Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, polymerbeschichtete Oberflächen so zu optimieren, dass die langfristig stabile Kultur von aus Stammzellen abgeleiteten menschlichen Hepatozyten erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem zunächst Polyurethan 1 3 4 oder PU 1 3 4 synthetisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das geeignete Lösungsmittel zur Lösung von PU 1 34 auszuwählen.

Anschließend wird der Spin-Coating-Prozess mit dem PU 1 3 4 auf dem Glasdeckel optimiert. Der letzte Schritt ist die Optimierung des Sterilisationsverfahrens der mit dem Polymer P 1 34 beschichteten Glasdeckel, gefolgt von der Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Arzneimittelmetabolismus. Assays werden verwendet, um den Einfluss der PU 1 34-Polymerbeschichtung auf die Funktion von aus Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung von al-Matrizes in der Kultur zur Aufrechterhaltung potenter, hepatocytenähnlicher Stammzellen, liegt darin, dass diese synthetischen Materialien gezielt für einen bestimmten Zweck optimiert und in einem Maßstab auf Qualitätsstandards hochskaliert werden können. Außerdem weisen sie eine konsistente Batch-zu-Batch-Übereinstimmung auf. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie von Lebererkrankungen hinein, da sie ein Beispiel dafür darstellt, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers optimiert werden kann, um das Zellphänotyp zu bewahren.

Den Ablauf wird Dr. Jeffrey Walton, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Vor Beginn dieses Verfahrens wenden Sie eine Wärmebehandlung des Mono-1,6-Hexandioats von Diethylenglykol und Neopentylglykol bei 40 Grad Celsius für 48 Stunden in einem Vakuumofen an, um eventuell vorhandenes Restwasser zu entfernen. Geben Sie 22 Millimol jedes Monomers und 55 Millimol einer dpic-Säure in einen zweihalsigen Rundkolben, der mit einer Dean-Stark-Apparatur verbunden ist und mit einem magnetischen Rührstab ausgestattet ist.

Bringen Sie danach die gesamte Apparatur unter Vakuum und erhitzen Sie das Glasgefäß vorsichtig 6 Stunden lang auf 40 Grad Celsius, um eine Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalie zum Kolben zu vermeiden. Nachdem Sie die Apparatur aus dem Ofen genommen und das System unter Stickstoff gesetzt haben, geben Sie 0,0055 Mol des Katalysators Titan(IV)-oxid tropfenweise mittels einer Spritze zum Kolben hinzu. Rühren Sie das Reaktionsgemisch 24 Stunden lang bei 180 Grad Celsius um, wobei das Restwasser in der Dean-Stark-Falle gesammelt wird.

Lassen Sie das Produkt auf Raumtemperatur abkühlen. Anschließend mischen Sie 3,2 Millimol oder eine Äquivalentmenge des Polyols P-H-N-G-A-G mit 6,4 Millimol oder zwei Äquivalenten des vier vier Methyl und eines Bisphenol-Isocyanats in 12 Milliliter wasserfreiem DML in einem zweihalsigen Rundkolben, der mit einer Dean-Stark-Apparatur verbunden ist und einen magnetischen Rührstab enthält.

Rühren Sie das Reaktionsgemisch 70 Grad Celsius unter einer Stickstoffatmosphäre. Fügen Sie anschließend den Katalysator Titandioxid tropfenweise über eine Spritze zu, um eine Endkonzentration von 0,8 % zu erreichen. Nach einer Stunde geben Sie ein äquivalentes Maß des Kettenverlängers 1,4-Butandiol zu, um das Copolymerisierungsprodukt zu erhalten. Erhöhen Sie die Temperatur auf 90 Grad Celsius und lassen Sie die Reaktion 24 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre laufen.

Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt ist, tropfenweise Diethylether zum Reaktionsgemisch geben, bis die Ausfällung des Polyurethan-Produkts beobachtet wird. Nach dem Übertragen des Reaktionsgemischs in ein Zentrifugenröhrchen die Lösung bei 5.300 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Abgießen das Überstandsvolumen bei Raumtemperatur trocknen, bis das Lösungsmittel verdunstet ist.

