Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die dynamische Wechselwirkung zwischen einem einzelnen DNA-bindenden Protein und einem DNA-Molekül zu beobachten. Dies wird erreicht, indem in einem speziell konstruierten Mikroskop zwei Einzelmolekül-Techniken kombiniert werden: doppelte optische Pinzetten und Fluoreszenzmikroskopie. Diese Anordnung ist außerdem mit Hellfeldbeleuchtung zur Visualisierung sowie zur nanometergenauen Stabilisierung der Probe ausgestattet.

Als zweiter Schritt wird eine Multikanal-Flusszelle, die in ein Mikro-Flusssystem integriert ist, aufgebaut, um bis zu vier laminare Strömungen zu ermöglichen, die effizient alle für das Experiment benötigten Komponenten rekrutieren und zusammenfügen. Anschließend wird der Einzelmolekül-Konstrukt zur Durchführung der Experimente aufgebaut. Zunächst werden zwei mit Titin beschichtete Mikrokügelchen mittels dualer optischer Pinzetten im ersten Kanal eingefangen.

Die beiden eingefangenen Kügelchen werden anschließend in den zweiten Kanal bewegt, um die Bindung der DNA-Vorlage, die an beiden Enden mit Biotin markiert ist, zu ermöglichen. Das Vorhandensein eines einzelnen DNA-Moleküls wird im dritten Kanal mittels einer DNA-Kraft-Ausdehnungsanalyse überprüft. Schließlich wird das als DNA-Hantel bezeichnete Kügelchen-DNA-Kügelchen-Konstrukt in den Protein-Kanal bewegt, in dem das fluoreszenzmarkierte Lactose-Repressorprotein vorhanden ist.

Es werden Ergebnisse erzielt, die Diffusion und spezifische Bindung einzelner LAC-Auge-Moleküle an einem einzelnen gestreckten DNA-Molekül zeigen sowie die Quantifizierung der kinetischen Parameter der Bewegung von LAC-Auge ermöglichen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Einzelmolekülmethoden liegen in der Möglichkeit, die auf das DNA-Molekül ausgeübte Spannung zu kontrollieren, in der präzisen Verfolgung der Bewegungen der bindenden Proteine über einen nanometerstabilen Bereich sowie in der Fähigkeit, weit entfernt von der Deckglasoberfläche zu arbeiten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu Protein-DNA-Wechselwirkungen zu beantworten, insbesondere bezüglich der Mechanik der Genexpressionsregulation sowie der Dynamik der Proteindiffusion entlang der DNA bei der Zielortsuche.

Diese Demonstration dieser Methode ist sehr nützlich, um die praktischen Aspekte des Aufbaus der Durchflusszelle, der Probenaufgabe und der Montage des DNA-Perlen-Konstrukts zu veranschaulichen. In diesem Video wird zunächst gezeigt, wie man die Richtstabilität der beiden Fanglaser mithilfe von Mikroperlen, die auf der Oberfläche eines Deckgläschens befestigt sind, als Referenz überprüft. Weitere Einzelheiten zum Design und Aufbau der optischen Pinzette finden sich im begleitenden Protokolltext.

Verwenden Sie einen 24 mal 60 Millimeter großen Deckel zum Verteilen von zwei Mikrolitern Silikabeads auf der Oberfläche eines 24 mal 32 Millimeter großen Deckels. Befestigen Sie mithilfe zweier Stücke doppelseitigen Klebebands den 24 mal 32 Millimeter großen Deckel auf einem Objektträger, um eine Durchflusszelle herzustellen.

Füllen Sie die Durchflusszelle mit 50 Millimolar Phosphatpuffer und verschließen Sie sie mit Silikonfett. Ein Silikabead in der Hellfeldmikroskopie bei etwa 2000facher Vergrößerung. Das Sichtfeld sollte ungefähr sieben mal fünf Mikrometer betragen und mit 768 mal 576 Pixeln aufgenommen werden, sodass das Bead-Bild einen Durchmesser von etwa 190 Pixeln hat. Kompensieren Sie thermische Drifts mit einer Feedback-Software, die die XY-Position aus dem Bildzentrum und die Z-Position aus den Beugungsringen berechnet und Drifts korrigiert.

Bewegen Sie einen Piezotisch mit Nanometergenauigkeit oder besser, um den Mittelpunkt der linken Falle mit dem Mittelpunkt der Perle zu überlagern, und messen Sie das Positionsrauschen sowie dessen Standardabweichung vom Fotodioden-Quadrantendetektor oder QDP. Wiederholen Sie die Messung für die rechte Falle. Die Standardabweichung des Positionsrauschens sollte innerhalb weniger Nanometer liegen, um eine präzise Lokalisierung von DNA-Bindeproteinen zur Herstellung der Durchflusszelle zu ermöglichen.

Zunächst wird eine Diamantspitze verwendet, um Löcher mit einem Durchmesser von einem Millimeter in eine 76 mal 76 mal ein Millimeter große Mikroskopplatte zu bohren. Dadurch entstehen vier Einlässe und ein Auslass. Dies ermöglicht bis zu vier parallele Pufferströme.

