Name: Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Expression und Reinigung glykosylierter Säugetierproteine in 293F-Zellen für strukturbiologische Studien. Dieses Protokoll liefert milligrammreine Proteine für Kristallisation und biophysikalische Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01-HL119813 (an T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (an T.J.B.), einem CIMED Pilot and Feasibility Grant (an T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (an Z.Y.) und 15PRE22110004 (an D.L.K.).

1. Herstellung von Milligramm-Mengen von Plasmid-DNA für eine groß angelegte Transiente Transfektion <ol><li> Klonierung des Proteins von Interesse in einer hohen Kopienzahl Säuger-Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsstelle Klonierung oder andere geeignete Technik. <ol><li> Für optimale Ergebnisse verwenden pHLsec 7 Vektor, der hat einen eingebauten in C-terminal 6His-tag, ein starker Promotor Kozak-Sequenz und eine optimierte Sekretionssignal. </li></ol></li><li> Verwandeln Sie das Plasmid auf kompetente Zellen. <ol><li> Mit 20 ul kompetenter E. coli-Zellen auf 1 &amp; mgr; g Plasmid-DNA und Inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> Hitzeschock-Zellen bei 42 ° C für 35 sec, dann auf Eis für 2 min inkubiert. </li><li> Werden 300 &amp; mgr; l mikrobielle Wachstumsmedium (SOC) und bei 37 ° C für 45 Minuten, bei 220 UpM schüttelnd. </li><li> Platte Zellen auf Agar-Platte mit geeigneten Antibiotika-Selektion. <ol><li> Verwenden von 100 &amp; mgr; g / ml Carbenicillin, wenn das Plasmid in der pHLsec vector. </li></ol></li></ol></li><li> Kultur Kolonien in 250 ml Luria Broth (LB) Medium, ergänzt mit 100 ug / ml Antibiotikum (Carbenicillin) O / N bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln. </li><li> Reinigen DNA aus der Kultur unter Verwendung von Hallo-Geschwindigkeit Plasmid Maxi Kit nach Herstellerprotokoll. <ol><li> Eluieren der DNA in Puffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) anstelle von Puffer TE. </li><li> Aliquots des gereinigten Plasmids an Menge für die Transfektion und Speicherung erforderlich bei -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Großflächige, Kultur und transiente Transfektion von Zellen 293F <ol><li> Supplement 1 L 293F Medien mit 10 ml Glutamin und 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Lagerung bei 4 ° C. 5 ml Pen / Strep ist eine ausreichende Festigkeit in serumfreien Bedingungen und das reduzierte antibiotische Konzentration verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen während der Transfektion, die Proteinausbeute verbessert. </li><li> Kultur 293F-Zellen in 300 ml Medium in 1 L Polycarbonat Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappes bei 37 ° C und 8% CO 2, während sie in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator Schütteln. </li><li> Verdünnte Zellen bis 5 x 10 5 / ml Dichte einen Tag vor der Transfektion. </li><li> Am Tag der Transfektion Ergänzung Kulturmedium durch Zugabe von 10% Volumen von 2% w / v Cell Boost in 293F Medien. <ol><li> Messung der Glucosekonzentration unter Verwendung einer Glukoseüberwachungsvorrichtung gemß den Anweisungen des Herstellers und die Verwendung Ergänzungsmittel erforderlich, um eine Glukosekonzentration von 500 mg / dl zu erreichen. </li></ol></li><li> Hinzufügen kifunensine (1 ug / ml Endkonzentration) bei diesem Schritt zu Proteinglykosylierung steuern. </li><li> Berechnung des Volumens von DNA 1 &amp; mgr; g Plasmid pro 1 x 10 6 Zellen benötigt. Unter sterilen Bedingungen, verdünnte DNA in 5 ml serumfreiem Medium. </li><li> Berechnen Sie Volumen von