Name: Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie die zelluläre Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien durch Makrophagen mittels multispektraler Bildgebungs-Durchflusszytometrie quantifiziert wird. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen internalisierten und oberflächengebundenen Partikeln.

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<ol><li>Ulery, B. D., Kumar, D., Ramer-Tait, A. E., Metzger, D. W., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+protective+single-dose+intranasal+nanoparticle-based+vaccine+platform+for+respiratory+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Design of a protective single-dose intranasal nanoparticle-based vaccine platform for respiratory infectious diseases.</a> PLoS One. 6, e17642(2011).</li>
<li>Kasturi, S. P., Skountzou, I., Albrecht, R. A., Koutsonanos, D., Hua, T., Nakaya, H. I., Ravindran, R., Stewart, S., Alam, M., Kwissa, M., Villinger, F., Murthy, N., Steel, J., Jacob, J., Hogan, R. J., García-Sastre, A., Compans, R., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+the+magnitude+and+persistence+of+antibody+responses+with+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.</a> Nature. 470, 543-547 (2011).</li>
<li>Rice-Ficht, A. C., Arenas-Gamboa, A. M., Kahl-McDonagh, M. M., Ficht, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+particles+in+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polymeric particles in vaccine delivery.</a> Curr. Opin. Microbiol. 13, 106-112 (2010).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug.+Deliv%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert. Opin. Drug. Deliv. 5, 889-907 (2008).</li>
<li>Pfeifer, B. A., Burdick, J. A., Little, S. R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ester-anhydride%29%3Apoly%28beta-amino+ester%29+micro-+and+nanospheres%3A+DNA+encapsulation+and+cellular+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Poly(ester-anhydride):poly(beta-amino ester) micro- and nanospheres: DNA encapsulation and cellular transfection.</a> Int. J. Pharm. 304, 210-219 (2005).</li>
<li>Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+matter%3A+quantitative+and+dynamic+analysis+of+the+formation+of+an+immunological+synapse+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 79-86 (2009).</li>
<li>Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+phagocytosis+and+bacterial+killing+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 15-22 (1999).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+differentially+modulates+particle+binding%2C+phagocytosis+and+downstream+antimicrobial+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation differentially modulates particle binding, phagocytosis and downstream antimicrobial mechanisms.</a> Dev. Comp. Immunol. 34, 1144-1159 (2010).</li>
<li>Murphy, K. C., Campellone, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda+Red-mediated+recombinogenic+engineering+of+enterohemorrhagic+and+enteropathogenic+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lambda Red-mediated recombinogenic engineering of enterohemorrhagic and enteropathogenic E. coli.</a> BMC. Mol. Biol. 4, 11(2003).</li>
<li>Karsi, A., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+fluorescence+and+bioluminescence+expression+vectors+for+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria.</a> Plasmid. 57, 286-295 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 857-902 (2009).</li>
<li>Vercauteren, D., Vandenbroucke, R. E., Jones, A. T., Rejman, J., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N., Braeckmans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers%3A+optimization+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li>
<li>Di Marzio, L., Marianecci, C., Cinque, B., Nazzarri, M., Cimini, A. M., Cristiano, L., Cifone, M. G., Alhaique, F., Carafa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-sensitive+non-phospholipid+vesicle+and+macrophage-like+cells%3A+binding%2C+uptake+and+endocytotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">pH-sensitive non-phospholipid vesicle and macrophage-like cells: binding, uptake and endocytotic pathway.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 2749-2756 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
</ol>

Sherree L. Freund wird von Amnis Corporation, die das System produziert ImageStream X beschäftigt.

