In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkungen zwischen seltenen Prostatakrebszellen und E-Selektin-exprimierenden Endothelzellen mit Hilfe einer Mikro-Slide-Flow-Anordnung zu untersuchen. Dazu wird zunächst ein Objektträger mit Fibronektin beschichtet. Der zweite Schritt besteht darin, humane Endothelzellen der Nabelschnurvene oder VE in einem dynamischen Strömungssystem auf einem Mikroobjektträger mit geringer Kanalbreite zu kultivieren.

Als nächstes werden die Prostatakrebszellen mit einem anti-prostataspezifischen Membranantigen oder PSMA-humanisierten monoklonalen Antikörper markiert, der internalisiert wird. Der letzte Schritt besteht darin, die anti-PSMA-markierten Prostatakrebszellen über das e Selektin zu perfundieren, das ve exprimiert. Letztlich wird die Videomikroskopie eingesetzt, um die Wechselwirkungen zwischen Prostatakrebszellen und den Endothelzellen zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der parallelen Plattenströmungskammer und anderen dynamischen Anordnungen, besteht darin, dass Sie mit dieser Technik die Wechselwirkungen zwischen seltenen Prostatakrebszellen, wie zirkulierenden Tumorzellen und kultivierten Endothelzellen, in einem dynamischen Strömungssystem untersuchen können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Metastasierung zu beantworten, wie z.B. wie Prostatatumorzellen metastasieren sie durch das Blutgefäßsystem? Verwenden sie den gleichen Mechanismus wie die Leukozyten während ihrer Isierung?

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, da es sich um die Kultivierung einer Monoschicht von Endothelzellen in einem schmalen Kanal unter Perfusion unter der Gewebekulturhaube handelt. Spülen Sie den Mikroobjektträger zunächst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Beschichten Sie dann den Mikroobjektträger vorsichtig mit 200 Mikrolitern 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Lock-Spritze.

Decken Sie den Objektträger mit dem Deckel ab und bewahren Sie ihn 30 Minuten lang in der Gewebekulturhaube auf. Anschließend werden 200 Mikroliter warmes qve-Wachstumsmedium über den Mikroobjektträger perfundiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die langsame Abgabe der Flüssigkeit im Mikroschieber verhindert die Blasenbildung im Kanal.

Bereiten Sie während der Perfusion die Vex-Suspension vor, indem Sie Vex mit PBS spülen und 0,1 % Kollagenase plus 0,05 % EDTA in PBS für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Zentrifugieren Sie die haben in zwei Millilitern Wachstumsmedium bei 180-facher G für fünf Minuten. Messen Sie dann die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und bereiten Sie 10 Millionen Zellen pro 100 Mikroliter Wachstumsmedium vor.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Medium aus dem Einlass des Mikroobjektträgers. Bringen Sie den Mikroobjektträger mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf Augenhöhe und perfuieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Lock-Spritze vorsichtig 200 Mikroliter der vorbereiteten Vexkonzentration in den Kanal. Bei diesem Schritt ist Vorsicht geboten, um Blasenbildung zu verhindern. Wenn die Blasen auftreten, persolidieren Sie etwas länger, bis die Blasen in den Auslasskanal gelangen.

Pipettieren Sie anschließend ein gleiches Volumen von etwa 80 Mikrolitern VE-Medium sowohl in den Einlass als auch in den Auslass des Mikroobjektträgers. Dies verhindert den Fluss von Zellen in beide Richtungen. Decken Sie den Objektträger ab und bewahren Sie ihn 1,5 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator auf.

Um mit der Montage der Durchflusskammer zu beginnen, legen Sie eine sterile 20-Milliliter-Spritze, weibliche und männliche Köderanschlüsse, eine Spritzenpumpe und einen Schlauch für 15 Minuten in den Inkubator, um das Totvolumen zu minimieren. Gebrauchter Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Kleinerer Schlauchdurchmesser verhindert Blasenbildung.

Füllen Sie anschließend die 20-Milliliter-Spritze mit 12 Millilitern warmem VE-Medium. Entfernen Sie die Blase vollständig aus der Spritze. Füllen Sie den Einlauf des Objektträgers mit VE-Medium.

Verbinden Sie diese Baugruppe mit der Mikrofolie. Befestigen Sie den Auslassanschluss vorsichtig an der Mikroschiene. Bringen Sie das Setup in den Inkubator und schließen Sie es an die Spritzenpumpe an.

Stellen Sie dann die Pumpe auf eine Scherrate von 10 Mikrolitern pro Minute ein, bevor Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius im Inkubator belassen. Demontieren Sie am nächsten Tag das Setup, indem Sie den Stecker entfernen, der am Einlass des Mikroschlittens befestigt ist. Entfernen Sie dann den zweiten Auslassanschluss, um die Selektinexpression auf Endothelzellen hochzuregulieren.

Bereiten Sie frisches Wachstumsmedium vor, das Interleukin one beta enthält. Aspirieren Sie das Medium in einer 10-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie das übrig gebliebene Medium aus dem Einlass des Objektträgers und fügen Sie dann frisches, mittleres Medium hinzu, das den Einlass vollständig ausfüllt.

Verbinden Sie die Spritze mit dem Objektträger. Stellen Sie die Spritzenpumpe während der Interleukin-Ein-Beta-Inkubation von Vex vier Stunden lang auf eine Scherrate von 10 Mikrolitern pro Minute im Inkubator ein und bereiten Sie Anti-PSMA-Alexa-4-88-Antikörper-markierte Prostatakrebszellen vor. Geben Sie zunächst 0,05 % Trypsin-EDTA für eine Minute zu den MDA-Prostatakrebszellen.

