Name: In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Prostata-Tumorzellen und E-Selektin-exprimierenden Endothelzellen unter physiologischen Flussbedingungen. Diese Technik ermöglicht Echtzeitanalysen für Metastasenforschung.

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Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Department of Defense-Prostate Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124) unterstützt, U54CA143876 von der National Cancer Institute, und der Robert McCooey Genitourinary Oncology Research Fund. Wir würden uns für die Bereitstellung von HUVECs Herrn Dr. Annarita Lorenzo (Institut für Pathologie) zur Bereitstellung von VE-Cadherin-Antikörper danken und Dr. Marco Seandel (Abteilung für Chirurgie).

1. Kultivierung HUVECs auf Mikroobjekttragerglaschen für Observing CTC-Endothel-Interaktionen <ol><li> Unter der Gewebekultur Kapuze, zuerst den Mikroobjekt spülen, Kanalbreite von 1 mm mit PBS. Sanft Beschichtung der Mikroobjekt mit 200 ul von 50 ug / ml Fibronektin (gelöst in PBS) unter Verwendung einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze. </li><li> Decken Sie die Mikroobjekt mit dem Deckel und halten Sie sie in der Gewebekultur Haube für 30 min. Langsame Abgabe der Flüssigkeit in den Mikroobjekt verhindert Blasenbildung im Kanal. </li><li> Perfuse 200 &amp;mgr; l warme (37 ° C) HUVEC-Wachstumsmedium (M199-Medium, 1 M HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml Heparin, 100 ug / ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor und L-Glutamin) auf der Mikroobjekt inkubieren 20 min bei RT. Während der Perfusion, bereiten HUVEC Zellsuspension. </li><li> Spülen HUVECs mit PBS und fügen 0,05% Trypsin-EDTA für 1-2 min bei RT. Zentrifuge HUVECs in 2 ml Wachstumsmedium bei 180 × g für 5 min. </li><li> Messen Sie die Zellkonzentration mit Hilfe eines neubauer Hämozytometers und bereiten 10 7 HUVEC Zellen/100 ul Wachstumsmedium. Dann vorsichtig aus dem Einlass des Mikroobjekt mit einer 200-ul Pipettenspitze entfernen das Medium. </li><li> Bringen Sie die Mikroobjekt auf Augenhöhe und mit einer 1-ml-Luer-Lock-Spritze vorsichtig perfuse 200 ul der vorbereiteten Konzentration von HUVECs in den Kanal. Vorsicht ist bei diesem Schritt erforderlich ist, um Blasenbildung zu verhindern. Wenn die Blasen erscheinen, halten Perfusion für eine etwas längere Zeit, bis sich Blasen geben Sie den Ablaufkanal. </li><li> Setzen einer gleichen Menge (~ 80 &amp;mgr; l) von HUVEC Medien sowohl dem Einlass und Auslass des Mikroobjekt. Dies verhindert den Fluss von Zellen in jeder Richtung. </li><li> Decken Sie die Folie und halten Sie es in den Inkubator (37 ° C) für 1,5 Stunden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Flusskammer Versammlung für Übernachtung HUVEC Kultur auf einem Microslide <ol><li> Legen Sie eine sterile 20-ml-Spritze, weiblichen und männlichen Luer-Anschlüsse, Schläuche und eine Spritzenpumpe im Inkubator für 15 kmn. </li><li> Für minimale Totvolumen, verwenden Sie die Schläuche mit Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Kleinere Rohrdurchmesser verhindert Blasenbildung. </li><li> Füllen die 20-ml-Spritze mit warmem (37 ° C) HUVEC-Medium (12 ml). Befestigen Sie die Schläuche mit den Anschlüssen auf die Spritze. Entfernen Sie die Luftblasen. Verbinden Sie dieses Anordnung an der Mikroobjekt. </li><li> Vollständig zu füllen den Einlass des Mikroobjekt mit HUVEC Medien. Bringen des gefüllten 20-ml-Spritze an dem Verbinder angebracht neben dem Mikroobjekt. Den Stecker zu