Name: Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Optimierung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die Langzeitkultur stammzellbasierter Hepatozyten. Diese Methode nutzt Polyurethan-Beschichtungen, um Zelladhäsion und Lebensfähigkeit zu verbessern.

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DCH, MB und FK wurden von einem EPSRC Folgen auf Fonds unterstützt. BL-V und DS wurden jeweils durch MRC PhD student unterstützt. KC wurde durch Mittel aus dem UK Regenerative Medizin-Plattform unterstützt.

1. Synthese von PHNGAD (Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol) <img alt="Schema 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme1.jpg" width="500" /> Schema 1: Synthese von PHNAGD Schematische Darstellung der Synthese von PHNAGD.. PHNAGD wurde durch Umsetzung von 1,6-Hexanodiol, Diethylenglykol, neoppentyl Glykol und Adipinsäure hergestellt. PHNAGD, Poly [1,6-hexanodiol / Neopentylglykol / Di (ethylenglykol)--alt Adipinsäure] diol. <ol><li> Anwenden der Wärmebehandlung auf die Monomeren, 1,6-Hexandiol, Di (ethylenglykol) und Neopentylglycol bei 40 ° C für 48 Stunden in einem Vakuumofen, um restliches Wasser zu entfernen. Lassen Sie die Kälte auf RT unter Vakuum. </li><li> Hinzufügen 22 mmol eines jeden Monomers und Adipinsäure (55 mMol) in einen Zweihalsrundkolben, der mit einem Rühren, ausgestattet und mit einer Dean-Stark-Apparatur angeschlossen. </li><li> Legen Sie die gesamte Baugruppe im Vakuum und sanft erhitzen glassware bei 40 ° C für 6 Stunden, um jegliche Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalien in den Kolben zu verhindern. </li><li> Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen, 0,0055 mol des Katalysators Titan (IV) butylat. </li><li> Das Reaktionsgemisch wird bei 180 ° C unter einer N 2 Atmosphäre für 24 Stunden, zu sammeln und das restliche Wasser in einer Dean-Stark-Falle. Lassen Sie das Produkt auf RT abkühlen. </li></ol> 2. Synthese von PU134 <img alt="Schema 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723scheme2.jpg" width="500" /> Schema 2: Synthese von PU134 Schematische Darstellung der Synthese von Polyurethan 134 PU134 wurde durch die Umsetzung von 1,0 Äquivalenten eines PHNGAD mit 2,0 Äquivalenten eines 4,4 &#39;-Methylenbis (phenylisocyanat) hergestellt, gefolgt von der Zugabe von 1,0. equiv eines 1,4-Butandiol Kettenverlängerungs. <ol><li> Mischen ein Äquivalent der Polyol PHNGAD (Mn ~ 1.800 Da, 3.2 mmol) mit zwei Äquivalenten 4&quot;4-Methylenbis (phenylisocyanat) (6,4 mmol) in wasserfreiem N, N-Dimethylformamid (12 ml). </li><li> Rühre das Reaktionsgemisch bei 70 ° C unter einer N 2 Atmosphäre. </li><li> Fügen über eine Spritze, Tropfen für Tropfen den Katalysator Titan (IV) butylat (0,8% wt). </li><li> Nach 1 Stunde, Hinzufügen eines Äquivalents des Kettenverlängerers 1,4-Butandiol (3,2 mmol). Erhöhung der Temperatur auf 90 ° C und rührt 24 h unter einer N 2 Atmosphäre. </li><li> Nach der Reaktion sammeln das Polyurethan durch Ausfällung durch Zugabe von Diethylether (Hexan oder Wasser kann auch verwendet werden) tropfenweise zu der Reaktionslösung, bis der Niederschlag auftritt. </li><li> Zentrifugieren der Lösung bei 5.300 × g für 5 min. </li><li> Dekantiert und trocknet bei 40 ° C in einem Vakuumofen, bis das Lösungsmittel verdampft. Hinweis: Um sicherzustellen, daß das Endprodukt der Reaktion besitzt die richtigen Parameter für den Molekulargewichtsverteilung, die funktionelle groups des Polymers und der Schmelz und Glasübergangstemperaturen können verschiedene analytische Techniken und Verfahren verwendet werden, wie Gelpermeationschromatographie oder FITR Spektroskopie. </li></ol> 3. Vorbereitung der PU134 Lösungen <ol><li> Wiegen 200 mg PU134 in eine Glasflasche. </li><li> Verdünnen PU134 bis zu einer Endkonzentration von 2% in einer Reihe von Lösemittel: Chloroform, eine Kombination von Chloroform und Toluol im Verhältnis 1: 1, Tetrahydrofuran und einer Kombination aus Tetrahydrofuran und Dichlormethan im Verhältnis 1: 1. Hinweis: Die Wahl der richtigen Lösungsmittel variiert in Abhängigkeit von dem Polymer zu verwenden. Unterschiedlichen Lösungsmitteln unterschiedliche Siedepunkte besitzen, die die Solubilisierung des Polymers beeinflussen kann. </li><li> Schütteln der Lösung kräftig für 20 min bei RT mit einer Schüttelmaschine bei einer Geschwindigkeit von 200 mot / min, bis die Lösung homogen wird und kein Niederschlag beobachtet. </li></ol> 4. Beschichtung von Glasobjektträger mit PU134 <ol><li> Legen Sie eine round 15 mm 2 Deckglas auf dem Spin Coater. </li><li> Bewerben 50 ul der PU134-Lösung in jede mit einer Pipette. Stellen Sie die Lautstärke der PU134 Lösung entsprechend für die erforderliche Deck Größe halten die Volumen zu Oberfläche Verhältnis proportional. </li><li> Drehen Sie jedes Deckglas für 7 sec bei 23 x g. </li><li> Luft trocknen Deckglas bei RT für mindestens 24 Stunden vor der Sterilisation. </li></ol> 5. Die Bestrahlung von Coverslip <ol><li> Gamma-Bestrahlung mit Polymer beschichteten Deckglas durch Anlegen einer Dosis von 10 Graustufen mit einer Labor-Strahler für 12 min. </li><li> UV-Bestrahlung mit Polymer beschichtete Deckglas mit einer 30 W, UV-Lampe für 16 min auf jeder Seite. </li><li> Platzieren des mit Polymer beschichteten Deckglas in einem geeigneten Gewebekulturplatte nach dem Foliengröße. </li></ol> 6. Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Goldbeschichtungspolymer Deck durch Sputtern für 200 s in einer Atmosphäre von 5 x 10 -1 mbar Druck. </li><li> Capture the Mikrogrammraphs des mit Polymer beschichteten Deckglas mit einem Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV in der Sekundärelektronenabbildungsmodus. </li></ol> 7. Atomic Force Microscopy Beobachtungen <ol><li> Abtasten einer Fläche von 20 x 20 um für die Polymeroberfläche. </li><li> Eine Scan-Rate von 1,32 Hz bis 1,60 Hz. </li><li> Einrichtung einer Auflösung von 512 x 512 Pixel in der abgetasteten Bereich. </li><li> Berechnen Sie das quadratische Mittel (RMS oder RQ) der Beschichtung durch Verwendung der durchschnittlichen Höhe der Abweichungen vom Mittelwert Bilddaten Ebene genommen, ausgedrückt als: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq1.jpg" width="123" /> Wobei Zi die aktuelle Z-Wert ist, und N die Anzahl von Punkten innerhalb des bestimmten Gebiets. </li><li> 7.5 Berechnen Sie die Abweichung oder mittlere Oberflächenrauigkeit (Ra) des Bildes mit, <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51723/51723eq2.jpg" width="154" /> Wobei Z (x) ist die Funktion, t beschreibter Oberflächenprofil in der Höhe (Z) und Position (x) der Probe über die Bewertungslänge &quot;L&quot; analysiert. Ra stellt den Mittelwert der Oberfläche relativ zu der Mittelebene. </li></ol> 8. Zellkultur und Differenzierung <ol><li> Kultur und differenzieren die humane embryonale Stammzelllinie (hES) H9 als in Hay 17 beschrieben. </li><li> Lösen Zellen unter Verwendung eines Reagens Dissoziation und Ausstrich sie auf PU134 beschichtete Objektträger an Tag 9 des Differenzierungsprozesses, in Gegenwart von einem serumfreien Medium, wie in Szkolnicka 18,19 beschreiben. Anmerkung: Die Verwendung eines enzymatischen Zell Dissoziation physikalischen Zellablösung bevorzugt. </li></ol> 9. Cytochrom-P450-Funktionstest <ol><li> Messen CYP3A-Aktivität nach der Anleitung des Herstellers. </li><li> HESC abgeleitet Hepatozyten an Tag 13 oder Tag 19, und Medien inkubieren ohne Zellen - als Negativkontrolle, mit der entsprechenden substraß für 5 h bei 37 ° C aufweist. </li><li> Sammeln Ständen von Zellen und Medien, führen Sie den Test nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Messung der Höhe der CYP-Aktivität und normiert auf die Fläche (cm 2). </li></ol> 10. Immunfärbung <ol><li> Wasch hESC abgeleitet Hepatozyten mit PBS für 1 min, zwei Mal wiederholen. </li><li> Fügen eiskalten 100% Methanol, um Zellen zu fixieren, in -20 ° C für 10 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und zweimal wiederholen. </li><li> Inkubiere die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 10% BSA für 1 h bei RT. </li><li> Saugen Sie das PBST-Lösung und fügen Sie den entsprechenden primären Antikörpers in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA verdünnt, Inkubation bei 4 ° C unter leichtem Schütteln O / N. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA für 5 min und dreimal wiederholen. </li><li> Verdünne die entsprechenden Antikörper in PBS / T (0,1% Tween) / 1% BSA, in den Zellen und Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Stunde unter leichtem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS für 5 min und dreimal wiederholen. </li><li> Fügen MOWIOL 488 (mit DAPI 1: 1.000) in jede Vertiefung, fügen Sie ein Deckglas vorsichtig auf die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren. Speicher fixierten Zellen bei 4 ° C im Dunkeln. Beachten Färbung unter Verwendung eines Mikroskops mit entsprechenden Filter und Leuchtstofflampen. Die optimierten primären und sekundären Antikörper sind in Tabelle 1 aufgelistet. </li></ol>

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<li>Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blistering+and+degradation+of+polyurethane+coatings+under+different+accelerated+weathering+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests.</a> Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).</li>
</ol>

DCH ist CSO, Regisseur, Gründer und Gesellschafter der FibromEd Products Ltd MB und JPI sind Gründungsaktionäre in FibromEd Products Ltd

Viele der verwendeten Hepatozyten aus Stammzellen erzeugen aktuellen Methoden beruhen auf undefinierte Matrizen tierischen Ursprungs. Diese Substrate können kostspielig und sehr variabel sein und somit die Zellfunktion und der Stabilität, die ein großes Hindernis für Anwendung. Daher führten wir einen Bildschirm für synthetische Materialien, die die Kultur der Stammzell abgeleitet Hepatozyten zu unterstützen. Wir haben festgestellt, eine einfache Polyurethan (PU134) durch Polymerisation PHNGAD, MDI und ein Streckmittel,...

Biologische Materialien sind weit verbreitet bei der Aufrechterhaltung und Differenzierung von pluripotenten Stammzellen 1 verwendet. Und ermöglichen, enthalten diese biologischen Substraten oft eine Vielzahl von unbestimmten Komponenten. Matrigel ist eine häufig verwendete Substrat für die Stammzellkultur und Differenzierung. Leider beeinflusst die variable Zusammensetzung der Zellfunktion und Phänotyp. Obwohl eine Vielzahl von alternativen, definierten biologischen Matrices wurden verwendet, 2-7, ihre tierischen Ursprungs oder schlechte Skalierbarkeit macht sie ungeeignete Kandidaten für die industrielle Fertigung. Daher ist die Identifizierung von synthetischen Alternativen, mit definierter Zusammensetzung und zuverlässige Leistung, sind wichtige Ziele in der Stammzellforschung. In einem Versuch, die Grenzen der undefinierten Zellkultursubstraten zu überwinden, sind interdisziplinäre Kooperationen zwischen Chemie und Biologie synthetischen Materialien mit der Fähigkeit, Zell-Phänotyp unterstützt identifiziert. SynthWDV-Substrate sind skalierbar, kostengünstig und kann in komplexe 3D-Strukturen hergestellt werden, imitiert die in vivo-Umgebung. Aufgrund dieser Eigenschaften synthetischen Substraten sind weit verbreitet zu unterstützen und zu fahren Differenzierung vieler Zelltypen 8-10. Erweiterte und Hochdurchsatz-Assays haben die schnelle Screening von synthetischen Materialien erleichtert, von großen Bibliotheken, und lieferte neuartige Materialien mit flexiblen Eigenschaften mit breiten Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und Entwicklung 11-13. Verwendung von Hochdurchsatz-, Polymer-Mikroarray-Screening-Technologie, haben wir schnell eine einfache Polyurethan (PU134), geeignet für die Instandhaltung von menschlichen Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten identifiziert. Dieses Polymer wurde zu überlegen Tieren stamm Substrate hinsichtlich Hepatozyten-Differenzierung und-Funktion 14-16 sein. Wir haben anschließend die Beschichtungsbedingungen, Topographie und Sterilisationsverfahren, Effekte zugreifen optimiertauf Polymer Leistung bei der Stabilisierung Hepatozyten Funktion und Lebensdauer. Dies hat erhebliche Auswirkungen in Bezug auf das Verständnis der Biologie Grundlagen der Hepatozyten für Zell-basierte Modellierung und Anwendungen der regenerativen Medizin. Die hier beschriebene Technologie ist ein Beispiel, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers kann optimiert werden, um Zell-Phänotyp zu bewahren. Wir glauben, dass die Kombination dieser Technologie mit einer effizienten serumfreien Hepatozyten Differenzierungsprotokoll hat das Potenzial, eine skalierbare Herstellung von Hepatozyten zur Verwendung in in vitro-Modellierung und regenerative Medizin bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Synthese, Aufbereitung, Beschichtung und Charakterisierung von polymerbeschichteten PU134-beschichteten Deckgläsern</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Edmun B&uuml; hler</td><td>KS-15</td><td></td></tr><tr><td>Bestrahlungsgerät</td><td>CIS Biointernational</td><td>IBL 637&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Specialty Coating System</td><td>P-6708</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop&nbsp;</td><td>Philips</td><td>XL30CPSEM</td><td></td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop</td><td>DimensionV Nanoskop, VEECO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p4-GLO CYP3A4</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td>ESCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoScope Analysesoftware</td><td>VEECO</td><td></td><td>Version 1.20</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>TH45200</td><td>Volocity 4 Software verwenden</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten</td><td>Corning, Großbritannien&nbsp;</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td>MIC3308</td><td></td></tr><tr><td>Diethylenglykol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>93171</td><td></td></tr><tr><td>1,6-Hexandiol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>240117</td><td></td></tr><tr><td>Neopentylglykol</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>408255</td><td></td></tr><tr><td>Adipinsäure</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies N,N-Dimethylformamid</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>676845</td><td></td></tr><tr><td>Titan (IV)-butoxid&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>244112</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Butandiol&nbsp;</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>493732</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumschrank</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Methylenbis(phenylisocyanat)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>101688</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Sputter-Coater</td><td>Bal-Tec SCD 050</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inmunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate buffer salz (-MgCl2, -CaCl2)</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>PBST, PBS bestehend aus 0,1% TWEEN 20&nbsp;</td><td>&nbsp; Wissenschaftlicher Laborbedarf Ltd</td><td>EC607&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>&nbsp; Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>CHE5010</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich, Großbritannien</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>MOWIOL 488 DAPI</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>Hergestellt aus Tris HCl und Glycerin gemäß den Anweisungen</td></tr><tr> des Herstellers<td colspan="4">Zellkultur und funktioneller Assay</td></tr><tr><td>CYP3A-Aktivität pGLO-Kit</td><td>Promega</td><td>V8902</td><td></td></tr><tr><td>Hepatozym</td><td>Gibco</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>TryLE express</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12604013">12604013</a></td><td></td></tr></tbody></table>

stabilisierung leberzell phänotyp mit optimierten surfaces

Stabilizing Hepatocellular Phenotype Using Optimized Synthetic Surfaces

Derzeit besteht eine der größten Einschränkungen in der Zellbiologie darin, den differenzierten Zellphänotyp beizubehalten. Biologische Matrices werden häufig für die Kultivierung und Erhaltung von primären und pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hepatozyten verwendet. Biologische Matrices sind zwar nützlich, ermöglichen aber eine kurzfristige Kultivierung von Hepatozyten, was ihre breite Anwendung einschränkt. Wir haben versucht, die Einschränkungen mit einer synthetischen Polymerbeschichtung zu überwinden. Polymere stellen eine der breitesten Klassen von Biomaterialien dar und besitzen ein breites Spektrum an mechanischen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, die je nach Einsatzzweck fein abgestimmt werden können. Wichtig ist, dass solche Materialien auf qualitätsgesicherte Standards skaliert werden können und eine Konsistenz von Charge zu Charge aufweisen. Dies ist unerlässlich, wenn Zellen für das Screening mit hohem Durchsatz in der pharmazeutischen Testindustrie oder für die zellbasierte Therapie expandiert werden sollen. Polyurethane (PUs) sind eine Gruppe von Materialien, die sich in der Zellkultur als vielversprechend erwiesen haben. Unsere jüngsten Fortschritte bei der Optimierung einer Polyurethan-beschichteten Oberfläche für die Langzeitkultur menschlicher Hepatozyten mit stabilem Phänotyp werden vorgestellt und diskutiert.

