Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die dynamische Wechselwirkung zwischen einem einzelnen DNA-bindenden Protein und einem DNA-Molekül zu beobachten. Dies wird erreicht, indem in einem speziell angefertigten Mikroskop zwei Einzelmolekültechniken, eine doppelte optische Pinzette und Fluoreszenzmikroskopie kombiniert werden. Dieser Aufbau ist auch mit einer Hellfeldbeleuchtung zur Visualisierung und Nanometerstabilisierung der Probe ausgestattet.

In einem zweiten Schritt wird eine Mehrkanal-Durchflusszelle gebaut, die in ein Mikroströmungssystem integriert ist, so dass bis zu vier laminare Strömungen alle für das Experiment benötigten Komponenten effizient rekrutieren und zusammenbauen können. Als nächstes wird das Einzelmolekülkonstrukt zusammengebaut, um die Experimente durchzuführen. Die ersten beiden mit Streifentitinen beschichteten Mikrokügelchen werden mit der doppelten optischen Pinzette im ersten Kanal aufgefangen.

Die beiden gefangenen Kügelchen werden dann in den zweiten Kanal verschoben, um die Anheftung der mit Biotin markierten DNA-Vorlage an beiden Enden zu ermöglichen. Das Vorhandensein eines einzelnen DNA-Moleküls wird im dritten Kanal durch eine Analyse der A-DNA-Krafterweiterung überprüft. Schließlich wird das Bead-DNA-Bead-Konstrukt namens DNA-Hantel zu dem Proteinkanal bewegt, in dem das fluoreszenzmarkierte Laktose-Repressor-Protein vorhanden ist.

Es werden Ergebnisse erzielt, die die Diffusion und spezifische Bindung einzelner LAC-Augenmoleküle an ein einzelnes gedehntes DNA-Molekül und die Quantifizierung der kinetischen Parameter der LAC-Augenbewegung zeigen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Einzelmolekülmethoden sind die Möglichkeit, die auf das neue Molekül ausgeübte Spannung zu kontrollieren, die Möglichkeit, die Bewegungen der Bindungsproteine über einen nanometer stabilen Punkt genau zu verfolgen, sowie die Fähigkeit, weit entfernt von der Schlafoberfläche der Abdeckung zu arbeiten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu Protein-DNA-Interaktionen zu beantworten, insbesondere zur Mechanik der Genexpressionsregulation sowie zur Dynamik der Proteindiffusion entlang der DNA in den Mechanismen der Zielsuche.

Diese Demonstration dieser Methode ist sehr nützlich, um die praktischen Aspekte der Konstruktion der Durchflusszellenprobe, der Handhabung und des Zusammenbaus des Beat-DNA-Bead-Konstrukts zu zeigen. In diesem Video wird zunächst gezeigt, wie die Ausrichtungsstabilität der beiden Fallenlaser anhand von Mikrokügelchen, die auf einer Deckglasoberfläche aufgeklebt sind, als Referenz überprüft werden kann. Details zum Aufbau und zur Konstruktion der optischen Pinzette finden Sie im begleitenden Protokolltext.

Verwenden Sie einen 24 x 60 Millimeter großen Deckglas, um zwei Mikroliter Kieselsäurekügelchen auf die Oberfläche eines 24 x 32 Millimeter großen Deckglases zu verteilen. Mit zwei Stücken doppelseitigem Klebeband. Befestigen Sie den 24 x 32 Millimeter großen Deckglas auf einem Objektträger, um eine Durchflusszelle zu erstellen.

Füllen Sie die Durchflusszelle mit 50 Millimolar Phosphatpuffer und versiegeln Sie sie mit Silikonfettbild. Ein Siliziumdioxidkügelchen in der Hellfeldmikroskopie bei etwa 2000-facher Vergrößerung. Das Sichtfeld sollte etwa sieben mal fünf Mikrometer betragen und bei 7, 68 x 5 76 Pixeln aufgenommen werden, so dass das Kügelchenbild einen Durchmesser von etwa 190 Pixeln hat; kompensiert thermische Drifts mit einer Feedback-Software, die die XY-Position aus dem Bildzentrum und Z aus den Beugungsringen berechnet und Drifts korrigiert.

Bewegen Sie einen Pizo-Tisch mit Nanometergenauigkeit oder besser, überlappen Sie die Mitte der linken Falle mit der Perlenmitte und messen Sie das Positionsrauschen und seine Standardabweichung vom Quadrantendetektor, der Fotodiode oder QDP. Wiederholen Sie die Messung für die rechte Falle. Die Standardabweichung des Positionsrauschens sollte innerhalb weniger Nanometer liegen, um eine präzise Lokalisierung der DNA-bindenden Proteine zur Herstellung der Flusszelle zu ermöglichen.

Eine Diamantspitze wird zunächst verwendet, um Löcher mit einem Durchmesser von einem Millimeter in ein 76 x 76 x 1 Millimeter großes Mikroskop zu bohren. Schieben Sie, um vier Einlässe und einen Auslass zu erstellen. Dies ermöglicht bis zu vier parallele Pufferflüsse.

