Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zelltypspezifische Aktionspotentialspikes im sensorischen Kortex während der Informationsverarbeitung mit der morphologischen Identität der aufgezeichneten Neuronen zu verknüpfen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Ratte für juxtasomatische Ableitungen chirurgisch präpariert wird. Nach der Vorbereitung zeichnet eine Elektrode spontane und sensorisch hervorgerufene Spikaktivität auf, und das aufgezeichnete Neuron wird mittels Strom und Injektionen mit Biocidin beladen.

Anschließend wird das Gehirn zur Biotin-Färbung aufgearbeitet. Schließlich wird das mit Biotin gefüllte Neuron aus nachfolgenden Schnitten digital rekonstruiert, um eine Klassifizierung des Zelltyps vorzunehmen. Letztendlich ermöglichen juxtasomatische Ableitungen einzelner Neuronen die Untersuchung sensorischer Verarbeitung und struktureller Informationen innerhalb des kortikalen Netzwerks.

Mit dieser Methode können zentrale Fragen der Neurowissenschaft beantwortet werden, beispielsweise welche Rolle einzelne Zelltypen und Schichten während der sensorischen Verarbeitung spielen. Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode benötigen, Schwierigkeiten, da es sehr leicht ist, Neuronen während des Füllverfahrens zu schädigen. Die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Biocytin-Füllung erhöht sich durch die Herstellung von Pipetten optimaler Qualität und zusätzlich ist ein geschultes Auge erforderlich, um die eng begrenzten Strominjektionen zu kontrollieren.

Daher ist Erfahrung erforderlich, um die Erfolgsrate bei der Gewinnung gut gefüllter Neuronen zu erhöhen. Beginnen Sie damit, eine anästhesierte Wistar-Ratte auf einen stereotaktischen Halter mit Heizplatte zu legen. Überprüfen Sie die Tiefe der Sedierung durch Testen des Zehenquetschreflexes.

Danach einen rektalen Sondenfühler einsetzen, um die korrekte Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Den Kopf des Tieres fixieren und das Haar von der Operationsstelle entfernen. Augensalbe auf die Augen auftragen, um Austrocknung zu verhindern.

Warten Sie drei bis fünf Minuten nach der Injektion von Lidocain an der Operationsstelle und entfernen Sie die Haut, die die Schädelfläche bedeckt. Entfernen Sie anschließend jegliches verbleibendes Gewebe und reinigen Sie den Schädel gründlich mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung. Bestimmen Sie die Koordinaten für den primären somatosensorischen Kortex in der linken Hemisphäre und markieren Sie die Position am Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierstift.

Verwenden Sie einen Zahnbohrer, um den Knochen aus dem Bereich von Interesse abzukratzen. Setzen Sie das Abkratzen des Knochens fort, bis dieser durchsichtig wird und Blutgefäße deutlich sichtbar sind. Schneiden Sie anschließend mit einem Skalpell ein kleines Fenster in den dünnen Schädel ein.

Unter Vorsicht, um das Dura mater und die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Markieren Sie die Ränder der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarkierstift. Um die Sichtbarkeit zu verbessern, tragen Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber auf den trockenen Schädel auf und anschließend Zahnzement, um ein Bad zu konstruieren.

Beim Schließen der Kraniotomie schneiden Sie die Schnurrhaare auf der kontralateralen Seite exakt auf fünf Millimeter zu, um ihre Sichtbarkeit zu verbessern. Markieren Sie die gekürzten Schnurrhaare mit schwarzer Wimperntusche, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen, und stellen Sie Patch-Pipetten aus Borosilikatglas her. Die ideale Pipettenmorphologie weist eine allmähliche, schlanke Verjüngung, einen geringen Kegelwinkel und einen inneren Spitzen­durchmesser von etwa einem Mikrometer auf.

Füllen Sie die Patch-Pipette mit normalem Rad-Ringer-Lösung, ergänzt mit 2 % Biotin, und montieren Sie die Patch-Pipette auf einem Pipettenhalter, der an einer Kopfstufe befestigt ist und mit einem Mikromanipulator verbunden ist. Um gezielt die D-Zwei-Spalte des Ratten-S-Eins zu erreichen, stellen Sie den Winkel des Elektrodenhalters auf 34 Grad bezüglich der Sagittalebene ein. Positionieren Sie anschließend die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe zur Kraniotomie.

Füllen Sie das Bad mit 0,9 % Natriumchlorid. Schalten Sie den Verstärker in den Brückenmodus und geben Sie quadratische Pulse mit positiver Strominjektion an, um den Elektrodenwiderstand zu bestimmen. Der optimale Elektrodenwiderstand liegt zwischen drei und fünf Megaohm.

Erzeugen Sie einen Überdruck von 100 bis 150 Millibar und bewegen Sie die Patch-Pipette in Ein-Mikrometer-Schritten vorwärts, während Sie positiven Strom in Form von Rechteckimpulsen anwenden. Überwachen Sie die deutliche Widerstandsänderung beim Kontakt mit der Dura mater. Setzen Sie an diesem Punkt die Koordinaten des Mikromanipulators auf null, um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen.

