Visualisierung der Interaktion zwischen dem Qdot-markierten Protein und ortspezifisch modifizierte λ-DNA auf der Einzelmolekül-Ebene

Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Einzelmolekül-Bildgebung von DNA-Protein-Interaktionen wie DNA-Replikation, Genreparatur und Aufrechterhaltung der Chromosomenstruktur zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man modifizierte Lambda-DNA mit hohem Kollagengehalt erhalten und dann die markierten Proteine schnell aushärten kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Montageschritte der Durchflusszellen schwer zu erlernen sind.

Um die Deckgläser zu reinigen, legen Sie 20 Deckgläser in vier Färbegläser, gießen Sie Ethanol hinein und beschallen Sie sie 30 Minuten lang in Ethanol. Spülen Sie dann die Deckgläser dreimal mit Reinstwasser ab. Anschließend beschallen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit einem molaren Kaliumhydroxid und spülen Sie die Deckgläser dreimal mit Reinstwasser ab.

Wiederholen Sie dann einmal die Beschallung mit Ethanol und Kaliumhydroxid. Beschallen Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit Aceton und spülen Sie sie dann gründlich mit Reinstwasser ab. Legen Sie nun die Deckgläser in die Piranha-Lösung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 95 Grad Celsius.

Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation fünfmal mit Reinstwasser ab. Waschen Sie dann jedes Deckglas ausgiebig mit Reinstwasser. Trocknen Sie das Deckglas mit Papier an der Kante ab und legen Sie es in ein Fleckenglas.

Trocknen Sie das Deckglas gründlich in einem 110 Grad Celsius heißen Ofen. Spülen Sie nun das Deckglas mit Methanol aus und stellen Sie dann das Färbeglas wieder in den 110 Grad Celsius heißen Ofen, um das Deckglas zu trocknen. Um eine Deckglas-Funktionalisierung durchzuführen, geben Sie 70 Milliliter Silanlösung in jedes Glas, schrauben Sie den Deckel auf und lassen Sie das Glas über Nacht bei Raumtemperatur stehen.

Waschen Sie die Deckgläser mit drei Bechergläsern, die mit Reinstwasser gefüllt sind. Trocknen Sie die Deckgläser gründlich mit Stickstoffgas. 150 Milligramm Methoxy-PEG und sechs Milligramm Biotin-PEG werden in einem Milliliter frisch zubereitetem 0,1 molaren Natriumbicarbonat gelöst.

Eine Minute lang bei 17.000 g zentrifugieren, um unlösliche PEGs zu entfernen. Pipettieren Sie nun 100 Mikroliter PEG-Lösung auf die Mitte des silanisierten Deckglases und legen Sie ein weiteres silanisiertes Deckglas darauf. Inkubieren Sie die Deckgläser mindestens drei Stunden lang im Dunkeln mit PEG-Lösung.

Trennen Sie die Deckglaspaare und halten Sie die funktionalisierte Oberfläche nach oben. Spülen Sie die Deckgläser ausgiebig mit Reinstwasser ab und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas ab. Markieren Sie nun die funktionalisierte Seite der Deckgläser an einer der Ecken mit einem Filzstift.

Legen Sie ein Deckglas in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit einem Loch an der Kappe gebohrt ist. Legen Sie das Röhrchen in eine Plastiktüte, verschließen Sie den Beutel mit einem Vakuumierer und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius. Um die Durchflusszelle zusammenzubauen, schneiden Sie mit einem Locher einen Kanal in der Mitte eines Stücks doppelseitigem Klebeband ab.

Ziehe die Papierseite des doppelseitigen Klebebandes ab und klebe es auf eine Glasseite mit zwei Löchern. Es ist einfacher, Luftblasen durch Abziehen der Papierseite zu entfernen als die Kunststoffseite des doppelseitigen Klebebandes. Drücken Sie auf das Klebeband, um Luftblasen zu entfernen.

Schneiden Sie dann ein funktionalisiertes Deckglas mit einem diamantbestückten Glasstift in vier Stücke und entfernen Sie den Schmutz mit Stickstoffgas, wobei Sie die funktionalisierte Seite nach oben halten. Ziehen Sie die Kunststoffseite des doppelseitigen Klebebandes ab und kleben Sie die Folie auf das funktionalisierte Deckglas. Drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen zwischen dem Deckglas und dem Klebeband zu entfernen.