Jedes enthält eine der verschiedenen Komponenten, die für die Experimentkügelchen benötigt werden, DNA, fluoreszenzmarkiertes Protein und Imaging-Puffer. Reinigen Sie den Objektträger mit Ethanol und zentrieren Sie die Öffnung mit dem eingesetzten O-Ring und dem Klebering im Objektträger, der die Zugangslöcher umgibt. Es ist wichtig, bei diesem Schritt Handschuhe zu tragen, um Fingerabdrücke zu vermeiden, die den Klebeprozess stören würden.

Klemmen Sie mit Hilfe eines zweiten Schiebers die Nano-Ports an den Schieber und legen Sie ihn für eine Stunde in einen auf 180 Grad Celsius vorgeheizten Ofen, um eine vollständige Befestigung zu ermöglichen. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit das Umrissmuster der Durchflusszelle auf ein Blatt Papier. Der Kanal sollte etwa drei Millimeter breit sein und mit den gesamten Positionen auf dem Objektträger übereinstimmen.

Legen Sie die Zeichnung auf zwei Perfil-Stücke und machen Sie mit einem Skalpell scharfe und kontinuierliche Schnitte entlang der gezeichneten Kontur. Entfernen Sie alle gebildeten Ausstülpungen, entsorgen Sie die untere Parfümschicht, die nur verwendet wird, um eine saubere Unterstützung zu gewährleisten. Legen Sie dann den Objektträger mit den angebrachten Nano-Ports verkehrt herum in die metallische Halterung.

Richten Sie den Umriss der Paraform-Kammer vorsichtig an den Löchern aus, stellen Sie sicher, dass der Parameter die Ein- und Auslässe der Kammerabdeckung nicht mit einem gereinigten Mikroskopabdeckungsschub extrudiert, und entfernen Sie vorsichtig überschüssige Parameter, die die Kammer umgeben. Platzieren Sie zwei zuvor auf 120 Grad Celsius erhitzte Heizblöcke auf der Durchflusszelle, um einen homogenen Druck auf sie auszuüben. Lassen Sie die Para-Folie ca. 25 Minuten schmelzen.

Der nächste Schritt ist die Vorbereitung des Druckbehälters und der Pufferbehälter. Der Druckbehälter besteht aus Plexiglas und ermöglicht die Aufnahme von bis zu sechs Pufferbehältern. Schließen Sie zunächst die Absperrventile am Ausgang der Pufferbehälter an, um den Pufferstrom mit dem Ventilhebel in vertikaler Stellung einzuschalten oder in der rechtsdrehenden Stellung aus.

Montieren Sie während der Experimente die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch. Verbinden Sie dann die Absperrventile durch die Polyether-, Etherketon- oder Spitzenschläuche und die flanschlosen Spinnen mit den Einlässen der Durchflusskammer. Der Peakschlauch hat einen Innendurchmesser von etwa 150 Mikrometern, etwa drei Zentimeter fluorierter Ethylen-Propylen-Schlauch mit einem Innendurchmesser von etwa 500 Mikrometern dienen als Bindeglied zwischen dem Peakschlauch und den Nanoport-Baugruppen der Durchflusszelle.

Dies ist wichtig, um den Pufferfluss am Kammereingang zu reduzieren und einen Bruch der Durchflusszelle oder eine Ablösung des Nanoports vom Glas zu vermeiden. Die Verwendung von Rohren mit großem Innendurchmesser allein würde jedoch große Mengen an biologischen Proben erfordern. Verbinden Sie den Auslass der Durchflusskammer mit einem offenen Falcon-Rohr bei Atmosphärendruck.

Dieses Rohr dient als Entsorgung für den aus der Strömungskammer ausströmenden Puffer. Um diesen Vorgang zu starten, geben Sie einen Milliliter Puffer A in jeden der Pufferbehälter und üben Sie einen Druck von 200 Millibar aus, um die Verbindungsschläuche und die Durchflusszelle zu waschen. Ein Druckregelsystem ist dazu in der Lage.

Zum Schluss wird der Luftdruck im Druckbehälter eingestellt. Prüfen Sie, ob Luftblasen vorhanden sind, die die Fließruhe beeinträchtigen könnten. Ein sanfter Schlag auf das Auslassrohr hilft, verbleibende Blasen zu entfernen, den Druck auf 20 Millibar zu senken und sicherzustellen, dass alle Kanäle und Rohre frei von Luftblasen sind und dass der Puffer in allen Kanälen mit ähnlichen Geschwindigkeiten fließt.

Bereiten Sie die Proben auf ein Endvolumen von 300 Mikrolitern vor. In diesem Experiment werden Streptor-beschichtete Polystyrolkügelchen, lineare DNA, die an beiden Extremitäten biotinyliert ist und spezifische Zielsequenzen für die Laktoserepressorbindung enthält, und fluoreszenzmarkiertes Laktoserepressorprotein verwendet. Geben Sie jede Probe in der folgenden Reihenfolge in einen der Spritzenbehälter: Kügelchen im ersten Kanal, DNA im zweiten, der Bildgebungspuffer im dritten und das markierte Protein im vierten Kanal.

