einem Diagramm, um das Bild dieser bestimmten Zelle in der Bildergalerie auszuwählen.

Zeichnen Sie als Nächstes ein Gate um Zellen mit der Fläche und dem Seitenverhältnis, die den Einzelzellenereignissen entsprechen. Einzelne Zellen haben ein Seitenverhältnis von Runde eins und Dubletten. Haben ein Seitenverhältnis von etwa 0,5.

Klicken Sie auf mehrere Zellen, um zwischen dem Bereich mit einzelnen Zellen und dem Bereich mit Dubletten oder Ablagerungen zu unterscheiden. Um ein Histogramm des Hellfeldgradienten zu erzeugen, bedeutet die Wurzel das Quadrat des Hellfeldbildes. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.

Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Füllung" die Option "Papierkorb" aus, um den ausgewählten Papierkorb anzuzeigen. Klicken Sie auf die Bins, um zu bestimmen, wo sich Zellen befinden und am besten fokussiert wird. Beginnen Sie und zeichnen Sie eine Linie zu den gangfokussierten Zellen.

Je höher der RMS-Wert des Gradienten, desto besser können Sie den nächsten Schritt überspringen, es sei denn, es gibt andere Flecken, auf die Sie einlösen können. Es wird ein neues Streudiagramm der Intensität des zweiten Kanals auf der X-Achse im Vergleich zum maximalen Pixel des zweiten Kanals auf der Y-Achse erstellt. Klicken Sie auf die Punkte und sehen Sie sich die Bilder an, um die Region zu bestimmen, die um die Zellen gezeichnet werden soll, die positiv für Nanopartikel oder Bakterien sind.

Es wird ein Histogramm des Internalisierungsmerkmals mit einer Region erstellt, die bei Null beginnt und durch Beobachtung von Bildern angepasst werden sollte. Das Internalisierungsmerkmal ist ein Verhältnis der Intensität innerhalb der Zelle zur Intensität der gesamten Zelle. Sie ist so skaliert, dass sich bei einem Wert von Null die Hälfte der Intensität im Inneren befindet.

Der Assistent hat einen Bereich jeder Zelle erstellt, der das Innere kennzeichnet, indem er eine Maske erstellt, die verwendet wird, die Zellenbildeingabe, um die Zellenoberfläche zu finden, und diese um vier Pixel erodiert. Beachten Sie, dass diese Maske bei Bedarf manuell für verschiedene Zelltypen angepasst werden kann, indem zuerst eine Objektmaske auf dem Hellfeldbild erstellt und diese um mehr oder weniger Pixel erodiert wird. Das Internalisierungsmerkmal wird auf der Grundlage dieser erodierten Objektmaske mit Hilfe eines Algorithmus in der Software berechnet.

Diese Funktion ermöglicht es uns, internalisierte Partikel und Bakterien, die den Großteil ihres Fluoreszenzsignals innerhalb der Maskengrenze haben, von oberflächengebundenen Partikeln und Bakterien zu unterscheiden, die den Großteil ihres Fluoreszenzsignals außerhalb der Maskengrenze haben, wie in diesem Beispiel gezeigt, und ein neues Histogramm mit einer neuen Internalisierungsfunktion basierend auf der erodierten Objektmaske zu erstellen. Zeichnen Sie einen Bereich, der auf internalisierten Zellen begrenzt werden soll, indem Sie die Bilddaten im ausgewählten Bin-Modus anzeigen. Stellen Sie das Gate auf 0.3.Hier.

Zellen mit einer Punktzahl von weniger als 0,3 gelten als oberflächengebundene partikelpositive Zellen. Um die Zellen mit Hintergrundmarkierung zu eliminieren und spezifische internalisierte Nanopartikel oder Bakterien zu identifizieren, wählen Sie Funktionen aus dem Analysemenü. Klicken Sie auf das Analysemenü.

Klicken Sie dann auf die Funktion "Spot-Zählung" daneben, um die mittlere Spot-Anzahl zum Statistikbericht hinzuzufügen. Klicken Sie im Menü "Berichte" auf das Symbol "Berichte". Definieren Sie dann einen Statistikbericht, fügen Sie Spalten hinzu und wählen Sie dann die entsprechende Zellpopulation aus.

Klicken Sie auf OK. Der Internalisierungsassistent fügt diesem Bericht automatisch Statistiken hinzu, um die Datendatei als Vorlagendatei zu speichern, die für die Batch-Analyse aller experimentellen Dateien verwendet werden kann. Klicken Sie auf das Dateimenü und wählen Sie Als Vorlage speichern.

Vorlagendateien. Verwenden Sie die Erweiterung dot AST, um mehrere Datendateien in der Ideensoftware zu analysieren. Klicken Sie auf Extras, wählen Sie Batch-Datendateien aus und geben Sie alle RIF-Dateien ein.

Fügen Sie die Vergütungsmatrixdatei und die Vorlagendatei in den entsprechenden Abschnitten hinzu, um den Stapel zur Verarbeitung zu übermitteln, und klicken Sie auf Senden. Nach dem Verarbeitungsschritt werden alle RAF-Dateien analysiert und DAF-Dateien für jede der einzelnen Rohdateien generiert. Es wird ein Abschlussbericht mit Statistiken für alle Proben erstellt, um die Wirkung der Aktinhemmung und der niedrigen Temperatur auf die Phagozytose von Salmonellen und Nanopartikeln zu vergleichen.

RA W2 64,7 Zellen wurden bei 37 Grad Celsius in Medium inkubiert, entweder mit oder ohne Cytoklain D oder inkubiert in Medium bei vier Grad Celsius. Sowohl die Temperatur als auch die Aktinmanipulationen reduzierten die Internalisierung sowohl von Nanopartikeln als auch von Salmonellen. Die Inkubation der Zellen in Cyto und D erhöht jedoch den Prozentsatz der Zellen mit oberflächengebundenen Nanopartikeln, während der Prozentsatz der Zellen mit oberflächengebundenen Salmonellen verringert wird.

Der Prozentsatz der Zellen, die positiv auf oberflächengebundene Nanopartikel reagieren, steigt von etwa 8 % bei 37 Grad Celsius auf mehr als 35 % nach einer Behandlung mit Cyto und D oder vier Grad Celsius. Im Gegensatz dazu reduzierte sich der Prozentsatz der Zellen mit oberflächengebundenen Salmonellen von 35 % auf 15 % Nach der Cyto- und D-Behandlung verringerte die Inkubation von RA W2 64,7-Zellen mit Salmonellen bei vier Grad Celsius die Internalisierung, ohne dass die Menge an oberflächengebundenen Bakterien im Vergleich zur 37-Grad-Kontrolle offensichtlich zunahm. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Salmonellen und Nanopartikel durch einen ähnlichen zellulären Prozess internalisiert werden, der Aktin erfordert und temperaturabhängig ist.

Darüber hinaus deuten die Daten darauf hin, dass eine anhaltende Bindung von Salmonellen an Makrophagen eine Aktinpolymerisation erfordert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die zelluläre Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien durch multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie überprüfen können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Inhibitoren zytotoxisch sind.

Daher sind vorherige Experimente zur Erstellung von Zytotoxizitätsprofilen erforderlich, um die optimalen Konzentrationen zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Salmonellen gefährliche Vorsichtsmaßnahmen sein kann, wie z. B. das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung und die Vermeidung der Bildung von Aerosolen, die bei der Durchführung dieses Verfahrens beachtet werden sollten.