befestigen vorsichtig auf die Mikroobjekt. </li><li> Bringen Sie das Set-up in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Spritzenpumpe, bei 10 ml / min Scherrate eingestellt. Lassen Sie die Zellen O / N im Brutschrank bei 37 ° C </li><li> Am nächsten Tag, zerlegen den Aufbau durch Entfernen des Verbinders an dem Einlass des Mikroobjektträger befestigt. </li><li> Um E-Selektin-Expression auf Endothelzellen hochregulieren, bereiten Sie frisches Wachstumsmedium mit IL-1β bei 10 ng / ml in 4 ml Medium. Saugen Sie das Medium in einem 10-ml-Spritze. T entfernener Medium aus dem Einlass des Mikroobjekt und der Spritze zu verbinden, um die Folie. </li><li> Stellen Sie die Spritzenpumpe mit 10 ul / min Schergeschwindigkeit für 4 Stunden in den Brutschrank. </li></ol> 3. Herstellung von anti-PSMA (J591-488) gekennzeichnet Prostatakrebszellen <ol><li> Während IL-1β Inkubation von HUVECs, bereiten anti-PSMA-J591-Alexa488 PCa-Zellen. Hinzufügen von 0,05% Trypsin-EDTA-MDA-Zellen für 1 min. Nicht die Zellen Trypsin für längere Zeit ausgesetzt werden, da sie die auf der Zelloberfläche vorhanden Glycopeptide beeinflussen. Enzym-freie Zelle Dissoziation Reagenz kann auch anstelle von Trypsin verwendet werden. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. </li><li> Resuspendieren MDA Zellpellet in 1 ml H / H-Puffer (Hanks balanced salt solution/0.1% HSA/10 mM HEPES / 1 mM CaCl 2). In anti-PSMA-J591-Alexa488 Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. Resuspendieren der Zellen während der Inkubation. </li><li> Nach 30 min Zentrifugation der Zelllösung bei 800 × g für 5 min. AspiRate und das Pellet in 1 ml H / H-Puffer. Zählen Sie die markierten Zellen und MDA bringen die Endkonzentration auf 1x10 6 Zellen / ml. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit J591-488 markierten Zellen MDA und die Bläschen. </li></ol> 4. Vorbereitung der Anti-PSMA (J591-488) beschriftet CTC Enriched von PCa Patienten <ol><li> Sammeln Sie 7,5 ml Blut von Patienten mit Prostatakrebs in einem blauen Kappe Rohr (mit Na-Citrat). Sanft Blut verdünnen 01.01 in 0,1% BSA / 1 mM EDTA / PBS. </li><li> Add 5.3 ml Ficoll-Paque Plus in einem 50 ml konischen Röhrchen. Schicht verdünntes Blut auf dem Ficoll-Paque. Zentrifugieren bei 400 g für 30 min. </li><li> Vorbeschichtung alle Rohre oder Spitzen in Kontakt mit CTC mit 2% FBS/RPMI-1640 / 1 mM CaCl 2/4 mM MgCl 2 (R / S-Puffer) nicht-spezifische Bindung von CTC an den Oberflächen zu verhindern. Aufrechtzuerhalten 4 ° C Temperatur der Medien und Puffer in Kontakt mit CTC. </li><li> Das Blut peripheren mononuklearen Zellen (PBMCs)-Fraktionenthält CTC von der Schnittstelle in einem anderen 50-ml konischen Röhrchen, enthaltend 30 ml R / S-Puffer. Zentrifugieren bei 400 g für 8 min. </li><li> Das Pellet und waschen wieder in R / S-Puffer bei 400 g für 8 min. Nach der Zentrifugation das Pellet in H / H-Puffer. In anti-PSMA-J591-488-Antikörper bei 20 pg / ml für 30 min bei RT in einer dunklen Ort. </li><li> Nach 30 min zentrifugieren die PBMCs enthält J591-488 markierten CTC bei 800 g für 5 min. Resuspendieren in H / H-Puffer. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze (mit R / S-Puffer vorgezogen) mit der Probe. </li></ol> 5. Herstellung von Mikroskop, Spritzenpumpe und Durchflusskammerversammlung <ol><li> Schalten Sie den umgekehrten Mikroskop und stellen Sie die Beleuchtung bei Kohler 10X-Objektiv. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf dem gleichen Niveau wie der Probentisch des Mikroskops und setzen Sie ihn auf 1 dyn / cm 2 Schubspannung (~ 10 ml / min). </li><li> Öffnen Sie die Zeiss Axiovision Software. Wählen Sie das Ziel auf dem Computer-Bildschirm. Erstellen Sie eine neueOrdner unter der Option-Tools in der Software. </li><li> Öffnen Sie die Option Smart-Experimente in Axiovision und die Einstellungen zu kurzen 30 Sekunden Videos für 30 Minuten aufzeichnen. </li><li> Für die Live-Videofluoreszenz, stellen Sie die Bildoptionen-12 ms Belichtungs, 2 x 2 bin, 5 zu gewinnen. Diese Parameter helfen bei der Erreichung Videos der Nähe des Video-Bildrate (~ 23 Bildern pro Sekunde) mit der Zeiss MRM-Kamera. </li><li> Um die volle Breite des Strömungskanals bei 10 X Ziel auf dem Bildschirm sichtbar zu machen, mit einem C-Mount-Adapter (0,63 mm xf/60 Interface). </li><li> Schalten Sie den Quecksilberlampe. </li><li> Legen Sie die Spritze und den Stecker mit den Zellen auf den Spritzenpumpe. </li><li> Bringen IL-1β stimulierten HUVECs aus dem Inkubator. Befestigen Sie den Stecker mit dem gefüllt Einlasskanal des Mikroobjekt enthält HUVECs. </li><li> Verbinden der Austrittskanal mit dem Anschluss an die Rohrleitung angebracht ist. Setzen Sie den Schlauch in eine Schale oder 15 ml konischen Röhrchen, um die Strömung durch sammeln. </li><li> Starten Sie den infusiauf durch die Mikroobjekt bei 10 ul / min. Beachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Zellen der Bezeichnung MDA oder markierte CTC von Patienten unter 488-nm-Filter auf der Epifluoreszenzmikroskop abgeleitet. </li><li> Starten Sie die Aufnahme des Experiments als 30 Sekunden kurze Videos. Während der Wiedergabe Analyse, messen die Walzgeschwindigkeit. Walzgeschwindigkeit wird durch Division des Abstandes von den Zellen über die Zeit zurück gemessen. </li></ol> 6. Immunfärbung des Microslide <ol><li> Druckmaterial aus dem Einlaß und Auslaß der Mikroobjekt nach Perfusion MDA-Zellen auf IL-1β-stimulierten HUVEC-Zellen für 10 min. </li><li> Verwendung einer 200 ul-Spitze, setzen warm (37 ° C) PBS, das Calcium und Magnesium in den Einlass des Mikroobjektträger für 5 min. Neigen Sie den Mikroobjekt mit seinem Deckel als Stütze auf der Bank. Halten Sie die Mikroobjekt in einer gekippten Position für alle Inkubationen während Immunfärbung. </li><li> Fix HUVECs durch Perfusion warmen 2% Formaldehyd in den Einlass </li><li&gt; Inkubieren für 20 min bei RT. Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Hinzufügen Triton-X 100 (0.1%) in 5% BSA in PBS für 10 min bei RT. </li><li> Gründlich zweimal mit PBS für jeweils 5 min. Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper Ziege-anti-VE-Cadherin (1:100) in 2,5% BSA O / N bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In Sekundär Esel-anti-Ziege-647-Antikörper für 45 min. Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Inkubation bei RT mit humanisierten J591-Alexa488 konjugierte Antikörper für 1 Stunde. </li><li> Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. In DAPI für 5 min. Waschen mit destilliertem Wasser für 5 min. </li><li> In PBS (Mowiol oder für langfristige Lagerung). Visualisieren Sie die Mikroobjekt unter dem konfokalen Mikroskop. </li></ol>

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</ol>

Dr. Bander ist der Erfinder von Patenten, die Cornell Research Foundation (&quot;CRF&quot;) für die Antikörper-J591 in diesem Artikel verwendet zugeordnet sind. Dr. Bander ist Berater und besitzt Lager in BZL Biologics, des Unternehmens, dem die Patente wurden von CRF für die weitere Forschung und Entwicklung lizenziert.