Studien haben gezeigt, dass biologisch abbaubare Nanopartikel auf Basis von Poly (milchsäure-co-Glykolsäure (PLGA) oder Polyanhydriden verwendet werden, um eingeschlossene Antigene oder Medikamente Zielzellen abzugeben. Aufnahme dieser Nanopartikel von phagozytischen Zellen auf ihre Wirksamkeit wichtig, damit quantitative . Analyse der Internalisierung kritisch bei der Entwicklung neuartiger Nanopartikel-Delivery-Systeme Mit dieser Methode können differentielle Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen mit L...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RAW 264.7 Zelllinie </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> TIB-71 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM) </td><td> Cellgro </td><td> 10 bis 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S 11150 </td><td> Premium Grade </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Platte</td><td> TPP </td><td> 92024 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturflaschen </td><td> TPP </td><td> 90151 </td><td></td></tr><tr><td> Zellschaber </td><td> TPP </td><td> 99002 </td><td> 24 cm </td></tr><tr><td> Salmonella enterica Serovar Typhimurium </td><td> ATCC </td><td> 14028 </td><td></td></tr><tr><td> BTX ECM630 Electro Zellmanipulators </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21 bis 040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ultraschall-Prozessor flüssig </td><td> MisOnix </td><td> S-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasin-D </td><td> Sigma-Aldrich, </td><td> C8273 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td><td></td></tr><tr><td> Waschpuffer </td><td> 2% hitzeinaktiviertem FBS, 0,1% Natriumazid in PBS. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Perm / Waschpuffer </td><td> BD Biosciences </td><td> 554714 </td><td></td></tr><tr><td> Freisicht-Schnappdeckel Mikroröhrchen </td><td> Sigma </td><td> T4816 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 660 Phalloidin </td><td> Invitrogen </td><td> A22285 </td><td></td></tr><tr><td> ImageStream X </td><td> Amnis Corporation </td><td> 100200 </td><td> Optionen: 658nm Laser, Autosampler </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Fisher Scientific </td><td> S-500 227I </td><td></td></tr></tbody></table>

die analyse der zellulären internalisierung nanopartikel und bakterien durch multi-spectral imaging durchflusszytometrie

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanopartikel-Systemen haben als wertvolle Hilfsmittel zur Verabreichung von Impfstoffen durch ihre Fähigkeit, effizient zu liefern Fracht, einschließlich Proteine ​​entstanden, auf Antigen-präsentierenden Zellen 1-5. Internalisierung von Nanopartikeln (NP) von Antigen-präsentierenden Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort gegen das verkapselte Antigen. Um, wie sich Änderungen in Nanopartikel-Formulierung auswirken Funktion zu bestimmen, haben wir versucht, einen hohen Durchsatz, quantitative experimentelle Protokoll, das kompatibel mit Erkennung internalisierte Nanopartikel sowie Bakterien war zu entwickeln. Bis heute wurden zwei unabhängige Techniken, Mikroskopie und Durchflusszytometrie, waren die Methoden benutzt, um die Phagozytose von Nanopartikeln zu untersuchen. Der hohe Durchsatz Natur der Durchflusszytometrie erzeugt robuste statistische Daten. Jedoch aufgrund der niedrigen Auflösung, schlägt es genau zu quantifizieren verinnerlicht gegenüber Zelle gebundenen Nanopartikeln. Mikroskopie erzeugt Bilder mit hoher räumlicher Auflösung; however, es ist zeitaufwendig und birgt kleinen Stichproben 6-8. Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie (MIFC) ist eine neue Technologie, die sowohl Aspekte der Mikroskopie und Durchflusszytometrie, die Multi-Color-spektralen Fluoreszenz-und Hellfeld-Bildgebung führt gleichzeitig durch eine Laminar-Kern enthält. Dadurch ist eine genaue Analyse des Fluoreszenzsignals Intensitäten und räumlichen Beziehungen zwischen unterschiedlichen Strukturen und zellulären Eigenschaften bei hoher Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung MIFC um die Zellpopulationen, die Polyanhydrid Nanopartikel oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium verinnerlicht haben zu charakterisieren. Wir beschreiben die Herstellung von Nanopartikel-Suspensionen, Zellmarkierung, Erwerb auf einem ImageStream X-System und die Analyse der Daten mit Hilfe des IDEAS-Anwendung. Darüber hinaus zeigt die Anwendung einer Technik, die verwendet werden, um die Internalisierung p unterschieden werden könnenathways für Nanopartikel und Bakterien mit Cytochalasin-D als ein Inhibitor der Aktin-vermittelte Phagozytose.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanopartikuläre Systeme haben sich aufgrund ihrer Fähigkeit, Frachten, einschließlich Proteinen, effizient zu transportieren, als wertvolle Instrumente für die Impfstoffverabreichung erwiesen, um ...