Als Nächstes 200 Milligramm PU 1 34 in eine Glasflasche einwiegen. Die Probe auf eine Endkonzentration von 2 % in Chloroform oder Chloroform und Toluol im Verhältnis 1:1 oder Tetrahydrofuran oder einer Kombination aus Tetrahydrofuran und Chloromethan verdünnen. Das Gemisch im Verhältnis 1:1 für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln mit einem Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 200 Bewegungen pro Minute schütteln, bis sich eine homogene Lösung gebildet hat und kein Niederschlag mehr sichtbar ist.

Wenn fertig, etwa 15 Millimeter große quadratische Glasdeckgläser auf den Spin-Coter geben. Mit einer Pipette 50 Mikroliter der PU 1–4-Lösung auf das Deckglas auftragen und jedes Deckglas sieben Sekunden lang bei 23 × g spinnen. Anschließend das Deckglas mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur lufttrocknen lassen, bevor es sterilisiert wird. Danach jedes polymerbeschichtete Deckglas durch Bestrahlung mit einer Dosis von 10 Gray für 12 Minuten in einem Laborbestrahlungsgerät gammastrahlen.

Alternativ bestrahlen Sie jeden mit Polymer beschichteten Deckgläser jeweils 16 Minuten lang mit einer 30-Watt-UV-Lampe von beiden Seiten. Danach platzieren Sie das mit Polymer beschichtete Deckglas entsprechend seiner Größe in eine geeignete Zellkulturschale. Nach Kultivierung und Differenzierung der aus der humanen embryonalen Stammzelllinie abgetrennten Zellen mithilfe eines Dissoziationsreagenz, überimpfen Sie diese am neunten Tag des Differenzierungsprozesses in Anwesenheit von serumfreiem Medium auf die PU 1 34-beschichteten Deckgläser für die Rasterelektronenmikroskopie.

Bilder der verschiedenen beschichteten Glasdeckgläser zeigen, dass die Beschichtung mit Toluol oder Chloroform nicht homogen war, was auf eine ungleichmäßige Beschichtung mit PE 1 34-Präzipitation hindeutet. Im Gegensatz dazu ermöglichte Tetrahydrofuran eine Spin-Beschichtung mit einer deutlich gleichmäßigeren Oberfläche. Zusätzlich zeigt die Analyse der verschiedenen Polymerbeschichtungen mittels Rasterkraftmikroskopie eine um 40 % geringere Rauheit von P 1 34, das in Tetrahydrofuran gelöst war, im Vergleich zu anderen Lösungsmitteln, was auf eine gleichmäßigere PU 1 34-Beschichtung schließen lässt. In einer biologischen Anwendung wurde die hepatische Endodifferenzierung induziert, und am neunten Tag waren hepatoblastenähnliche Zellen erkennbar, wobei der Großteil der Zellen Cytokeratin 19, Alpha-Fetoprotein und hepatären nukleären Faktor 4 Alpha exprimierte sowie geringe Albuminspiegel als Maß für die metabolische Funktion aufwies.

Die Funktion des Cytochrom P450 wurde vier Tage nach dem Umpflanzien auf verschiedene polymerbeschichtete Oberflächen bewertet. Ein zweifacher Anstieg der metabolischen Aktivität in Zellen, die auf Tetrahydrofuran-PU134-beschichteten Oberflächen umgepflanzt wurden, konnte beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die metabolische Aktivität von humanen embryonalen Stammzellen abstammenden hepatozytenartigen Zellen durch eine gleichmäßigere P134-Beschichtungsoberfläche verbessert wird. Die Kontrastbildgebung zeigte keine groben Unterschiede nach UV- oder Gammabestrahlung, was durch die Analyse mittels Rasterelektronenmikroskopie weiter bestätigt wurde.

Humanen embryonalen Stammzellen abgeleitete Hepatozyten, die erneut auf mit Gammastrahlung behandelten, PU 1 34-beschichteten Glasdecken ausgesät wurden, wiesen eine dreifach erhöhte CYP drei a-Aktivität im Vergleich zu Zellen auf, die auf mit UV-Strahlung behandelten, PU 1 34-beschichteten Glasdecken ausgesät wurden. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Gammastrahlenbestrahlung die optimale Sterilisationstechnik ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Homogenität der Beschichtung zwischen verschiedenen Spin-Coating-CLOs zu überprüfen, und nicht zu vergessen, dass das Arbeiten mit chemischen Lösungsmitteln und Geräten äußerst gefährlich sein kann.

Maßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.