Transfektionsreagenz für 1 &amp; mgr; g Plasmid pro 2 ul Transfektionsreagenz erforderlich. Unter sterilen Bedingungen, verdünnten Transfektionsreagenz (PEI-TMC-25) in 5 ml serumfreiem Medium. </li><li> HinzufügenTransfektionsreagenz in die DNA-Lösung in 1 ml-Schritten, Mischen sanft. Inkubation 30 min bei RT Reagenz-DNA-Komplexe zu bilden. Dann fügen Sie die Lösung auf die Zellen in einer tropfenweise Mode. </li><li> Erlauben transfizierten Zellen an Protein für 72 bis 96 h zum Ausdruck bringen. Ergänzung mit ~ 10% Volumen Cell Boost Medien täglich, oder wie erforderlich, zu halten Glukosemesswert von 400 bis 600 mg / dl. </li></ol> 3. Reinigung <ol><li> Dekantier-Kultur in ein Zentrifugenflasche, Zentrifuge für 20 min bei 1.300 × g Zellen zu pelletieren und zu sammeln, dann den Überstand. Wenn nötig, drehen ein zweites Mal und / oder verwenden 0,22 um Filter, um Überstand zu klären. </li><li> Zugabe von 10% Volumen 10x Ni-NTA-Bindungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM Imidazol). </li><li> Vorbereitung einer Schwerkraftsäule durch Zugabe von 2 ml von Ni-NTA-Aufschlämmung in einer Spalte und Äquilibrieren mit 10 Säulenvolumina (CV) des 1x Bindungspuffer. Wenn möglich, alle Spalten Schritte in einem 4 ° C Raum. AlternativEly, Chill-Protein und alle Puffer auf Eis vor der Spalte Schritt, und halten Protein und gesammelt Durchfluss auf Eis. Anmerkung: Ni-NTA-Aufschlämmung beträgt 50% Harz nach Volumen und angegebenen Bindungskapazität des Herstellers beträgt 50 mg / ml. Für mehrfachen Gebrauch Ni-NTA-Perlen kann wieder aufgeladen werden </li><li> Fließt der Überstand über das Harz und sammeln Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Waschen mit 10 CV Waschpuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM Imidazol, pH 8). </li><li> Eluieren des Proteins in 5 CV Elutionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM Imidazol, pH 8). </li><li> Wenn Deglykosylierung ist erforderlich: <ol><li> Bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml Konzentrat Eluat 0,43 ml unter Verwendung einer Zentrifugation Konzentrator. Wenn Niederschläge gebildet, pelle jede Trümmer durch Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 ° C. </li><li> In 50 ul 500 mM Na-Citrat pH 5,5. </li><li> Mit 20 ul EndoHf (1 x 10 &amp; sup6; U / ml). Inkubation bei RT für 2 h. NichtE: Das Enzym arbeitet optimal bei 37 ° C, was dazu führen kann die konzentrierte Protein zu aggregieren. Verlängern Sie die RT Inkubation wenn Deglykosylierung, durch SDS-PAGE und Immunoblotting untersucht, ist unvollständig. Das Enzym muss nicht Aktivität bei 4 ° C. </li><li> Um EndoHf entfernen: Wash Amyloseharz 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Endlagerung Puffer. Inkubieren Protein mit Harz für 1 h bei 4 ° C. Spin 5 min bei 1000 xg zu pelletieren Perlen und sammeln Sie den Überstand. </li><li> Konzentrat Protein unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsgrenze Zentrifugation Filter und Pufferaustausch in Lagerungspuffer (150 mM NaCl und 20 mM HEPES pH 7.5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

HEK 293F-Zellen bieten robuste Produktion von Proteinen erfordert post-translationale Modifikationen. Dieses System ermöglicht eine schnelle und skalierbare Ausdruck der nativ gefalteten Proteine ​​enthalten, Disulfide, Glykosylierung und Phosphorylierung, die sonst mit mehr Routine Expression Tools abwesend sein würde. Darüber hinaus kann dieses System für die Expression und Reinigung von Multiproteinkomplexen einfach durch Co-Transfektion von mehreren Plasmiden verwendet werden. Neben TREM2 Dieses System wurde ausgieb...