Aufgrund der geringen Anzahl von CTC unter Blutzellen, ist es schwierig, CTC als reine Population von Zellen zu isolieren. Um CTC / EC-Interaktionen zu untersuchen, die seltene und unreine Bevölkerung von CTC stellt zwei großen Herausforderungen: a) Identifikation von CTC unter Blutzellen; b) Beobachtung der CTC / EC-Interaktionen. Um die erste Einschränkung der Identifizierung Prostata CTC unter Blutzellen zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass praktisch a...

Metastasierung ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, der kaum verstanden bleibt. Der Ligand E-selectin/selectin Achse ist gezeigt worden, eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung durch Förderung der Primär adhäsiven Wechselwirkungen zwischen dem vaskulären Endothel und Krebszellen 1,2 spielen. Endothelzellen (E)-Selectin ist ein Transmembran-Protein von aktivierten Endothelzellen exprimiert wird, während die verschiedenen E-Selektin-Ligand (en) durch Tumorzellen 3 ausgedrückt. Zahlreiche in vitro-Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt, um E-selectin/selectin Ligand-Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Endothelzellen (ECs) 1 zu modellieren. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden verschiedene Durchflusskammer-Systeme eingesetzt, um Blutgefäßsystem zu simulieren. Unter Flusskammer-Einheiten wird Parallelplatten-Durchflusskammer (PPFC) in Verbindung mit ECs routinemäßig als in vitro-Modell simuliert in vivo Scherstressbedingungen eingesetzt. HierinVerfahren ECs auf einem 35-mm-Schale gezüchtet und nach Erreichen einer Monoschicht werden ECs zum PPFC befestigt und Scherspannung basierend Experimente durchgeführt werden. , PPFC und anderen aktuellen Systemen präsentieren jedoch viele Einschränkungen zum Studium adhäsive Wechselwirkungen zwischen zirkulierenden Tumorzellen (CTC) von Patienten und ECs stammen, die vorwiegend, weil CTC sind eine seltene Population von Zellen, aus dem Primärtumor Schuppen, unter den Millionen von zirkulierenden Blutzellen (1 CTC pro 10 9 Blutkörperchen) 4. Daher, im Gegensatz zu unbegrenzten Vorrat an kultivierten Zelllinien, geringe CTC zählt zu sehr wenigen und seltenen CTC / EC-Interaktionen, erfordern richtige Strömung Kanalbreite, um die Interaktionen für die Wiedergabe Analyse aufzeichnen. Darüber hinaus, da Patienten abgeleitet CTC sind eine unreine Bevölkerung, also eine Identifikationsmarkierung ist erforderlich, um in bestimmten CTC verfolgen. Um dieses Problem zu lösen, ein neues Verfahren, um Prostatakrebs zu identifizieren (PCa) CT entwickelten wirCs unter Ausnutzung der Tatsache, daß praktisch alle diese CTC auszudrücken Prostata-spezifischen Membranantigen (PSMA) auf ihrer Zelloberfläche 5,6. In diesem Bericht haben wir die Prostatakrebs-Zelllinie, MDA PCa2b (MDA), um den potentiellen Nutzen von unserem neuen System, um Prostatakrebs, CTC Wechselwirkungen mit ECs Studie zeigen, schließlich, um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen. Unsere Methodik kann für verschiedene Scher basierte Experimente simuliert in vivo Gefäßsystem 9.7 angewendet werden. Neben der Prüfung PCa CTC / EC-Interaktionen, konnte der Stromfluss-Kammer-System leicht für die Analyse von peripheren mononukleären Blutzellen oder Wechselwirkungen Tumorzellen &#39;mit ECs angepasst werden. Die Einfachheit der Demontage und Wiedermontage der Strömungskammer, ein Mikroobjekt III (0,1) (nachstehend als Mikroobjekt bezeichnet), ermöglicht die Kultivierung ECs unter Perfusion und Stimulieren ECs mit verschiedenen Zytokinen induzieren protein Ausdruck. Außerdem kultivierten Endothelzellen, rekombinante Proteine, wie E-und P-Selektin auf der Mikroobjekt und Interaktion mit Tumorzellen, beschichtet werden können, unter laminaren Strömungsbedingungen 10 beobachtet werden.