Durch die gründliche Entfernung von Luftblasen kann die Durchflusszelle vor Undichtigkeiten geschützt werden, während Puffer in die Durchflusszelle gepumpt werden. Führen Sie nun den Zulaufschlauch in das kleine Loch ein und führen Sie den Auslassschlauch in das große Loch ein. Fixieren Sie den Schlauch mit Epoxidharz.

Pumpen Sie manuell 20 Mikroliter 0,2 Milligramm Streptavidin pro Milliliter mit einer Spritze in die Durchflusszelle und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Pumpen Sie dann den Blockierungspuffer in die Durchflusszelle, um Streptavidin zu ersetzen und bei Raumtemperatur zu halten. Die fokale Ausrichtung von Rot und Fernrot mit A5 auf dem Fluoreszenzmikroskop-Testobjektträger Nummer eins wird durch gleichzeitige Anregung mit einem 532-Nanometer-Laser und einem 640-Nanometer-Laser ermittelt.

Erzeugen Sie Bilder mit zwei Wellenlängen mit Splitting-Optik. Platzieren Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskop und verbinden Sie den Auslassschlauch mit einem längeren Schlauch, der mit einer 10-Milliliter-Feder verbunden ist, die an einer programmierbaren Pumpe mit automatischer Infusionsentnahme installiert ist. Entfernen Sie Luftblasen in der Durchflusszelle, indem Sie den Blockierungspuffer einspritzen und den Auslassschlauch umdrehen.

Fügen Sie 0,5 Mikroliter biotinylierte Lambda-ARS317-DNA in 80 Mikroliter Blockpuffer hinzu. Pumpen Sie das vorbereitete Gemisch zwei Minuten lang mit 25 Mikrolitern pro Minute in die Durchflusszelle. Spülen Sie dann die Lambda-ARS317-DNA mit 200 Mikrolitern Blockierungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Minute.

Pumpen Sie nun 200 Mikroliter Bindungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 50 Mikrolitern pro Minute, um den blockierenden Puffer in der Durchflusszelle zu entfernen. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter ORC-Qdot705, einen Mikroliter DTT und einen Mikroliter ATP in 96 Mikroliter Bindungspuffer hinzu. Die Endkonzentration von ORC-Qdot705 beträgt 0,2 Nanomolar.

Nach dem Pumpen des Bindungspuffers, wie im Textprotokoll beschrieben, pumpen Sie 20 Mikroliter der vorbereiteten ORC-Qdot705-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute in die Durchflusszelle. Spülen Sie überschüssiges ORC-Qdot705 mit 200 Mikrolitern Bindungspuffer mit einer Geschwindigkeit von 100 Mikrolitern pro Minute aus. Pumpen Sie dann Bindungspuffer mit 30 nanomolaren SYTOX Orange in die Durchflusszelle, um DNA-Substrate mit einer Geschwindigkeit von 100 Mikrolitern pro Minute zu färben.

Stimulieren Sie schließlich das ORC-Qdot705-Signal mit einem 405-Nanometer-Laser und regen Sie das SYTOX Orange-gefärbte DNA-Signal mit einem 532-Nanometer-Laser an. Beobachten Sie die Signale gleichzeitig mit einem Durchfluss von 100 Mikrolitern pro Minute mit einem Quad-Band-Bandpassfilter. Nehmen Sie die Bilder per EMCCD mit 100 Millisekunden pro Frame auf.

Die Abbildung des DNA-Substrats lambda-ARS317 ist hier dargestellt. Qdot705-markierter ORC wurde mit einem 405-Nanometer-Laser angeregt. Die mit SYTOX Orange gefärbte DNA wurde mit einem 532-Nanometer-Laser angeregt.

Das zusammengeführte Ergebnis deutet darauf hin, dass Qdot705-markiertes ORC an ARS317 bindet. Das Ergebnis der ORC-Bindungsverteilung an lambda-ARS317-DNA zeigt, dass ORC mit einer hohen Häufigkeit an ARS317 bindet. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Einzelmolekül-FRET durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteindynamik zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Einzelmolekül-Fluoreszenzbildgebung, um DNA-Protein-Wechselwirkungen in rekonstituierten Systemen der DNA-Replikation und DNA-Reparatur in vitro zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Gesichtsschutzmasken bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten.