Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das zelltypspezifische Aktionspotential-Spiking im sensorischen Kortex während der Informationsverarbeitung mit der morphologischen Identität der aufgezeichneten Neuronen zu verknüpfen. Dies wird erreicht, indem die Ratte zunächst chirurgisch auf die Juxta-Somalaufnahmen vorbereitet wird. Nach der Vorbereitung zeichnet eine Elektrode die spontane und sensorisch evozierte Spike-Aktivität auf, und das aufgenommene Neuron wird mit Biocidin unter Verwendung von Strom und Injektionen geladen.

Anschließend wird das Gehirn für die Biotin-Färbung aufbereitet. Schließlich wird das mit Biotin gefüllte Neuron aus nachfolgenden Abschnitten für die Zelltypklassifizierung digital rekonstruiert. Letztendlich ermöglichen juxta somale Aufzeichnungen einzelner Neuronen die Untersuchung der sensorischen Verarbeitung und struktureller Informationen innerhalb des kortikalen Netzwerks.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. welche Rolle spielen einzelne Zelltypen und Schichten bei der sensorischen Verarbeitung? Im Allgemeinen haben Personen, die diese Methode benötigen, Schwierigkeiten, da es sehr einfach ist, Neuronen während des Füllvorgangs abzutöten. Die Chancen auf eine erfolgreiche Biocidin-Abfüllung werden durch die Vorbereitung von Pipetten in optimaler Qualität erhöht, und zusätzlich ist ein geschultes Auge erforderlich, um die Schmalbandstrominjektionen zu kontrollieren.

Daher braucht es Erfahrung, um die Erfolgsrate bei der Wiederherstellung gut gefüllter Neuronen zu erhöhen. Setzen Sie zu Beginn eine betäubte Wistar-Ratte auf ein stereotaktisches Gestell, das mit einem Heizkissen ausgestattet ist. Bestätigen Sie die Sedierungstiefe, indem Sie den Zehenkneifreflex testen.

Führen Sie dann eine rektale Sonde ein, um die richtige Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie den Kopf des Tieres und entfernen Sie Haare von der Operationsstelle. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.

Warten Sie drei bis fünf Minuten nach der Injektion von Lidocain an der Operationsstelle und entfernen Sie die Haut, die die Schädeloberfläche bedeckt. Entfernen Sie anschließend das restliche Gewebe und reinigen Sie den Schädel ausgiebig mit 0,9 % Natriumchlorid. Bestimmen Sie die Koordinaten für den primären somatosensorischen Kortex auf der linken Hemisphäre und markieren Sie die Stelle auf dem Schädel mit einem chirurgischen Hautmarkierungsstift.

Verwende einen Zahnbohrer, um den Knochen von der interessierenden Region abzukratzen. Schaben Sie den Knochen weiter, bis er transparent wird und die Blutgefäße deutlich sichtbar sind. Als nächstes schneidest du mit einem Skalpell ein kleines Fenster in den dünnen Schädel.

Achten Sie darauf, die Dura mater und die Blutgefäße nicht zu beschädigen. Markieren Sie die Ränder der Kraniotomie mit einem chirurgischen Hautmarker. Um die Sichtbarkeit zu verbessern, tragen Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber auf den trockenen Schädel auf und dann Zahnzement, um ein Bad zu bauen.

Beim Schließen der Kraniotomie kürzen Sie die Schnurrhaare auf der kontralateralen Seite auf genau fünf Millimeter, um ihre Sichtbarkeit zu verbessern. Markieren Sie die getrimmten Schnurrhaare mit schwarzer Mascara, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen, machen Sie Patch-Pipetten aus Boro Silicic Glas. Die ideale Pipettenmorphologie ist eine allmählich schlanke Verjüngung, ein kleiner Kegelwinkel und ein Innenspitzendurchmesser von etwa einem Mikrometer.

Füllen Sie die Patch-Pipette mit normalem Radierringer, ergänzt mit 2%Biotin, und montieren Sie die Patch-Pipette auf einen Pipettenhalter, der an einem Kopftisch befestigt und mit einem Mikrom-Manipulator verbunden ist. Um speziell auf die beiden D-Spalten der Ratte S eins abzuzielen, stellen Sie den Winkel des Elektrodenhalters auf 34 Grad in Bezug auf die Sagittalebene ein. Positionieren Sie anschließend die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe der Kraniotomie.

Füllen Sie das Bad mit 0,9% Natriumchlorid. Wenn sich der Verstärker im Brückenmodus befindet, legen Sie Rechteckimpulse mit positiver Strominjektion an, um den Elektrodenwiderstand zu bestimmen. Der optimale Elektrodenwiderstand liegt zwischen drei und fünf Mega.

Stellen Sie einen Überdruck von 100 bis 150 Millibar ein und schieben Sie die Patch-Pipette in Schritten von einem Mikrometer vor, während Sie positiven Strom in Form von Rechteckimpulsen anlegen. Überwachen Sie die robuste Widerstandsänderung bei Berührung mit der Dura Mater. Setzen Sie an dieser Stelle die Koordinaten des Mikromanipulators auf Null, um genaue Tiefenmessungen zu ermöglichen.