Um die zellulären Mechanismen der Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien mittels multiskalarer bildgebender Durchflusszytometrie zu analysieren. Makrophagen werden zunächst mit Cytochalasin D vorbehandelt, um die Aktinpolymerisation zu hemmen. Anschließend werden Nanopartikel oder Salmonellen der Makrophagen-Monolayer hinzugefügt und inkubiert.Anschließend werden die Makrophagen geerntet, fixiert und zur Analyse mittels eines Bildstroms markiert. Mit einem multispektralen bildgebenden Durchflusszytometer werden Zellen, die Nanopartikel und/oder Salmonellen aufgenommen haben, von solchen unterschieden, die nur oberflächengebundene Nanopartikel und/oder Salmonellen aufweisen. Die resultierenden Daten zeigen, dass sowohl Salmonellen als auch Nanopartikel ausschließlich von Zellen aufgenommen werden, die nicht mit Cyto klain behandelt wurden.D, was darauf hindeutet, dass die Internalisierung aktinabhängig ist. Diese Technik bietet mehrere Vorteile gegenüber etablierten Methoden wie der Durchflusszytometrie und der konfokalen Mikroskopie. Vor allem liefert sie eine genaue Messung der Fluoreszenzsignalintensitäten und eine räumliche Auflösung zwischen verschiedenen zellulären S

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Quelle: Zhang, Y., et al. Anwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Untersuchung des Umbaus des endolysosomalen Systems durch intrazelluläre Bakterien. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt die Verwendung von fluoreszierenden Nanopartikeln zur Visualisierung des endolysosomalen Umbaus in menschlichen Epithelzellen, die von intrazellulären Bakterien infiziert sind. Nach der bakteriellen Invasion manipulieren die Erreger das Zytoskelett des Wirts und das endolysosomale System und bilden...

Nanopartikel-vermittelte Visualisierung des endo-lysosomalen Umbaus in bakteriell infizierten Zellen

Wir überprüfen unsere jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese Handy-Basis Mikro-Analyse-Geräte könnte für durchflusszytometrische Analyse nützlich, wie die Ausführung verschiedener Zellzählung Aufgaben sowie für High-Throughput-Screening von z. B. Wasserproben in beschränkten Ressourcen-Einstellungen.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

In dieser Studie bestand der Hauptzweck darin, die zelluläre Aufnahme und eventuelle Exozytose von Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) zu überwachen. Aus dieser Perspektive haben wir hier eine einzigartige Methode mit Hilfe der multispektralen bildgebenden Durchflusszytometrie vorgeschlagen, die eine Quantifizierung und Lokalisierung von CNTs in einer statistisch relevanten Anzahl von Zellen ermöglicht.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Diese Methode demonstriert eine Technik zur Beurteilung der Granulozytenfunktion durch gleichzeitige Messung der Phagozytose von Bakterien und des oxidativen Ausbruchs. Die bildbasierte Durchflusszytometrie ermöglichte die Identifizierung von drei verschiedenen Untergruppen aktivierter Granulozyten, die sich alle in ihrer relativen Funktionsfähigkeit unterschieden.

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten In-vitro-

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Der In-vitro-Mikrokern-Assay ist eine etablierte Methode zur Bewertung von Genotoxizität und Zytotoxizität, aber die Bewertung des Assays mittels manueller Mikroskopie ist mühsam und leidet unter Subjektivität und Inter-Scorer-Variabilität. In diesem Artikel wird das Protokoll beschrieben, das entwickelt wurde, um eine vollautomatische Version des Tests mit multispektraler Bildflusszytometrie durchzuführen.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

Dieser Artikel stellt die Integration eines spektralfokussierenden Moduls und eines Dual-Output-Pulslasers vor, der eine schnelle hyperspektrale Bildgebung von Goldnanopartikeln und Krebszellen ermöglicht. Diese Arbeit zielt darauf ab, die Details multimodaler nichtlinearer optischer Techniken auf einem Standard-Laserscanning-Mikroskop zu demonstrieren.

Biomolekulare Bildgebung der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels multimodaler nichtlinearer optischer Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Diese Studie klärt die phagozytäre Prozessierung von Godanti Bhasma (GB)-Partikeln in Säugetierzellen auf und charakterisiert deren zelluläre Aufnahme, Vakuolendynamik, Versauerung und Abbau. Diese Erkenntnisse verbessern nicht nur unser Verständnis grundlegender Phagozytose-Mechanismen, sondern etablieren GB auch als vielversprechendes Modellsystem für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien.

Erforschung der sequentiellen zellulären Ereignisse der durch Godanti Bhasma ausgelösten Phagozytose in Säugetierzellen

Erfahren Sie, wie die zelluläre Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien durch Makrophagen mittels multispektraler Bildgebungs-Durchflusszytometrie quantifiziert wird. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen internalisierten und oberflächengebundenen Partikeln.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

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