Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren
25. Februar 2014
Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das zelltypspezifische Aktionspotential-Spiking im sensorischen Kortex während der Informationsverarbeitung mit der morphologischen Identität der aufgezeichneten Neuronen zu verknüpfen. Dies wird erreicht, indem die Ratte zunächst chirurgisch auf die Juxta-Somalaufnahmen vorbereitet wird. Nach der Vorbereitung zeichnet eine Elektrode die spontane und sensorisch evozierte Spike-Aktivität auf, und das aufgenommene Neuron wird mit Biocidin unter Verwendung von Strom und Injektionen geladen.
Anschließend wird das Gehirn für die Biotin-Färbung aufbereitet. Schließlich wird das mit Biotin gefüllte Neuron aus nachfolgenden Abschnitten für die Zelltypklassifizierung digital rekonstruiert. Letztendlich ermöglichen juxta somale Aufzeichnungen einzelner Neuronen die Untersuchung der sensorischen Verarbeitung und struktureller Informationen innerhalb des kortikalen Netzwerks.
Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. welche Rolle spielen einzelne Zelltypen und Schichten bei der sensorischen Verarbeitung? Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode benötigen, Schwierigkeiten, da es sehr einfach ist, Neuronen während des Füllvorgangs abzutöten. Die Chancen auf eine erfolgreiche Biocidin-Abfüllung werden durch die Vorbereitung von Pipetten in optimaler Qualität erhöht, und zusätzlich ist ein geschultes Auge erforderlich, um die Schmalbandstrominjektionen zu kontrollieren.
Daher braucht es Erfahrung, um die Erfolgsrate bei der Wiederherstellung gut gefüllter Neuronen zu erhöhen. Setzen Sie zu Beginn eine betäubte Wistar-Ratte auf ein stereotaktisches Gestell, das mit einem Heizkissen ausgestattet ist. Bestätigen Sie die Sedierungstiefe, indem Sie den Zehenkneifreflex testen.
Führen Sie dann eine rektale Sonde ein, um die richtige Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie den Kopf des Tieres und entfernen Sie Haare von der Operationsstelle. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
Warten Sie drei bis fünf Minuten nach der Injektion von Lidocain an der Operationsstelle und entfernen Sie die Haut, die die Schädeloberfläche bedeckt. Entfernen Sie anschließend das restliche Gewebe und reinigen Sie den Schädel ausgiebig mit 0,9 % Natriumchlorid. Bestimmen Sie die Koordinaten für den primären somatosensorischen Kortex auf der linken Hemisphäre und markieren Sie die Stelle auf dem Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift.
Verwende einen Zahnbohrer, um den Knochen von der interessierenden Region abzukratzen. Schaben Sie den Knochen weiter, bis er transparent wird und die Blutgefäße deutlich sichtbar sind. Als nächstes schneidest du mit einem Skalpell ein kleines Fenster in den dünnen Schädel.
Achten Sie darauf, die Dura mater und die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Markieren Sie die Ränder der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarker. Um die Sichtbarkeit zu verbessern, tragen Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber auf den trockenen Schädel auf und dann Zahnzement, um ein Bad zu bauen.
Beim Schließen der Kraniotomie kürzen Sie die Schnurrhaare auf der kontralateralen Seite auf genau fünf Millimeter, um ihre Sichtbarkeit zu verbessern. Markieren Sie die getrimmten Schnurrhaare mit schwarzer Mascara, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen, machen Sie Patch-Pipetten aus Boro Silicic Glas. Die ideale Pipettenmorphologie ist eine allmählich schlanke Verjüngung, ein kleiner Kegelwinkel und ein Innenspitzendurchmesser von etwa einem Mikrometer.
Füllen Sie die Patch-Pipette mit normalem Radierringer, ergänzt mit 2%Biotin, und montieren Sie die Patch-Pipette auf einen Pipettenhalter, der an einem Kopftisch befestigt und mit einem Mikrom-Manipulator verbunden ist. Um speziell auf die beiden D-Spalten der Ratte S eins abzuzielen, stellen Sie den Winkel des Elektrodenhalters auf 34 Grad in Bezug auf die Sagittalebene ein. Positionieren Sie anschließend die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe der Kraniotomie.
Füllen Sie das Bad mit 0,9% Natriumchlorid. Wenn sich der Verstärker im Brückenmodus befindet, legen Sie Rechteckimpulse mit positiver Strominjektion an, um den Elektrodenwiderstand zu bestimmen. Der optimale Elektrodenwiderstand liegt zwischen drei und fünf Mega.
Stellen Sie einen Überdruck von 100 bis 150 Millibar ein und schieben Sie die Patch-Pipette in Schritten von einem Mikrometer vor, während Sie positiven Strom in Form von Rechteckimpulsen anlegen. Überwachen Sie die robuste Widerstandsänderung bei Berührung mit der Dura Mater. Setzen Sie an dieser Stelle die Koordinaten des Mikromanipulators auf Null, um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen.
