Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Das übergeordnete Ziel dieser Säugetierproteinexpressionstechnik ist es, Milligrammmengen nativ gefalteter Proteine herzustellen, die für strukturelle, biophysikalische und funktionelle Studien geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein schnelles und unkompliziertes Protokoll zur Gewinnung von sekretierten Säugetierproteinen und einer für Strukturstudien erforderlichen Reinheitskonzentration handelt. Im Allgemeinen stellen wir fest, dass die meisten Probleme mit der Proteinausbeute auf die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zurückzuführen sind.

Durch die genaue Überwachung der Lebensfähigkeit der Zellen und auch der Überwachung des Zuckergehalts in den Medien verbessern Sie sowohl die Proteinausbeute erheblich als auch die Nützlichkeit der Zellen. Es ist auch sehr wichtig, die Zelldichte zu überwachen. Wir stellen fest, dass, wenn die Zellen zu irgendeinem Zeitpunkt vor der Transfektion 2 Millionen Zellen pro Milliliter überschreiten, die Proteinausbeute stark reduziert wird. Um eine großmaßstäbliche Kultur von 2 93 F-Zellen durchzuführen, ergänzen Sie einen Liter 2 93 F-Medien mit 10 Millilitern 100 x Glutamin und fünf Millilitern 100 x Pen Streptokokken.

Das Antibiotikum hat unter serumfreien Bedingungen eine ausreichende Stärke, und die reduzierte Antibiotikakonzentration verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen während der Transfektion, was die Proteinausbeute in der Kultur verbessert. Die 2 93 F-Zellen in 300 Millilitern Medium in einem Liter, Polycarbonat, die Erlenmeyerkolben mit belüfteten Verschlüssen bei 37 Grad Celsius und 8 % Kohlendioxid beim Schütteln in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator einen Tag vor der Transfektion verdünnen die Zellen am Tag der Transfektion auf 0,5 Millionen Zellen pro Milliliter Dichte. Ergänzen Sie das Kulturmedium durch Zugabe von 10 % Volumen oder 2 % Gewicht pro Volumen als Zellverstärkung in 2 93 F-Medien.

Fügen Sie Kafu hinzu, das in diesem Schritt zu sehen ist, um die Proteinglykosylierung zu kontrollieren. Bereiten Sie DNA- und Transfektionsreagenzlösungen in serumfreien Medien vor und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Als nächstes fügen Sie das Transfektionsreagenz in der DNA-Lösung in Schritten von einem Milliliter hinzu und mischen Sie.

30 Minuten lang bei Raumtemperatur sanft inkubieren, damit sich Reagenzien-DNA-Komplexe bilden. Geben Sie dann die Lösung auf die Zellen Lassen Sie die transfizierten Zellen tropfenweise 72 bis 96 Stunden lang Protein exprimieren, um das Glykoprotein zu reinigen. Zuerst wird die Kultur 20 Minuten lang bei 1300 Grad in eine Zentrifugenkolbenzentrifuge umgefüllt, Gs.To die Zellen pelletieren, das Supernat auffangen und bei Bedarf ein zweites Mal schleudern und/oder einen 0,22-Mikron-Filter verwenden, um den Überstand zu klären.

Als nächstes fügen Sie 10% Volumen von 10 x Nickel-Nitro-Ladung, Triessigsäure oder Nickel-NTA-Bindungspuffer hinzu. Bereiten Sie dann eine Schwerkraftsäule bei vier Grad Celsius vor, indem Sie zwei Milliliter der Nickel-NTA-Aufschlämmung in eine Säule geben und mit 10 Säulenvolumina eines x Bindungspuffers bei vier Grad Celsius äquilibrieren. Den Überstand über das Harz fließen lassen und den Durchfluss auffangen.

Nach dem Gießen fließt der Überstand über die Säulenwaschanlage mit 10 Säulenvolumenteilen Waschpuffer durch. Dann eluieren Sie das Protein in fünf Säulenvolumina Elutionspuffer. Wenn eine Deglykosylierung für ein Endvolumen von 0,5 Millilitern erforderlich ist, wird EIT mit einem Zentrifugationskonzentrator-Pellet auf 0,43 Milliliter konzentriert

Fügen Sie dann 50 Mikroliter 500 millimolare Natriumcitrat, pH 5,5 und 20 Mikroliter Endo HF hinzu. Inkubieren Sie die Mischung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um das Amyloseharz Endo HF zu entfernen, waschen Sie es zuerst dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Inkubieren Sie das Protein mit dem gewaschenen Harz für eine Stunde bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation fünf Minuten lang bei 1000 g drehen, um das Harz zu pelletieren und den Überstand aufzufangen. Konzentrieren Sie das Protein unter Verwendung eines geeigneten Molekulargewichtsgrenzwerts, eines Zentrifugationsfilters und eines Pufferaustauschs in den gezeigten Lagerpuffer. Hier sind repräsentative SDS-Seitenergebnisse für ein sezerniertes Protein, das in cine-behandelten Zellen nach Nickel-Affinitätschromatographie exprimiert wird.

Die erste Spur ist das Protein vor der Deglykosylierung, und die zweite Spur ist das Protein nach der Deglykosylierung durch Endo-HF. Das glykosylierte Protein fließt etwa 10 Kilodalton höher und kollabiert dann nach der Deglykosylierung nach dem einzigen Reinigungsschritt zu einer einzigen Bande, die mit dem vorhergesagten Molekulargewicht übereinstimmt. Die Kristallsiebe wurden nach der Methode des hängenden Tropfens aufgestellt.

Das obere Bild zeigt den anfänglichen Kristalltreffer und das untere Bild die optimierten Kristallisationsbedingungen. Dies zeigt, dass die biochemische Homogenität des interessierenden Proteins ein entscheidender Faktor für den Kristallisationserfolg sein kann, und ein optimiertes Säugetierexpressionssystem produziert Proteine, die für diese Kristallisation geeignet sind. Eine weitere Aufreinigung des nickelgereinigten Proteins kann ohne weiteres durch Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden.

Dies ist auch ein nützlicher Schritt zur Bewertung der Proteinproduktion und zur Optimierung der Bedingungen, um richtig gefaltete Proteine zu erhalten. Das Protein von Interesse sollte die Hauptspezies in der chromatographischen Elution sein, und das Elutionsvolumen sollte dem Molekulargewicht des Proteins entsprechen. Früher. EEU-Zeiten können auf eine Aggregation oder Fehlfaltung des Proteins hindeuten Sobald es beherrscht ist.

Diese Technik kann in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Bedingungen für die Zellkultur nach diesem Verfahren aufrechtzuerhalten. Andere Methoden wie Größen-, Ausschlusschromatographie, Mehrwinkel-Lichtstreuung und Differenzabtastung, Fluorometrie können durchgeführt werden, um den Oli isierungszustand und die thermische Stabilität des Proteins zu beurteilen.