<table><tbody><tr><td>Microslide</td><td>Ibidi</td><td>80331</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffschlauch</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96115-08</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Adapter für Männer</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Adapter für Innengewinde</td><td>GlycoTech</td><td>31-001</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Chemyx Inc</td><td>Fusion 100</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>M199 Medium</td><td>Sigma</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Mitogen</td><td>Biomedical Technologies</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H9269</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSMA J591-488</td><td>Weill Cornell Medical College-Labor für urologische Onkologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleukin-1 beta</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Millipore</td><td>SM-2002-C</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H-3149</td><td></td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td><td></td><td>zur Verfügung gestellt von Marco Seandel</td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5648</td><td></td></tr><tr><td>10x Objektiv</td><td>Zeiss Plan Neofluar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für enzymfreie Zelldissoziation</td><td>Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Lonza</td><td>12-702-F</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-paque plus</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-methode zur e-selektin-vermittelte interaktionen zwischen prostata zirkulierenden tumorzellen, abgeleitet von patienten und humanen endothelzellen beachten

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Metastasierung ist ein Prozess, in dem Tumorzellen zu vergießen aus dem Primärtumor intravasate Blut Gefäß-und Lymphsystem, damit, den Zugang zu extravasieren und bilden einen Sekundär Nische. Die Extravasation von Tumorzellen aus dem Blutgefäßsystem kann mit Endothelzellen (ECs) und Tumorzellen aus verschiedenen Zelllinien untersucht werden. Erste Studien wurden mit statischen Bedingungen durchgeführt, aber es ist gut dokumentiert, dass ECs anders unter physiologischen Flussbedingungen verhalten. Daher unterschiedlichen Strömungskammeranordnungen werden derzeit zum Studium Krebs-Zell-Interaktionen mit ECs verwendet. Aktuelle Durchflusskammer-Baugruppen bieten reproduzierbare Ergebnisse entweder mit verschiedenen Zelllinien oder Flüssigkeit bei unterschiedlichen Scherstressbedingungen. Jedoch zu beobachten und zu studieren Wechselwirkungen mit seltenen Zellen, wie zirkulierenden Tumorzellen (CTC), sind bestimmte Änderungen erforderlich, um das herkömmliche Strömungskammer-Anordnung hergestellt werden. CTCsind eine seltene Zellpopulation unter Millionen von Blutzellen. Folglich ist es schwierig, eine reine Population von CTC erhalten. Kontamination der CTC mit verschiedenen Arten von Zellen, die normalerweise im Blut gefundenen unvermeidlich mit vorliegenden Anreicherung oder Abreicherung Techniken. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine einzigartige Methode zur fluoreszenz Label zirkulierenden Prostatakrebszellen und studieren ihre Wechselwirkungen mit ECs in einer selbstorganisierten Flusskammer-System. Diese Technik kann weiter verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Prostata-CTC und jedes Protein von Interesse zu beobachten.

Figur 1 zeigt ein O / N-Kultur von einer Monoschicht von Endothelzellen auf der Mikroobjekt. Die Skalierungen auf Fig. 1A zeigt, dass 100% der Mikroobjekt sichtbar mit 5X Ziel, während 70% sichtbar mit einem 10X-Objektiv (Abbildung 1B). Für E-Selektin-vermittelte Wechselwirkungen werden die Zellen rollen an den Kanten nicht berücksichtigt, die mehr als 70% der Mikroobjekt verfügbar für Video-Aufnahme und-Wiedergabe Analyse macht. In unserer Erfahrung, zunächst dieses Se...