Das Verständnis von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ist der Schlüssel zur Aufdeckung der molekularen Grundlagen der biologischen Wege und Krankheiten. Röntgen Proteinkristallographie ist das am häufigsten verwendete / anwendbares Verfahren zur Bestimmung von hochmolekularen Strukturen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist, ausreichende Mengen an korrekt gefalteten, reines Protein. Dies wird ein Problem besonders bei der Arbeit mit sezerniertes Säugerproteinen, die bestimmte post-translationale Modifikationen unterzogen werden. Bakteriell exprimierten Proteine ​​sind die Hauptquelle für kristallisierte Proteine ​​in der Proteindatenbank 1 abgeschieden. Bakterielle Expressionssysteme sind weitgehend bevorzugt, da sie schnell, kostengünstig und erzeugen typischerweise hohe Ausbeuten an Protein. Jedoch extrazellulären Domänen von Säugerproteinen in Bakterien exprimiert werden oftmals nicht richtig gefaltet sind, zum Erhalten homogen fo in welchem ​​Fall die Rückfaltung und aufwendige Reinigungsschritte erforderlich sindlded Protein. Darüber hinaus haben viele Säugetierproteinen erfordern posttranslationale Glykosylierung, um die richtige Faltung 2 zu erzielen. Obwohl die Expression und Glycosylierung in Hefe oder Insektenzellen können die Falte Problem zu überwinden, post-translationale Modifikationen einschließlich Glykosylierung, unterscheiden sich erheblich von denen von Säugetierzellen 3, wodurch Proteine, die mit fehlerhaften oder nicht homogenen Modifikationen. Säugerzellen alle erforderlichen molekularen Maschinerie zum richtigen post-translationalen Modifikationen und Faltung zu gewährleisten; aber diese Expressionssysteme sind in der Regel nicht von den meisten Labors bevorzugt, aufgrund der begrenzten Ausbeuten und hohen Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Polyethylenimin (PEI), ist ein Standard-Transfektionsreagenz relativ billig, aber erlegt beträchtliche Zytotoxizität und niedrige Transfektionseffizienz, was zu erhöhten Kosten in Zellmedien, DNA, und Kultivieren Ausrüstung. Viele Alternativen zu PEI sind unerschwinglich teuer. Wir sprechenDiese Probleme mit der Beschreibung einer Kombination von verbesserten Zellkulturwerkzeuge und chemisch modifizierte PEI für die schnelle und relativ kostengünstige Methode für die Expression von sezernierten Säugetierproteinen, gefolgt von der Einzelschritt-Reinigung. Das robuste Verfahren ergibt ausreichende Ausbeuten zur funktionellen und biochemischen Untersuchungen 4 und in einigen Fällen führt Protein zugänglich, um die Kristallisation ohne weitere Reinigung. Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Techniken, um die Expression zu maximieren und die Ausbeute für sezernierte Säugetierproteinen in humanen embryonalen Nieren (HEK) 293F Zellen in Suspension gezüchtet. Transfektionseffizienz (und Kosten), Protein-Produktion und Reinigung sind alle stark von folgenden dieses Protokoll erweitert. PEI durch Zugabe von Carbamaten durch eine Einzelschritt-Ringöffnungsreaktion modifiziert (PEI-TMC-25 Synthese und Eigenschaften im Detail in Lit. 5 beschrieben) verbessert Transfektionseffizienz, verringert die Zytotoxizität von kationischenMembranzerstörung und entsprechend reduziert Experiment Kosten. Weiterhin werden die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proteinexpression stark mit der Zugabe der Kultur Ergänzungen Glucose und Vitamine zuzuführen verbessert. Wichtig ist für die Herstellung von glycosylierten Proteinen, Behandlung mit kifunensine, eine ungiftige chemische Inhibitor von Mannosidase I, produziert Proteine ​​mit definierten, unreife Glycane, die durch die Endoglycosidase EndoHf entfernt werden, um Proteine ​​mit einer einzelnen N-Acetylglucosamin anstelle von zu ergeben ein voller Länge N-gebundene Glycan 6. Schließlich wird die Sekretion von Proteinen in einem serumfreien, chemisch definierten Medium ermöglicht eine schnelle und leichte Reinigung für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Einzelschritt-Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA-Harz) Reinigung entfernt die meisten verunreinigenden Spezies im Überstand und in einigen Fällen kann Protein mit ausreichender Reinheit für eine Kristallisation ergeben.