Jeweils mit einer der verschiedenen für das Experiment erforderlichen Komponenten: Perlen, DNA, fluoreszenzmarkiertes Protein und Imaging-Puffer. Reinigen Sie den Objektträger mit Ethanol und zentrieren Sie die Kammer mit dem eingesetzten O-Ring sowie dem Klebering auf dem Objektträger, sodass die Zugangsöffnungen umgeben sind. Es ist unbedingt erforderlich, während dieses Schritts Handschuhe zu tragen, um Fingerabdrücke zu vermeiden, die den Verklebungsprozess stören könnten.

Mit Hilfe einer zweiten Halterung werden die Nanoanschlüsse am Objektträger befestigt und dieser für eine Stunde in einen auf 180 Grad Celsius vorgeheizten Ofen gegeben, um eine vollständige Anheftung zu ermöglichen. In der Zwischenzeit wird der Umriss des Durchflusskäfigs auf ein Stück Papier gezeichnet. Der Kanal sollte etwa drei Millimeter breit sein und mit den Positionen auf dem Objektträger übereinstimmen.

Legen Sie die Zeichnung auf zwei Stücke Perfil und schneiden Sie mit einem Skalpell scharfe und kontinuierliche Schnitte entlang der eingezeichneten Kontur. Entfernen Sie alle entstandenen Vorsprünge, verwerfen Sie die untere Parfumschicht, die lediglich dazu dient, eine saubere Unterlage zu gewährleisten. Stellen Sie danach den Objektträger mit den angebrachten Nanoports umgedreht in die metallische Halterung.

Richten Sie die Umrisse der Paraform-Kammer sorgfältig an den Löchern aus und stellen Sie sicher, dass das Param die Einlass- und Auslassöffnungen der Kammerabdeckung nicht übersteigt. Bedecken Sie die Kammer mit einer gereinigten Mikroskop-Abdeckungsscheibe und entfernen Sie vorsichtig überschüssiges Param um die Kammer herum. Platzieren Sie zwei zuvor auf 120 Grad Celsius erwärmte Wärmblöcke auf der Durchflusszelle, um gleichmäßigen Druck auszuüben. Lassen Sie den Para-Film etwa 25 Minuten lang schmelzen.

Der nächste Schritt besteht darin, das Druckreservoir und die Pufferbehälter vorzubereiten. Das Druckreservoir besteht aus Plexiglas und ermöglicht die Aufnahme von bis zu sechs Pufferbehältern. Schließen Sie zunächst die Absperrventile am Ausgang der Pufferbehälter an, um den Pufferfluss einzuschalten, wobei sich der Ventilhebel in vertikaler Position befindet, oder auszuschalten, wobei sich der Hebel in einer im Uhrzeigersinn gedrehten Position befindet.

Während der Experimente montieren Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskopständer. Anschließend verbinden Sie die Absperrventile über Polyetheretherketon- oder PEEK-Rohre sowie die flanschlosen Drehstutzen mit den Einlässen der Durchflusskammer. Das PEEK-Rohr weist einen Innendurchmesser von etwa 150 µm auf; als Verbindung zwischen dem PEEK-Rohr und den Nanoport-Systemen der Durchflusszelle werden etwa drei Zentimeter Fluorethylenpropylen-Rohr mit einem Innendurchmesser von etwa 500 µm verwendet.

Dies ist wichtig, um den Pufferfluss am Kammereingang zu reduzieren und so ein Zerreißen der Durchflusszelle oder ein Lösen des Nano-Anschlusses vom Glas zu vermeiden. Die Verwendung von Schläuchen mit großem Innendurchmesser allein würde hingegen große Mengen biologischer Proben erfordern. Schließen Sie den Auslass der Durchflusskammer an ein offenes Falcon-Röhrchen unter atmosphärischem Druck an.

Dieses Rohr dient der Entsorgung der Pufferlösung, die aus der Durchflusskammer austritt. Um diesen Vorgang zu beginnen, geben Sie ein Milliliter Puffer A in jeden der Pufferbehälter und leiten Sie einen Druck von 200 Millibar an, um die Verbindungsrohre und die Durchflusszelle zu spülen. Ein Druckregelsystem ist hierfür geeignet.

Schließlich die Luftdruckeinstellung im Druckreservoir vornehmen. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Luftblasen, die den gleichmäßigen Fluss stören könnten. Ein sanftes Klopfen auf das Auslassrohr hilft, verbleibende Blasen zu entfernen; verringern Sie anschließend den Druck auf 20 Millibar und vergewissern Sie sich, dass alle Kanäle und Schläuche frei von Luftblasen sind und dass das Pufferlösung mit ähnlichen Geschwindigkeiten in allen Kanälen fließt.

Stellen Sie die Proben auf ein Endvolumen von 300 Mikrolitern ein. Dieses Experiment verwendet mit Streptavidin beschichtete Polystyrol-Kügelchen, lineare DNA, die an beiden Enden biotinyliert ist und spezifische Zielsequenzen für die Bindung des Lactose-Repressors enthält, sowie fluoreszenzmarkiertes Lactose-Repressor-Protein. Geben Sie jede Probe in einen der Spritzenbehälter in der folgenden Reihenfolge: Kügelchen in den ersten Kanal, DNA in den zweiten, den Imaging-Puffer in den dritten und das markierte Protein in den vierten Kanal.

Schalten Sie den Durchfluss bei 20 Millibar ein und öffnen Sie die Absperrventile, um die Proben in den Durchflusskanal gelangen zu lassen. Dies ist leicht im Perlenkanal erkennbar. Während Sie den ersten Kanal unter Hellfeldbeleuchtung abbilden, schalten Sie die beiden optischen Fallen ein und fangen jeweils eine Polystyrolperle in jeder Falle ein.

Bewegen Sie sich schnell zum zweiten Kanal, um zu verhindern, dass andere Perlen in die Fallen gelangen. Beachten Sie, dass das Eintreffen im DNA-Kanal am Ende des Perlenstroms leicht erkennbar ist. Verwenden Sie einen AO-Optikdeflektor oder eine OD-Bewegung, um eine Fallenperle hin und her in der Nähe der anderen Perle zu bewegen, um die Anheftung der durch den Fluss gestreckten DNA zwischen den beiden optisch gefangenen Perlen zu ermöglichen.

Wenn ein DNA-Dumbbell gebildet wird, folgt die statische Perle der Bewegung der Perle, die aktiv durch die Falle hin und her bewegt wird. Wechseln Sie schnell zum Pufferkanal und schalten Sie den Pufferfluss ab. Führen Sie eine Kraft-Dehnungs-Kurven-Analyse durch, um das Vorhandensein eines einzelnen DNA-Moleküls zu überprüfen.

Dies wird erreicht, indem die beiden Perlen unter gleichzeitiger Messung der DNA-Spannung voneinander getrennt werden. Sobald ein einzelner DNA-Dumbbell vorliegt, schalten Sie die Strömung erneut ein und bewegen den Dumbbell in den Protein-Kanal. Wechseln Sie zur Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, um die Wechselwirkung des markierten Lactose-Repressorproteins mit der DNA zu überwachen, schalten Sie die Strömung aus und beginnen Sie mit der Aufnahme.

Diese Methode ermöglicht die Detektion einzelner Lactose-Repressor- oder Lac-Auge-Moleküle, die mit einem gestreckten DNA-Molekül interagieren. In diesem repräsentativen CH-Diagramm diffundiert ein einzelnes Lac-Auge-Molekül entlang unspezifischer DNA-Sequenzen, während ein anderes Lac-Auge-Molekül spezifisch an einen Operator im Zentrum des DNA-Moleküls gebunden ist. Diese Darstellung zeigt die Position der beiden Lac-Auge-Moleküle entlang der Richtung, die die Zentren der beiden Fallen verbindet.

In Abhängigkeit von der Zeit wurden die Positionen der Moleküle mittels des hier gezeigten Algorithmus des radialen Symmetriezentrums bestimmt. Es folgt eine Darstellung der mittleren quadratischen Verschiebung oder MSD in Abhängigkeit von der Zeit für ein einzelnes LacI-Molekül, das entlang eines gestreckten DNA-Moleküls diffundiert. Der Diffusionskoeffizient des Proteins kann leicht aus der linearen Regression der Daten ermittelt werden. Die Kombination von Manipulations- und Abbildungstechniken stellt eine leistungsstarke Methode dar, die mechanische Kontrolle über ein einzelnes biologisches Polymer wie DNA, RNA oder ein zytoskelettales Filament sowie die gleichzeitige Lokalisierung einzelner Proteinmoleküle, die mit dem Polymer interagieren, ermöglicht.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Kombination von Einzelmolekül-Manipulations- und Abbildungstechniken eine sorgfältige Gestaltung des experimentellen Aufbaus erfordert, um eine Stabilität des suspendierten Polymers auf Nanometer-Ebene sicherzustellen. Andererseits ist eine geeignete Konstruktion der biologischen Sonde erforderlich, um eine ausreichende räumliche Trennung zwischen dem Fang-Laser (G-Laser) und der fluoreszierenden Sonde zu gewährleisten. Weitere Einzelheiten finden Sie im begleitenden Protokolltext.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das DNA-Molekül zwischen den beiden optischen Schnellimpulsen zusammensetzt, mit denen dieser Konstrukt aufgebaut wird. Dieser Aufbau gelingt besser mit der Mehrkanal-Flusszelle, für die wir eine detaillierte Beschreibung bereitgestellt haben. Außerdem haben wir erläutert, wie man den Pufferfluss optimiert und Luftblasen entfernt, die andernfalls Ihre Experimente beeinträchtigen könnten.

Im kombinierten Textprotokoll finden Sie die Protokolle zur Markierung der DNA mit bioTE, die für die Assemblierung mit den mit Streptavidin beschichteten Kügelchen erforderlich ist, sowie die Protokolle zur Markierung des Proteins. Abschließend erläutern wir Schritt für Schritt die Vorgehensweise zur Quantifizierung der Bindung und der Diffusion eines einzelnen lactosehemmenden Proteins an einem gestreckten DNA-Molekül.