Unser Bericht beschreibt eine einzigartige Methode zur Visualisierung und Analyse von CTC / EG Wechselwirkungen bei Prostatakrebs unter physiologischen Flussbedingungen.

In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wechselwirkungen zwischen seltenen Prostatakrebszellen und e-Selektin-exprimierenden Endothelzellen mithilfe einer Mikro-Objektträger-Flussanordnung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Mikro-Objektträger mit Fibronectin beschichtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, humane Nabelvenen-Endothelzellen oder VE in einem dynamischen Flusssystem auf einem Mikro-Objektträger mit geringer Kanalbreite zu kultivieren.Als Nächstes werden die Prostatakarzinomzellen mit einem gegen das prostatspezifische Membranantigen oder PSMA gerichteten humanisierten monoklonalen Antikörper markiert, der internalisiert wird. Der letzte Schritt besteht darin, die mit dem anti-PSMA-Antikörper markierten Prostatakarzinomzellen über die E-Selektin exprimierenden VE-Zellen zu perfundieren. Abschließend wird mit Hilfe der Videomikroskopie die Interaktion zwischen den Prostatakarzinomzellen und den Endothelzellen dargestellt.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der parallelen Platten-Flusskammer und anderen dynamischen Aufbauten, liegt darin, dass mit ihr die Wechselwirkungen zwischen seltenen Prostatakrebszellen, wie zirkulierenden Tumorzellen, und kultivierten endothelialen Zellen in einem dynamischen Flusssystem untersucht werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Metastasierung zu beantworten, beispielsweise wie Prostata-Tumorzellen über das Blutgefäßsystem metastasieren. Nutzen sie denselben Mechanismus wie Leukozyten während ihrer Rekrutierung?Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten, da sie das Kultivieren einer einzigen Endothelzellschicht in einem engen Kanal unter Perfusion im Gewebekulturhauben erfordert. Zuerst spülen Sie die Mikrokammer mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Anschließend beschichten Sie die Mikrokammer vorsichtig mit 200 Mikrolitern einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin-Lösung unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze.Bedecken Sie den Mikroschlitten mit dem Deckel und lassen Sie ihn 30 Minuten lang im Zellkulturhauben stehen. Anschließend geben Sie 200 Mikroliter warmes QVE-Wachstumsmedium über den Mikroschlitten und inkubieren 20 Minuten bei Raumtemperatur. Ein langsames Zugeben der Flüssigkeit auf den Mikroschlitten verhindert die Bildung von Blasen im Kanal.Während der Perfusion bereiten Sie die Vex-Suspension vor, indem Sie Vex mit PBS spülen und 0,1 % Kollagenase plus 0,05 % EDTA in PBS für eine bis zwei Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen. Zentrifugieren Sie die hve in zwei Milliliter Wachstumsmedium bei 180 × g für fünf Minuten. Anschließend messen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer und stellen 10 Millionen Zellen pro 100 Mikroliter Wachstumsmedium bereit.Als Nächstes entfernen Sie vorsichtig das Medium vom Eingang des Mikro-Objektträgers. Bringen Sie den Mikro-Objektträger mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf Augenhöhe und führen Sie mit einer Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze vorsichtig 200 Mikroliter der hergestellten Konzentration von Vex in den Kanal ein. In diesem Schritt ist Vorsicht geboten, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Sollten Blasen auftreten, führen Sie die Perfusion etwas länger fort, bis die Blasen in den Auslasskanal gelangen.Als Nächstes pipettieren Sie ein gleiches Volumen von etwa 80 µL VE-Medium in den In- und den Outlet des Mikroschlittens. Dies verhindert den Zellfluss in beide Richtungen. Decken Sie den Schlitten ab und stellen