Schalten Sie den Durchfluss bei 20 Millibar ein und öffnen Sie die Absperrventile, damit die Proben in den Durchflusskanal gelangen. Dies ist im Raupenkanal leicht zu erkennen. Während Sie den ersten Kanal unter Hellfeldbeleuchtung abbilden, schalten Sie die beiden optischen Pinzetten ein und fangen Sie in jeder Falle eine Styroporperle.

Bewege dich schnell zum zweiten Kanal, um zu vermeiden, dass die anderen Perlen in die Fallen fallen. Beachten Sie, dass die Ankunft im DNA-Kanal am Ende des Bead-Flusses leicht erkennbar ist. Unter Verwendung eines optischen AO-Deflektors oder einer OD-Bewegung bewegt sich eine Trap-Perle in der Nähe der anderen Perle hin und her, um die Anheftung der flussverlängerten DNA zwischen den beiden optisch gefangenen Kügelchen zu ermöglichen.

Wenn eine DNA-Hantel gebildet wird, beginnt die statische Perle, der Bewegung der Perle zu folgen, die von der Falle aktiv hin und her bewegt wird. Wechseln Sie schnell zum Pufferkanal und schalten Sie den Pufferfluss aus. Führen Sie eine Kraftverlängerungskurvenanalyse durch, um das Vorhandensein eines einzelnen DNA-Moleküls zu überprüfen.

Dies wird erreicht, indem die beiden Kügelchen getrennt werden, während die DNA-Spannung gemessen wird. Sobald Sie eine einzelne DNA-Hantel erhalten haben, schalten Sie den Fluss wieder ein und bewegen Sie die Hantel zum Proteinkanal. Wechseln Sie zur Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, um die Interaktion des markierten Laktoserepressorproteins mit der DNA zu überwachen, schalten Sie den Fluss aus und starten Sie die Erfassung.

Diese Methode ermöglicht den Nachweis einzelner Laktoserepressor- oder Lac-Eye-Moleküle, die mit einem gedehnten DNA-Molekül interagieren. In diesem repräsentativen CH-Agramm diffundiert ein einzelnes Lac-Eye-Molekül entlang unspezifischer DNA-Sequenzen, während ein anderes Lac-Eye-Molekül spezifisch an einen Operator gebunden ist, der sich im Zentrum des DNA-Moleküls befindet. Dieses Diagramm zeigt die Position der beiden Lac-Eye-Moleküle entlang der Richtung, die die Zentren der beiden Fallen verbindet.

Als Funktion der Zeit wurden die Positionen der Moleküle durch den radialen Symmetriezentrumsalgorithmus bestimmt. Hier ist ein Diagramm der mittleren quadratischen Verschiebung oder MSD über der Zeit für ein einzelnes Lac-Eye-Molekül, das entlang eines gestreckten DNA-Moleküls diffundiert. Der Diffusionskoeffizient des Proteins kann leicht aus der linearen Regression der Daten ermittelt werden. Die Kombination von Manipulations- und Bildgebungsverfahren ist eine leistungsfähige Methode, die die mechanische Kontrolle eines einzelnen biologischen Polymers wie D-N-A-R-N-A oder eines Zytoskelettfilaments und die gleichzeitige Lokalisierung einzelner Proteinmoleküle ermöglicht, die mit dem Polymer selbst interagieren.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kombination von Einzelmolekülmanipulation und bildgebenden Verfahren eine sorgfältige Gestaltung des Versuchsaufbaus erfordert, um die Stabilität des suspendierten Polymers im Nanometerbereich zu gewährleisten. Auf der anderen Seite ist ein ordnungsgemäßes Design der biologischen Sonde erforderlich, um eine besondere Trennung zwischen dem fallenden G-Laser und der Fluoreszenzsonde zu gewährleisten. Einzelheiten entnehmen Sie bitte dem beigefügten Protokolltext.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das DNA-Molekül zwischen den beiden optischen Schnellschlägen zusammensetzen, die den Zusammenbau dieses Konstrukts besiegen. Dies ist besser mit der Mehrkanal-Durchflusszelle zu erreichen, für die wir die detaillierte Beschreibung bereitgestellt haben. Wir haben auch gezeigt, wie Sie den Pufferfluss optimieren und die Luftblasen entfernen können, die sonst Ihre Experimente beeinträchtigen könnten.

Im Kombinationstextprotokoll finden Sie die Protokolle zur Markierung der DNA mit bioTE, die für die Assemblierung mit den Streptavidin-beschichteten Beats erforderlich ist, sowie die Protokolle zur Markierung des Proteins. Schließlich veranschaulichten wir die Schritt-für-Schritt-Operationen, um die Bindung und Diffusion eines einzelnen laktoserepressiven Proteins an einem Stretch-DNA-Molekül zu quantifizieren.