<table><tbody><tr><td>Kulturflaschen</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Verwendung anstelle von Glutamin</td></tr><tr><td>Hype 5 Transfektionsreagenz</td><td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293fectin Transfektionsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>12347019</tr><tr><td>PEI-Transfektionsreagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Amyloseharz</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Zellkulturergänzung</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>Glukosemesssystem</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Serum Freies Medium für DNA-Transfektion</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Kompetente Zellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente mammalian cell expression und single-step reinigung der extrazellulären glykoproteinen für die kristallisation

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Die Produktion von sezernierten Säugetierproteinen für strukturelle und biophysikalische Studien kann herausfordernd, zeitintensiv und kostspielig sein. Hier wird ein zeit- und kosteneffizientes Protokoll für die sekretierte Proteinexpression in Säugetierzellen und eine einstufige Aufreinigung mittels Nickel-Affinitätschromatographie beschrieben. Das System basiert auf der großflächigen transienten Transfektion von Säugetierzellen in Suspension, wodurch die Zeit bis zur Proteinproduktion erheblich verkürzt wird, da Schritte wie die Entwicklung von Expressionsviren oder die Erzeugung stabiler exprimierender Zelllinien entfallen. Dieses Protokoll verwendet billige Transfektionsmittel, die leicht durch einfache chemische Modifikation hergestellt werden können, oder preisgünstige Transfektionsmittel, die die Ausbeute durch erhöhte Transfektionseffizienz und verringerte Zytotoxizität erhöhen. Die sorgfältige Überwachung und Aufrechterhaltung des Glukosespiegels in den Medien erhöht die Proteinausbeute. Die Kontrolle der Reifung nativer Glykane im Expressionsschritt erhöht die endgültige Ausbeute an richtig gefalteten und funktionellen Säugetierproteinen, was ideale Eigenschaften für die Röntgenkristallographie sind. In einigen Fällen wird durch die einstufige Aufreinigung ein Protein von ausreichender Reinheit für die Kristallisation erzeugt, was hier als Beispielfall demonstriert wird.

Hierin folgt die Ergebnisse dieser Expressionssystem zu einem sekretierten 13 kDa-Immunglobulin (Ig) -Domäne von menschlichem Protein Auslöse Rezeptor auf myeloide Zellen 2 (hTREM2, Reste 19 bis 132) angegeben angewendet wird. TREM2 ist ein Typ I Transmembranprotein, das eine einzelne extrazelluläre Ig-Domäne, die zwei Disulfidbrücken und zwei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen aufweist. Im Gegensatz zu anderen Ig-Domänenproteine ​​8 wurde TREM2 nicht zugänglich Rückfaltung aus bakteriellen Einschlusskörpern...

