Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, polymerbeschichtete Oberflächen zu optimieren, um die langzeitstabile Kultur von aus Stammzellen gewonnenen menschlichen Hepatozyten zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Polyurethan 1 3 4 oder PU 1 3 4 synthetisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das richtige Lösungsmittel für die Solubilisierung von PU 1 34 auszuwählen.

Anschließend wird der Schleuderbeschichtungsprozess mit dem PU 1 3 4 auf dem Glasdeckglas optimiert. Der letzte Schritt ist die Optimierung des Sterilisationsverfahrens der mit Polymer P 1 34 beschichteten Glasdeckgläser, letztlich der Rasterelektronenmikroskopie, der Rasterkraftmikroskopie und des Arzneimittelstoffwechsels. Assays werden verwendet, um den Einfluss der Polymerbeschichtung PU 1 34 auf die Funktion von aus Stammzellen gewonnenen Hepatozyten zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Verwendung von al Metrices in Kultur zur Erhaltung von URI-potenten Stammzellen mit Hepatozyten, besteht darin, dass diese synthetischen Materialien fein abgestimmt werden können, um einen bestimmten Zweck und eine Skala auf qualitätsgesicherte Standards zu bringen. Darüber hinaus zeigen sie die Buskonsistenz der Charge zwei an. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Lebererkrankungen, da sie ein Beispiel dafür darstellt, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers optimiert werden kann, um den Zellphänotyp zu erhalten.

Verfahren wird von Dr. Jeffrey Walton, einem Postdoc aus meinem Labor, vorgeführt, bevor mit diesem Verfahren begonnen wird. Die Sechs-Hexan-Skala Diethylenglykol und Neo PenTile Glykol des Mono werden 48 Stunden lang in einem Vakuumschrank bei 40 Grad Celsius einer Wärmebehandlung unterzogen. Zur Entfernung des Restwassers werden 22 Millimol jedes Monomers und 55 Millimol einer dpic Säure in einen zweihalsigen Rundkolben gegeben, der mit einer Dean-Stark-Vorrichtung verbunden und mit einem magnetischen Rührstab versehen ist.

Anschließend wird die gesamte Baugruppe unter ein Vakuum gestellt und die Gläser sechs Stunden lang sanft auf 40 Grad Celsius erhitzt, um eine Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalie in den Kolben zu vermeiden. Nachdem die Baugruppe aus dem Ofen genommen und das System unter Stickstoff gesetzt wurde, werden 0,0055 Mol des Katalysators Titan vier, aber Oxid tropfenweise mit einer Spritze in den Kolben gegeben. Rühren Sie das Reaktionsgemisch 24 Stunden lang bei 180 Grad Celsius und sammeln Sie das Restwasser in der Dean-Stark-Falle.

Lassen Sie das Produkt auf Raumtemperatur abkühlen. Als nächstes mischen Sie 3,2 Millimol oder ein Äquivalent des Polyols P-H-N-G-A-G mit 6,4 Millimol oder zwei Äquivalenten von vier, vier Methyl und einem Bisphenolisocyanat. In 12 Millilitern wasserfreiem DML in einen zweihalsigen Rundkolben, der mit einer Dean-Stark-Apparatur verbunden und mit einem magnetischen Sternstab versehen ist.

Das Reaktionsgemisch wird bei 70 Grad Celsius unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Geben Sie dann den Katalysator Titan vier Oxid tropfenweise über die Spritze bis zu einer Endkonzentration von 0,8% hinzuNach einer Stunde fügen Sie ein Äquivalent des Kettenverlängerers auf einem Vier-Butan-Zifferblatt hinzu, um ein Copolymerprodukt zu erhalten. Erhöhen Sie die Temperatur auf 90 Grad Celsius und hungern Sie 24 Stunden lang unter einer Stickstoffatmosphäre.

Sobald das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gebracht wurde, wird ein Dalether tropfenweise auf das Reaktionsgemisch aufgetragen, bis eine Ausfällung des Polyurethanprodukts beobachtet wird. Nach dem Überführen des Reaktionsgemisches in ein Zentrifugenröhrchen wird die Lösung fünf Minuten lang bei 5, 300 mal G zentrifugiert. Nach dem Dekantieren trocknet das Supinat bei Raumtemperatur ab, bis das Lösungsmittel verdampft ist.