Sie ihn 1,5 Stunden lang in einen 37 °C warmen Inkubator.Um mit dem Zusammenbau der Durchflusskammer zu beginnen, stellen Sie eine sterile 20-Milliliter-Spritze, weibliche und männliche Luer-Anschlüsse, eine Spritzenpumpe und Schläuche 15 Minuten lang in den Inkubator, um ein minimales Totvolumen zu gewährleisten. Verwenden Sie Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,04 Zoll. Ein geringerer Schlauchdurchmesser verhindert die Bildung von Blasen.Füllen Sie danach die 20-Milliliter-Spritze mit 12 Milliliter warmem VE-Medium. Entfernen Sie die Luftblase vollständig aus der Spritze. Füllen Sie den Zulauf des Mikro-Objektträgers mit VE-Medium.Verbinden Sie diese Vorrichtung mit dem Mikroobjektträger. Befestigen Sie den Auslassanschluss vorsichtig am Mikroobjektträger. Stellen Sie die gesamte Apparatur in den Inkubator und schließen Sie sie an die Spritzenpumpe an.Danach die Pumpe auf eine Schergeschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute einstellen, bevor die Zellen über Nacht im Inkubator bei 37 Grad Celsius belassen werden. Am nächsten Tag demontieren Sie die Apparatur, indem Sie den am Eingang des Mikro-Objektträgers befestigten Verbinder entfernen. Anschließend entfernen Sie den Auslassverbinder zwei, um die Expression von E-Selectin auf endothelialen Zellen zu erhöhen.Bereiten Sie frisches Wachstumsmedium, das Interleukin eins Beta enthält. Aspirieren Sie das Medium in eine 10-Milliliter-Spritze. Entfernen Sie das restliche Medium vom Eingang des Objektträgers und füllen Sie anschließend den Eingang vollständig mit frischem Medium auf.Verbinden Sie die Spritze mit dem Objektträger. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Schergeschwindigkeit von 10 Mikroliter pro Minute ein und lassen Sie sie vier Stunden im Brutschrank laufen, während der Inkubation mit Interleukin-1-beta von Vex. Bereiten Sie anti-PSMA-Alexa-488-Antikörper-markierte Prostatakarzinomzellen vor. Geben Sie zunächst 0,05 % Trypsin-EDTA zu den MDA-Prostatakarzinomzellen und belassen Sie es eine Minute lang. Die Zellen nicht länger als nötig der Trypsin-Behandlung aussetzen, da dies die auf der Zelloberfläche vorhandenen Glykopeptide beeinträchtigen kann. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 200 × g für fünf Minuten. Anschließend das MDA-Zellpräparat in einem Milliliter Hank’s Puffer erneut suspendieren und den Anti-PSMA-Antikörper hinzufügen. Für 30 Minuten bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort inkubieren, wobei die Zellen während der Inkubation erneut suspendiert werden.Nach 30 Minuten die Zellsuspension bei 800 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Den Überstand abpipettieren und das Pellet in einem Milliliter Hank’s Puffer resuspendieren. Die markierten MDA-Zellen zählen und die Endkonzentration auf eine Million Zellen pro Milliliter einstellen.Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit den markierten MDA-Zellen und entfernen Sie die Blasen. Schalten Sie das umgekehrte Mikroskop ein und stellen Sie die Beleuchtung des Curlers auf das 10×-Objektiv ein. Bringen Sie die Spritzenpumpe auf die gleiche Höhe wie den Probentisch des Mikroskops und stellen Sie sie auf eine Scherspannung von einem Dime pro Quadratzentimeter ein.Öffnen Sie als Nächstes die Zeiss Axio Vision-Software. Wählen Sie das Objektiv auf dem Bildschirm aus. Erstellen Sie einen neuen Ordner unter der Option „Werkzeuge“ in der Software.