Fahren Sie in Schritten von einem Mikrometer vor, bis die Patch-Pipette in die Dura mater eindringt, was sich durch einen plötzlichen Abfall des Elektrodenwiderstands zeigt. Entfernen Sie den Haltedruck der Pipette. Suchen Sie als Nächstes nach einzelnen Einheiten, während Sie in Schritten von einem Mikrometer vorankommen.

Überwachen Sie den Elektrodenwiderstand kontinuierlich, indem Sie 200 Millisekunden lang Ein-Aus-Impulse anlegen, und eine Erhöhung des Elektrodenwiderstands zeigt typischerweise die Nähe eines einzelnen Neurons an, um die Elektrode bis zur positiven Wirkung vorzuschieben. Potentialwellenformen von etwa zwei Millivolt werden aufgezeichnet. Optional können Sie die spontane Spike-Aktivität aufzeichnen und die widerrufene Spike-Aktivität des Whiskers bestimmen, indem Sie einzelne Whisker mit einem elektrischen Pizo-Gerät hätschelnd ablenken, um optimale Bedingungen für die Juxta-Somal-Füllung zu erhalten.

Schieben Sie die Elektrode vor, bis der Widerstand 25 bis 35 beträgt. Megaohm und Spikes haben Amplituden von drei bis acht Millivolt, um die somale Juxta-Füllung zu starten. Legen Sie positive Rechteckstromimpulse ab einem Nanoampere an.

Erhöhen Sie den Strom langsam und allmählich in Schritten von 0,1 Nanoampere, während Sie die Form und Frequenz der AP-Welle überwachen. Überwachen Sie die Membranöffnung als deutlichen Anstieg der AP-Frequenz während der Ein-Phase des Blockimpulses, die Spike-Wellenform während der Füllung zeigt eine zunehmende Breite und verringert sich nach Hyperpolarisation, Erhöhung oder Verringerung des Stroms während der Füllung, um eine stabile Biotininfusion zu erhalten, Verringerung oder Stopp der Stromimpulse bei plötzlicher Erhöhung der AP-Frequenz. Zur Vermeidung von Toxizität durch übermäßigen Einstrom von extrazellulären Ionen wie Natriumionen.

Es ist wichtig zu beachten, dass jedes Neuron anders auf den Füllvorgang reagiert. Daher müssen die Parameter der juxta somalen Markierung in Abhängigkeit von den Aufnahmebedingungen angepasst werden. Überwachen Sie das Signal genau, nachdem Sie die Stromeinspeisung gestoppt haben.

Die Spike-Wellenform nach einer Füllsitzung ist in der Regel breiter und zeigt eine stark reduzierte Wartezeit nach der Hyperpolarisation auf die Wiederherstellung des Neurons, was sich zeigt, wenn die Spike-Wellenform zu ihren ursprünglichen Eigenschaften zurückkehrt, um jegliche mechanische Belastung der Zelle zu reduzieren. Ziehen Sie die Patch-Pipette in Schritten von einem Mikrometer zurück, bis die Spike-Amplitude abnimmt, warten Sie mindestens eine Stunde, bis das Biotin intrazellulär diffundiert ist, und überwachen Sie dabei die Körpertemperatur und die Atmung des Tieres genau. Schließlich werden Gehirnproben entnommen und verarbeitet, um die Qualität der Juxta-Somal-Markierung zu ermitteln.

Diese Bilder zeigen Bilder von juxtal gefüllten Neuronen im primären somatosensorischen Kortex. Diese tangentiale Ansicht eines Parametall-Neurons zeigt den Größenunterschied zwischen Dendriten und Axonen. In dieser digitalen Rekonstruktion eines mit Somali markierten Neurons wird das Neuronenprojektionsbild in hoher Auflösung, aber geringer Vergrößerung gezeigt und mit automatisierter digitaler Rekonstruktion das Axon in blau bzw. den Dendriten in rot überlagert.

Hier ist der Box-Bereich erweitert, um Axon bhuton über die gesamte Länge des Axons zu zeigen. In dieser abschließenden Animation veranschaulichen wir die Rekonstruktionspipeline für eine Schicht fünf dicke, büschelförmige Parametall-Neuronen aus dem primären somatosensorischen Kortex der Ratte. Die Pipeline umfasst die Rekonstruktion der dendritischen und axonalen Morphologie bei 100-facher Vergrößerung und der Tonnenkonturen bei vierfacher Vergrößerung.

Das Ergebnis ist eine vollständige 3D-Rekonstruktion, die anschließend in einem standardisierten Referenzrahmen registriert wird, um eine quantitative Analyse der morphologischen Merkmale durchzuführen. So ermöglicht die Juxta-Somalmarkierung in vivo eine außergewöhnliche Markierungsqualität für eine zuverlässige Rekonstruktion der vollständigen 3D-Morphologie. Hier haben wir die Methode an urethanbetäubten Tieren gezeigt.

Jux Somal-Aufzeichnungen können jedoch auch bei Tieren mit wachem Kopf verwendet werden, um die Rolle einzelner Zelltypen und -schichten bei der aktiven Erkundung der Umwelt zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie die Biocidin-Markierung an einzelnen Neuronen für die Nachkriegsidentifikation und morphologische Rekonstruktion durchführen können.