Als nächstes werden 200 Milligramm PU 1 34 in eine Glasflasche gewogen. Die Probe wird auf eine Endkonzentration von 2 % in Chloroform oder Chloroform und Toluol im Verhältnis eins zu eins oder Tetraroran oder einer Kombination aus Tetraroran Antichlormethan verdünnt. In einem Eins-zu-Eins-Verhältnis wird die Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 200 Bewegungen pro Minute kräftig geschüttelt, bis die Lösung homogen wird und kein Niederschlag mehr beobachtet wird.

Wenn Sie fertig sind, legen Sie einen etwa 15 Millimeter großen, quadratischen Glasabdeckschirm auf den Schleuderdeckel. Tragen Sie 50 Mikroliter der PU-Eins-bis-Vier-Lösung mit einer Pipette auf den Deckglas auf, drehen Sie jeden Deckglas sieben Sekunden lang bei 23 Mal G. Trocknen Sie dann den Deckglas mindestens 24 Stunden lang bei Raumtemperatur an der Luft, bevor Sie sterilisiert werden. Zu diesem Zeitpunkt bestrahlen Sie jedes polymerbeschichtete Deckglas mit Gammastrahlung, indem Sie eine Dosis von 10 Grautönen mit einem Laborstrahler für 12 Minuten auftragen.

Alternativ können Sie jedes polymerbeschichtete Deckglas mit einer 30-Watt-UV-Lampe 16 Minuten lang auf jeder Seite UV-Bestrahlung bestrahlen. Wenn Sie fertig sind, legen Sie das polymerbeschichtete Deckglas in eine geeignete Gewebekulturplatte, die der Größe des Deckglases entspricht. Nach der Kultivierung und Differenzierung der humanen embryonalen Stammzelllinie wurden die Zellen unter Verwendung des Dissoziationsreagenzes abgelöst und am neunten Tag des Differenzierungsprozesses in Gegenwart der Serum-Rasterelektronenmikroskopie auf die beschichteten Deckgläser PU 1 34 wiedergegeben.

Bilder der unterschiedlich beschichteten Deckgläser zeigen, dass die Beschichtung mit Toluol oder Chloroform nicht homogen war, was auf eine ungleichmäßige Beschichtung mit PE 1 34-Ausfällung hinweist. Im Gegensatz dazu ermöglichte Tetraeder die Spin-Beschichtung einer viel gleichmäßigeren Oberfläche. Darüber hinaus zeigt die Rasterkraftmikroskopie der verschiedenen Polymerbeschichtungen eine 40%ige Verringerung der Rauheit von P 1 34, das in Tetrahydrofurin gelöst ist, im Vergleich zu anderen Lösungsmitteln, was eine gleichmäßigere PU 1 34-Beschichtung zeigt, was eine gleichmäßigere PU 1 34-Beschichtung zeigt. Eine biologische Anwendung Leberendoderm-Differenzierung wurde induziert und am neunten Tag waren hepato blastenähnliche Zellen sichtbar, wobei die Mehrheit der Zellen das Cytokeratin 19 alpha Feta Protein und den Hepatozyten-Kernfaktor für alpha und niedrige Albuminspiegel als Maß für die Stoffwechselfunktion.

Die Funktion von Cytochrom P vier 50 wurde vier Tage nach der Beschichtung auf verschiedenen polymerbeschichteten Oberflächen bewertet. Es wurde eine Verdoppelung der metabolischen Aktivität in Zellen beobachtet, die auf tetra hydro fure mpu 1 3 4 beschichteten Oberflächen plattiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stoffwechselaktivität von Hepatozyten aus humanen embryonalen Stammzellen durch eine gleichmäßigere P 1 34-Beschichtungsfläche verbessert wird. Die Kontrastbildgebung zeigte keine groben Unterschiede nach UV- oder Gammabestrahlung, was durch Rasterelektronenmikroskopie weiter bestätigt wurde.

Aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnene Hepatozyten, die auf gammastrahlenden PU 1 34-beschichteten Glasdeckgläsern beschichtet wurden, zeigten einen dreifachen Anstieg der CYP-3a-Aktivität gegenüber Zellen, die auf UV-bestrahlten PU 1 34-beschichteten Glasdeckgläsern beschichtet wurden. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Gammastrahlung die optimale Sterilisationstechnik ist. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Homogenität der Beschichtung zwischen verschiedenen Spin-Coating-CLOs zu überprüfen, und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Lösungsmittelinstrumenten äußerst gefährlich sein kann.

Anwendungen, wie z. B. das Tragen einer Schutzbrille, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer durchgeführt werden.