Fahren Sie in Schritten von einem Mikrometer vor, bis die Patch-Pipette in die Dura mater eindringt, was sich durch einen plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstands zeigt. Entfernen Sie den Haltedruck der Pipette. Suchen Sie als Nächstes nach einzelnen Einheiten, während Sie in Schritten von einem Mikrometer vorankommen.
Überwachen Sie den Elektrodenwiderstand kontinuierlich, indem Sie 200 Millisekunden lang Ein-Aus-Impulse anlegen, und eine Erhöhung des Elektrodenwiderstands zeigt typischerweise die Nähe eines einzelnen Neurons an, um die Elektrode bis zur positiven Wirkung vorzuschieben. Potentialwellenformen von etwa zwei Millivolt werden aufgezeichnet. Optional können Sie die spontane Spike-Aktivität aufzeichnen und die widerrufene Spike-Aktivität des Whiskers bestimmen, indem Sie einzelne Whisker mit einem elektrischen Pizo-Gerät hätschelnd ablenken, um optimale Bedingungen für die Juxta-Somal-Füllung zu erhalten.
Schieben Sie die Elektrode vor, bis der Widerstand 25 bis 35 beträgt. Megaohm und Spikes haben Amplituden von drei bis acht Millivolt, um die somale Juxta-Füllung zu starten. Legen Sie positive Rechteckstromimpulse ab einem Nanoampere an.
Erhöhen Sie den Strom langsam und allmählich in Schritten von 0,1 Nanoampere, während Sie die Form und Frequenz der AP-Welle überwachen. Überwachen Sie die Membranöffnung als deutlichen Anstieg der AP-Frequenz während der Ein-Phase des Blockimpulses, die Spike-Wellenform während der Füllung zeigt eine zunehmende Breite und verringert sich nach Hyperpolarisation, Erhöhung oder Verringerung des Stroms während der Füllung, um eine stabile Biotininfusion zu erhalten, Verringerung oder Stopp der Stromimpulse bei plötzlicher Erhöhung der AP-Frequenz. Zur Vermeidung von Toxizität durch übermäßigen Einstrom von extrazellulären Ionen wie Natriumionen.
Es ist wichtig zu beachten, dass jedes Neuron anders auf den Füllvorgang reagiert. Daher müssen die Parameter der juxta somalen Markierung in Abhängigkeit von den Aufnahmebedingungen angepasst werden. Überwachen Sie das Signal genau, nachdem Sie die Stromeinspeisung gestoppt haben.
Die Spike-Wellenform nach einer Füllsitzung ist in der Regel breiter und zeigt eine stark reduzierte Wartezeit nach der Hyperpolarisation auf die Wiederherstellung des Neurons, was sich zeigt, wenn die Spike-Wellenform zu ihren ursprünglichen Eigenschaften zurückkehrt, um jegliche mechanische Belastung der Zelle zu reduzieren. Ziehen Sie die Patch-Pipette in Schritten von einem Mikrometer zurück, bis die Spike-Amplitude abnimmt, warten Sie mindestens eine Stunde, bis das Biotin intrazellulär diffundiert ist, und überwachen Sie dabei die Körpertemperatur und die Atmung des Tieres genau. Schließlich werden Gehirnproben entnommen und verarbeitet, um die Qualität der Juxta-Somal-Markierung zu ermitteln.
Diese Bilder zeigen Bilder von juxtal gefüllten Neuronen im primären somatosensorischen Kortex. Diese tangentiale Ansicht eines Parametall-Neurons zeigt den Größenunterschied zwischen Dendriten und Axonen. In dieser digitalen Rekonstruktion eines mit Somali markierten Neurons wird das Neuronenprojektionsbild in hoher Auflösung, aber geringer Vergrößerung gezeigt und mit automatisierter digitaler Rekonstruktion das Axon in blau bzw. den Dendriten in rot überlagert.
Hier ist der Box-Bereich erweitert, um Axon bhuton über die gesamte Länge des Axons zu zeigen. In dieser abschließenden Animation veranschaulichen wir die Rekonstruktionspipeline für eine Schicht fünf dicke, büschelförmige Parametall-Neuronen aus dem primären somatosensorischen Kortex der Ratte. Die Pipeline umfasst die Rekonstruktion der dendritischen und axonalen Morphologie bei 100-facher Vergrößerung und der Tonnenkonturen bei vierfacher Vergrößerung.
Das Ergebnis ist eine vollständige 3D-Rekonstruktion, die anschließend in einem standardisierten Referenzrahmen registriert wird, um eine quantitative Analyse der morphologischen Merkmale durchzuführen. So ermöglicht die Juxta-Somalmarkierung in vivo eine außergewöhnliche Markierungsqualität für eine zuverlässige Rekonstruktion der vollständigen 3D-Morphologie. Hier haben wir die Methode an urethanbetäubten Tieren gezeigt.