Setzen Sie die Zellen nicht für längere Zeit Trypsin aus, da dies die auf der Zelloberfläche vorhandenen Glykopeptide beeinträchtigen kann. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 mal G. Als nächstes resuspendieren Sie den MDA-Zellgaumen in einem Milliliter Hank's Buffer und fügen Sie den Anti-PSMA-Antikörper hinzu, inkubieren Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort, wobei Sie die Zellen während der Inkubation restimulieren

Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Zelllösung fünf Minuten lang bei 800-fachem G. Aspirieren und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Hank-Puffer. Zählen Sie die markierten MDA-Zellen und bringen Sie die Endkonzentration auf 1 Million Zellen pro Milliliter.

Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit den markierten MDA-Zellen und entfernen Sie die Blasen. Schalten Sie das inverse Mikroskop ein und stellen Sie die Curler-Beleuchtung auf 10-faches Objektiv ein. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf die gleiche Höhe wie den Probentisch des Mikroskops und stellen Sie sie auf einen Cent pro Quadrat-Scherspannung ein.

Öffnen Sie anschließend die Zeiss Axio Vision Software. Wählen Sie das Ziel auf dem Computerbildschirm aus. Erstellen Sie einen neuen Ordner unter der Option Tools in der Software.

Öffnen Sie die Option für intelligente Experimente in Axio Vision und passen Sie die Einstellungen an, um kurze 32. Videos 30 Minuten lang aufzunehmen. Für Live-Fluoreszenzvideos stellen Sie die Bildoptionen ein. Diese Parameter helfen dabei, Videos nahe der Videobildrate mit der Zeiss MRM-Kamera zu erreichen, um die volle Breite des Durchflusskanals bei 10-fachem Objektiv auf dem Computerbildschirm zu visualisieren, einen CM-Mount-Adapterschalter an der Quecksilberlampe zu verwenden, bevor die Spritze und der Anschluss mit den Zellen auf die Spritzenpumpe gesetzt werden. Als nächstes befestigen Sie den Konnektor an den gefüllten Einlasskanal des Mikroobjektträgers, der Interleukin und eine beta-stimulierte Axt enthält.

Verbinden Sie den Auslasskanal mit dem Stecker, der am Schlauch befestigt ist. Legen Sie den Schlauch in eine Schale oder ein konisches 15-Milliliter-Rohr, um den Durchfluss aufzufangen. Beginnen Sie die Infusion durch den Mikroobjektträger mit 10 Mikrolitern pro Minute.

Beobachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und markierten MDA-Zellen oder markierten CTCs, die von Patienten unter 488 Nanometern stammen. Filter am Epi-Fluoreszenzmikroskop. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Experiments als 32. Kurzvideos.

Messen Sie während der Wiedergabeanalyse die Rollgeschwindigkeit. Die Rollgeschwindigkeit wird gemessen, indem die von den Zellen im Laufe der Zeit zurückgelegte Strecke dividiert wird. Hier ist eine Übernachtkultur einer Monoschicht aus Endothelzellen zu sehen.

Auf der Mikrofolie. Die Skalierungen zeigen, dass 100 % des Mikroobjektträgers mit einem Fünf-fach-Objektiv sichtbar sind, während 70 % mit einem 10-fach-Objektiv für ausgewählte vermittelte Wechselwirkungen sichtbar sind, an den Rändern rollende Zellen werden nicht berücksichtigt, wodurch mehr als 70 % des Mikroobjektträgers für die Videoaufzeichnung und Wiedergabeanalyse zur Verfügung stehen. Der Boxplot zeigt die Verteilung der Rollgeschwindigkeiten sowohl von unmarkierten als auch von anti-PSMA, markierten MDA-Zellen auf Interleukin-eins-beta-stimulierten Endothelzellen unter verschiedenen Scherspannungsbedingungen.

Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Rollgeschwindigkeiten bei einem und fünf Dines Quadratzentimeter bei einer höheren Schiebespannung von 10 Dimes pro Quadratzentimeter beobachtet. Es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Rollgeschwindigkeiten von unmarkierten und anti-PSMA-markierten MDA-Zellen beobachtet. Ein zeitlich zusammengefügtes Video, das mit dem Blut eines Prostatakrebspatienten aufgenommen wurde, zeigt drei Arten von Wechselwirkungen zwischen markierten Prostata-CTCs und Lektin-exprimierenden Endothelzellen, die dort anbinden, wo CTCs anhängen und wieder anhängen, stabile Adhäsion, bei der sich CTCs auch nach 30 Sekunden nicht ablösten und keine Wechselwirkungen, da nicht interagierende CTCs in das Sichtfeld gelangen. Mikro-Objektträger können leicht immungefärbt und fluoreszierend abgebildet werden, um die feste Adhäsion von Anti-PSMA-markierten MDA-Zellen

Nach Überfluss über Interleukin sind hier beta-stimulierte Endothelzellen zu sehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wechselwirkungen zwischen seltenen Zellen wie zirkulierenden Prostatatumorzellen und S-Selektin-exprimierenden Endothelzellen nach diesem Verfahren untersuchen können. Andere Methoden, wie z. B. Immunfluoreszenz, können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie das Vorhandensein von s-Selektin zu beantworten. Liganden.

Techniken wie diese können den Forschern helfen, die verschiedenen Schritte der Metastasierung zu verstehen.