Öffnen Sie die Option „Smart Experiments“ in Axio Vision und passen Sie die Einstellungen an, um 30 Minuten lang kurze Videos im 32. Sekunden-Format aufzuzeichnen. Für Live-Fluoreszenzvideos stellen Sie die Bildoptionen ein. Diese Parameter helfen dabei, Videos nahe der Bildfrequenz mit der Zeiss-MRM-Kamera zu erhalten, um die gesamte Breite des Flusskanals bei einem 10×-Objektiv auf dem Computerbildschirm zu visualisieren. Verwenden Sie einen CM-Montageadapter und schalten Sie die Quecksilberlampe ein, bevor Sie die Spritze und den Verbinder mit den Zellen auf die Spritzenpumpe setzen. Anschließend befestigen Sie den Verbinder am gefüllten Einlasskanal des Mikro-Objektträgers, der mit Interleukin-1-beta stimuliertes Ax enthält.Verbinden Sie den Auslasskanal mit dem Verbinder, der an dem Schlauch befestigt ist. Stellen Sie den Schlauch in eine Schale oder ein 15-Milliliter-Kegelrohr, um den Durchfluss aufzufangen. Beginnen Sie die Infusion durch die Mikrokammer bei 10 µL pro Minute.Beobachten Sie die Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und markierten MDA-Zellen oder markierten zirkulierenden Tumorzellen (CTC), die von Patienten unter 488 Nanometer stammen, mithilfe des Epi-Fluoreszenzmikroskops. Beginnen Sie mit der Aufnahme des Experiments als 32 kurze Videos.Während der Wiedergabeanalyse die Rollgeschwindigkeit messen. Die Rollgeschwindigkeit wird bestimmt, indem die von den Zellen zurückgelegte Strecke durch die Zeit geteilt wird. Gezeigt ist hier eine Übernachtkultur einer Zellschicht aus endothelialen Zellen.Auf dem Mikrorutsche. Die Skalierungen zeigen, dass 100 % der Mikrorutsche mit einem 5x-Objektiv sichtbar sind, während 70 % mit einem 10x-Objektiv sichtbar sind; bei ausgewählten vermittelten Interaktionen werden Zellen, die an den Rändern rollen, nicht berücksichtigt, wodurch mehr als 70 % der Mikrorutsche für die Videoaufzeichnung und die anschließende Analyse verfügbar sind. Der Boxplot zeigt die Verteilung der Rollgeschwindigkeiten sowohl unlabeleder als auch mit anti-PSMA markierter MDA-Zellen auf durch Interleukin-1-beta stimulierten Endothelzellen unter verschiedenen Scherstressbedingungen.Kein signifikanter Unterschied wurde in den Rollgeschwindigkeiten bei einem und fünf dyn/cm² bei höherer Scherbelastung von 10 dyn/cm² beobachtet. Ein statistisch signifikanter Unterschied zeigte sich zwischen den Rollgeschwindigkeiten von nicht markierten und anti-PSMA-markierten MDA-Zellen. Ein zeitlich zusammengesetztes Video, aufgenommen mit Blut eines Prostatakarzinom-Patienten, zeigt drei Arten von Wechselwirkungen zwischen markierten prostataspezifischen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) und Lektin-exprimierenden endothelialen Zellen: Anheften, bei dem CTCs sich anheften und erneut anheften; stabile Adhäsion, bei der CTCs auch nach 30 Sekunden nicht ablösten; sowie keine Wechselwirkungen, wenn nicht wechselwirkende CTCs in das Sichtfeld eintreten. Mikroskopläppchen können leicht immungefärbt und mittels Fluoreszenz zur Beurteilung der festen Adhäsion von anti-PSMA-markierten MDA-Zellen abgebildet werden.Nach der Überströmung über Interleukin-1-beta-stimulierte Endothelzellen ist hier eine Anreicherung zu sehen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Wechselwirkungen zwischen seltenen Zellen, wie zirkulierenden Prostata-Tumorzellen, und S-Selektin-exprimierenden Endothelzellen, gemäß diesem Verfahren, untersuchen kann. Andere Methoden, wie beispielsweise die Immunfluoreszenz, können ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, etwa die Anwesenheit von S-Selektin-Liganden.Mithilfe solcher Techniken können Forscher die verschiedenen Schritte beim Metastasieren besser verstehen.

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Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

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In-vitro-Methode zur E-Selektin-vermittelte Interaktionen zwischen Prostata zirkulierenden Tumorzellen, abgeleitet von Patienten und humanen Endothelzellen beachten (Video) | JoVE Journal

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