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik zur Expression von Säugetierproteinen besteht darin, Milligramm-Mengen korrekt gefalteter Proteine herzustellen, die für strukturelle, biophysikalische und funktionelle Untersuchungen geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in ihrem schnellen und einfachen Protokoll zur Gewinnung sezernierter Säugetierproteine in der für strukturelle Analysen erforderlichen Reinheit und Konzentration. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass die meisten Probleme mit der Proteinausbeute auf die Zellgesundheit und -lebensfähigkeit zurückzuführen sind.Durch die sorgfältige Überwachung der Zellviabilität sowie der Zuckerkonzentration im Medium verbessern Sie sowohl die Proteinausbeute als auch die Nutzungsdauer der Zellen erheblich. Ebenso wichtig ist die Überwachung der Zelldichte. Wir stellen fest, dass die Proteinausbeute stark abnimmt, wenn die Zellen vor der Transfektion jemals 2 Millionen Zellen pro Milliliter überschreiten. Für den Großkultivierungsansatz von 293F-Zellen ergänzen Sie einen Liter 293F-Medium mit 10 Millilitern 100 x Glutamin und fünf Millilitern 100 x Pen/Strep.Das Antibiotikum weist unter serumfreien Bedingungen eine ausreichende Wirkstärke auf, und die reduzierte Antibiotikakonzentration verbessert die Zellviabilität während der Transfektion, was die Proteinausbeute in der Kultur erhöht. Die 293-F-Zellen in 300 Milliliter Medium in einem Liter Polycarbonat-Erlenmeyerkolben mit eingebauten Baffeln und belüfteten Deckeln bei 37 Grad Celsius mit 8 % Kohlendioxid unter Schütteln in einem Standard-Gewebekulturinkubator einen Tag vor der Transfektion werden am Tag der Transfektion auf eine Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter verdünnt. Ergänzen Sie das Kulturmedium durch Zugabe von 10 % Volumen eines 2 % Gewicht pro Volumen enthaltenden Cell Boost in 293-F-Medium.Fügen Sie in diesem Schritt Kafu hinzu, um die Protein-Glykosylierung zu kontrollieren. Bereiten Sie DNA- und Transfektionsreagenzlösungen in serumfreiem Medium vor und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Geben Sie anschließend das Transfektionsreagenz in Ein-Milliliter-Schritten zur DNA-Lösung hinzu und mischen Sie dabei gut.Vorsichtig 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die DNA-Reagenz-Komplexe bilden können. Anschließend die Lösung tropfenweise zu den Zellen geben und den transfizierten Zellen 72 bis 96 Stunden zur Proteinausprägung Zeit lassen, um das Glykoprotein zu reinigen. Zunächst den Kulturüberstand in ein Zentrifugenfläschchen gießen und 20 Minuten bei 1300 × g zentrifugieren. Die Zellen als Pellet abtrennen, den Überstand sammeln und gegebenenfalls ein zweites Mal zentrifugieren oder über einen 0,22-Mikrometer-Filter klären, um den Überstand zu reinigen.Fügen Sie anschließend 10 % des Volumens von 10× Nickelnitroladepuffer, Triessigsäure oder Nickel-NTA-Bindungspuffer hinzu. Bereiten Sie dann eine Säule für die Schwerkraftchromatographie bei vier Grad Celsius vor, indem Sie zwei Milliliter der Nickel-NTA-Suspension in eine Säule geben und mit 10 Säulenvolumina von 1× Bindungspuffer, der bei vier Grad Celsius arbeitet, equilibrieren. Lassen Sie das Überstand über das Harz fließen und sammeln Sie den Durchlauf.Nachdem das überstehende Filtrat über die Säule gegeben wurde, die Säule mit 10 Säulenvolumina Waschpuffer waschen. Anschließend das Protein mit fünf Säulenvolumina Elutionspuffer eluieren. Falls eine Entzuckerung für ein Endvolumen von 0,5 Milliliter erforderlich ist, das EIT unter Verwendung eines Zentrifugalkonzentrators auf 0,43 Milliliter konzentrieren und Verunreinigungen durch Zentrifugation bei 16.000 ×g und 4 °C als Pellet abtrennen.Anschließend 50 µL 500 mM Natriumcitrat, pH 5,5 und 20 µL Endo HF hinzufügen. Die Mischung zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um zunächst das Endo HF zu entfernen. Amyloseharz dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen. Das Protein eine Stunde bei vier Grad Celsius mit dem gewaschenen Harz inkubieren.Nach der Inkubation fünf Minuten bei 1000 G zentrifugieren, um das Harz zu pelletieren, und das Überstand aufsammeln. Das Protein mit einer geeigneten molekularen Gewichtsschranke mittels Zentrifugalfilter konzentrieren und in den angegebenen Lagerpuffer umtauschen. Hier sind repräsentative SDS-Page-Ergebnisse für ein sekretiertes Protein, das in mit Cine behandelten Zellen exprimiert wurde, nach Nickel-Affinitätschromatographie.Die erste Spur zeigt das Protein vor der Entzuckerung, und die zweite Spur zeigt das Protein nach der Entzuckerung durch Endo Hf. Das glykosylierte Protein wandert etwa 10 Kilodalton höher und zieht sich danach zu einer einzelnen Bande zusammen, die mit dem vorhergesagten molekularen Gewicht nach der Entzuckerung übereinstimmt, und zwar nach dem einzigen Reinigungsschritt. Kristallisationsansätze wurden mit der Hänge-Tropfen-Methode eingerichtet.Das obere Bild zeigt den initialen Kristalltreffer, das untere Bild zeigt optimierte Kristallisationsbedingungen. Dies verdeutlicht, dass die biochemische Homogenität des Proteins von Interesse ein entscheidender Faktor für den Erfolg der Kristallisation sein kann, und ein optimiertes Säugetier-Expressionssystem erzeugt Proteine, die für diese Kristallisation geeignet sind. Eine weitere Reinigung des mittels Nickel gereinigten Proteins kann leicht durch Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden.Dies ist auch ein nützlicher Schritt zur Beurteilung der Proteinsynthese und zur Optimierung der Bedingungen, um korrekt gefaltete Proteine zu erhalten. Das Protein von Interesse sollte die hauptsächliche Spezies in der chromatographischen Elution sein, und das Elutionsvolumen sollte dem Molekulargewicht des Proteins entsprechen. Frühere EEU-Zeiten können auf eine Aggregation oder Fehlfaltung des Proteins hindeuten, sobald dies beherrscht ist.Diese Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Bedingungen für die Zellkultur einzuhalten. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Größenausschlusschromatographie, Mehrwinkellichtstreuung und differentielle Scanning-Fluorometrie durchgeführt werden, um den Oligomerisierungszustand und die thermale Stabilität des Proteins zu beurteilen.

efficient-mammalian-cell-expression-single-step-purification

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Protein-Komplexe katalysieren wichtige zelluläre Funktionen. Detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung von vielen wesentlichen Komplexe erfordert rekombinante Herstellung. MultiBac ein Baculovirus / Insektenzellen-System insbesondere zur Expression von eukaryontischen Proteinen und ihren Komplexen zugeschnitten. MultiBac wurde als Open-Access-Plattform, und Standard Operating Procedures entwickelt, um seinen Nutzen zu maximieren implementiert.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Ansätze für die biophysikalischen und strukturelle Charakterisierung von Glykoproteinen präsentieren wir mit der Immunglobulin-Falte Biolayer Interferometrie, Isothermen Titration Kalorimetrie und Röntgen-Kristallographie.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Bestimmung der Ionen-Kanalstrukturen von Kryo-Elektronenmikroskopie, darunter ein Baculovirus-System verwendet, um effizient Gene in Säugerzellen mit minimalem Aufwand und Toxizität, Proteingewinnung, Reinigung, und Qualitätsprüfung, Raster Probenvorbereitung und Screening, sowie Datenerfassung und Verarbeitung.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Expression und Reinigung glykosylierter Säugetierproteine in 293F-Zellen für strukturbiologische Studien. Dieses Protokoll liefert milligrammreine Proteine für Kristallisation und biophysikalische Analysen.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Weitere Videos entdecken