Jux Somal-Aufzeichnungen können jedoch auch bei Tieren mit wachem Kopf verwendet werden, um die Rolle einzelner Zelltypen und -schichten bei der aktiven Erkundung der Umwelt zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Biocidin-Markierung an einzelnen Neuronen für die Nachkriegsidentifikation und morphologische Rekonstruktion durchführen können.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Verbindung von Aktionspotenzial-Spiking im sensorischen Cortex mit der morphologischen Identität von Neuronen. Durch die Verwendung von juxtasomaler Biocytin-Markierung können Forscher neuronale Aktivität aufzeichnen und gleichzeitig die Neuronen für eine detaillierte strukturelle Analyse markieren.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neuronale Morphologie
Hintergrund
- Das Verständnis neuronaler Netzwerke erfordert sowohl funktionelle als auch morphologische Charakterisierung.
- Juxtasomale Aufnahmen ermöglichen die Untersuchung der Aktivität einzelner Neuronen.
- Die Biocytin-Markierung erlaubt eine post hoc Rekonstruktion neuronaler Strukturen.
- Dieser Ansatz hilft bei der Klassifizierung von Zelltypen basierend auf ihrer Morphologie und Aktivität.
Zweck der Studie
- Um sensorische Verarbeitung mit der strukturellen Identität von Neuronen zu verbinden.
- Um das Verständnis kortikaler Netzwerke durch Analyse einzelner Neuronen zu verbessern.
- Um Biocytin-Markierung für detaillierte morphologische Studien zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Vorbereitung von Ratten für juxtasomale Aufnahmen.
- Elektrophysiologische Aufnahmen von spontaner und sensorisch-evozierter Spiking-Aktivität.
- Biocytin-Füllung der aufgezeichneten Neuronen durch Strominjektionen.
- Verarbeitung von Hirngewebe für Biotin-Färbung und digitale Rekonstruktion.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Aufzeichnung von Aktionspotenzialen, die mit morphologischen Daten verknüpft sind.
- Detaillierte Rekonstruktion der neuronalen Architektur aus der Biocytin-Markierung.
- Einblicke in sensorische Verarbeitungsmechanismen innerhalb kortikaler Netzwerke.
- Klassifizierung von Neuronen basierend auf ihren strukturellen und funktionellen Eigenschaften.
Schlussfolgerungen
- Juxtasomale Aufnahmen bieten eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung einzelner Neuronen.
- Die Verbindung von Morphologie und Funktion verbessert das Verständnis der neuronalen Rollen in der sensorischen Verarbeitung.
- Dieser Ansatz kann angewendet werden, um neuronale Netzwerke in verschiedenen Kontexten weiter zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Linking neuronal activity to structural identity enables mechanistic de-risking in target validation by clarifying cell-type-specific roles in sensory processing circuits. This approach supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative morphological and functional data for hypothesis testing. It addresses a key discovery-stage challenge: resolving how individual neuronal subtypes contribute to network-level information processing in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking action potential spiking patterns to neuronal morphology during sensory processing.
- Operational Value: Enables biological de-risking through post hoc identification of recorded neurons for cell-type classification.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying structure-function relationships in cortical microcircuits relevant to neuropsychiatric targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by establishing baseline morphological and electrophysiological profiles.
- Operational Value: Enhances screening readiness through reproducible juxtasomal recording conditions across behavioral states.
- Platform Reuse: Facilitates scalable application in awake, head-restrained, and freely moving models for longitudinal target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system continuity by enabling reverse engineering of cortical networks from functional to structural data.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative 3D morphological reconstruction and standardized reference frame registration.
- Predictive Confidence: Strengthens translational biomarker alignment by correlating electrophysiological outputs with anatomical architecture in sensory cortex.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification by enabling mechanistic de-risking of neuronal targets in sensory processing pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by correlating sensory-evoked spiking with dendritic and axonal morphology.
- Screening: Delivers assay readiness via stable juxtasomal configurations and quantitative spike waveform analysis during filling procedures.
- Analytics: Generates measurable outputs including action potential amplitude, frequency, and width for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through post hoc reconstruction enabling quantitative analysis of neuronal architecture in standardized reference frames.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for iterative target validation across anesthetic, sedated, awake, and freely moving conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of structure-function relationships in cortical neurons.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled current injection parameters and pipette preparation protocols.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in neuropsychiatric target advancement.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through integrated functional and morphological datasets for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and morphological reconstruction to manage narrow-band current injections and avoid neuronal toxicity.
- Dependent on high-quality patch pipettes with sub-micron tip diameters and stable bath conditions for juxtasomal sealing.
- Necessitates cross-team standardization between electrophysiology and histology teams for consistent biocytin diffusion and staining protocols.
- Adaptation considerations include adjusting filling parameters based on neuronal response variability across recording conditions and behavioral states.
- Practical limitations include mechanical stress risks during pipette retraction and the need for post-filling recovery periods to ensure labeling quality.