Vorwärtsbewegen im Ein-Mikrometer-Schrittmodus, bis die Patch-Pipette in die Dura mater eindringt, was durch einen plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstands angezeigt wird. Den Halbedruck der Pipette entfernen. Anschließend bei Fortbewegung in Ein-Mikrometer-Schritten nach einzelnen Einheiten suchen.

Überwachen Sie den Elektrodenwiderstand kontinuierlich, indem Sie 200 Millisekunden lange Ein-Aus-Impulse anlegen; ein Anstieg des Elektrodenwiderstands deutet typischerweise auf die Nähe eines einzelnen Neurons hin. Führen Sie die Elektrode vorwärts, bis positiv verlaufende Aktionspotential-Wellenformen mit einer Amplitude von etwa zwei Millivolt registriert werden. Optional können Sie die spontane Spiketätigkeit aufzeichnen und die whiskerassoziierte Spiketätigkeit bestimmen, indem Sie einzelne Whisker vorsichtig mit einem piezoelektrischen Gerät ablenken, um optimale Bedingungen für die juxtasomatische Füllung zu erzielen.

Bewegen Sie die Elektrode vorwärts, bis der Widerstand zwischen 25 und 35 Megaohm liegt und die Spikes Amplituden von drei bis acht Millivolt aufweisen, um die juxtasomale Füllung zu beginnen. Geben Sie positive rechteckförmige Stromimpulse beginnend bei einem Nanoampere an.

Erhöhen Sie den Strom langsam und schrittweise in Schritten von 0,1 Nanoampere, während Sie die Aktionspotential-Wellenform und -frequenz überwachen. Beobachten Sie das Öffnen der Membran als deutliche Zunahme der Aktionspotentialfrequenz während der Einschaltphase des Blockimpulses; die Spikes-Wellenform zeigt während der Füllung eine vergrößerte Breite und eine verminderte Nachhyperpolarisation. Erhöhen oder verringern Sie den Strom während des Füllvorgangs, um eine stabile Biotin-Infusion aufrechtzuerhalten; reduzieren oder stoppen Sie die Stromimpulse bei plötzlichem Anstieg der Aktionspotentialfrequenz, um eine Toxizität durch übermäßigen Einfluss extrazellulärer Ionen wie Natriumionen zu vermeiden.

Es ist wichtig zu beachten, dass sich jedes Neuron unterschiedlich auf den Füllvorgang reagiert. Daher müssen die Parameter für die juxtasomatische Markierung je nach Aufnahmebedingung angepasst werden. Überwachen Sie das Signal genau, nachdem die Strominjektion gestoppt wurde.

Die Spikewellenform nach einer Füllung ist gewöhnlich verbreitert und weist eine stark verminderte Nachhyperpolarisation auf, warten Sie auf die Erholung des Neurons, was erkennbar ist, wenn die Spikewellenform zu ihren ursprünglichen Eigenschaften zurückkehrt, um mechanische Belastungen der Zelle zu minimieren. Ziehen Sie die Patch-Pipette schrittweise um jeweils ein Mikrometer zurück, bis die Spikemplitude abnimmt; warten Sie mindestens eine Stunde, damit das Biotin intrazellulär diffundieren kann, während Sie die Körpertemperatur und Atmung des Tieres sorgfältig überwachen. Schließlich werden Gehirnproben gewonnen und bearbeitet, um die Qualität der juxtasomatischen Markierung sichtbar zu machen.

Diese Bilder zeigen Aufnahmen von juxtal markierten Neuronen im primären somatosensorischen Kortex. Diese tangentialen Ansichten eines parametralen Neurons verdeutlichen den Größenunterschied zwischen Dendriten und Axonen. Bei dieser digitalen Rekonstruktion eines juxta somal markierten Neurons wird das Neuronenprojektionsbild in hoher Auflösung, jedoch bei geringer Vergrößerung dargestellt, wobei die automatisierte digitale Rekonstruktion das Axon in Blau und den Dendriten in Rot überlagert.

Hier wird der Box-Bereich vergrößert, um das Axonterminal entlang der gesamten Länge des Axons zu zeigen. In dieser abschließenden Animation veranschaulichen wir die Rekonstruktions-Pipeline für ein dick verzweigtes, tuftetes Parametall-Neuron der Schicht fünf aus dem primären somatosensorischen Kortex der Ratte. Die Pipeline umfasst die Rekonstruktion der dendritischen und axonalen Morphologie mit 100facher Vergrößerung sowie der Barrel-Konturen mit 4facher Vergrößerung.

Das Ergebnis ist eine vollständige 3D-Rekonstruktion, die anschließend in einen standardisierten Referenzrahmen eingepasst wird, um eine quantitative Analyse morphologischer Merkmale durchzuführen. Somit ermöglicht die juxtasomatische Markierung in vivo eine außergewöhnliche Markierungsqualität für die zuverlässige Rekonstruktion der vollständigen 3D-Morphologie. Hier zeigten wir die Methode an unter Urethan anesthetisierten Tieren.

Jedoch können juxtasomatische Ableitungen auch bei wachen, kopffixierten Tieren verwendet werden, um die Rolle einzelner Zelltypen und Schichten während der aktiven Erkundung der Umgebung zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man Biocidin-Markierungen an einzelnen Neuronen zur postmortalen Identifizierung und morphologischen Rekonstruktion durchführt.