Polymerlösungsmittel beeinflusst die Topographie des mit Polymer beschichteten Oberfläche Polyurethan-134 wurde in Chloroform gelöst, entweder allein oder in Kombination mit Toluol oder Tetrahydrofuran oder Dichlormethan, und die Objektträger aus Glas mit den verschiedenen Formulierungen schleudert. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurden zur Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Polymerschichten (Abbildung 1).</stro...

Dieser Artikel wird auf die Entwicklung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die langfristige Ausrichtung, stabile Kultur der Stammzell abgeleitet humanen Hepatozyten.

Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, polymerbeschichtete Oberflächen so zu optimieren, dass die langfristig stabile Kultur von aus Stammzellen abgeleiteten menschlichen Hepatozyten erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem zunächst Polyurethan 1 3 4 oder PU 1 3 4 synthetisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das geeignete Lösungsmittel zur Lösung von PU 1 34 auszuwählen.Anschließend wird der Spin-Coating-Prozess mit dem PU 1 3 4 auf dem Glasdeckel optimiert. Der letzte Schritt ist die Optimierung des Sterilisationsverfahrens der mit dem Polymer P 1 34 beschichteten Glasdeckel, gefolgt von der Untersuchung mittels Rasterelektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und Arzneimittelmetabolismus. Assays werden verwendet, um den Einfluss der PU 1 34-Polymerbeschichtung auf die Funktion von aus Stammzellen abgeleiteten Hepatozyten zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung von al-Matrizes in der Kultur zur Aufrechterhaltung potenter, hepatocytenähnlicher Stammzellen, liegt darin, dass diese synthetischen Materialien gezielt für einen bestimmten Zweck optimiert und in einem Maßstab auf Qualitätsstandards hochskaliert werden können. Außerdem weisen sie eine konsistente Batch-zu-Batch-Übereinstimmung auf. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie von Lebererkrankungen hinein, da sie ein Beispiel dafür darstellt, wie die Oberfläche eines synthetischen Polymers optimiert werden kann, um das Zellphänotyp zu bewahren.Den Ablauf wird Dr. Jeffrey Walton, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Vor Beginn dieses Verfahrens wenden Sie eine Wärmebehandlung des Mono-1,6-Hexandioats von Diethylenglykol und Neopentylglykol bei 40 Grad Celsius für 48 Stunden in einem Vakuumofen an, um eventuell vorhandenes Restwasser zu entfernen. Geben Sie 22 Millimol jedes Monomers und 55 Millimol einer dpic-Säure in einen zweihalsigen Rundkolben, der mit einer Dean-Stark-Apparatur verbunden ist und mit einem magnetischen Rührstab ausgestattet ist.Bringen Sie danach die gesamte Apparatur unter Vakuum und erhitzen Sie das Glasgefäß vorsichtig 6 Stunden lang auf 40 Grad Celsius, um eine Feuchtigkeitsaufnahme während der Zugabe der Chemikalie zum Kolben zu vermeiden. Nachdem Sie die Apparatur aus dem Ofen genommen und das System unter Stickstoff gesetzt haben, geben Sie 0,0055 Mol des Katalysators Titan(IV)-oxid tropfenweise mittels einer Spritze zum Kolben hinzu. Rühren Sie das Reaktionsgemisch 24 Stunden lang bei 180 Grad Celsius um, wobei das Restwasser in der Dean-Stark-Falle gesammelt wird.Lassen Sie das Produkt auf Raumtemperatur abkühlen. Anschließend mischen Sie 3,2 Millimol oder eine Äquivalentmenge des Polyols P-H-N-G-A-G mit 6,4 Millimol oder zwei Äquivalenten des vier vier Methyl und eines Bisphenol-Isocyanats in 12 Milliliter wasserfreiem DML in einem zweihalsigen Rundkolben, der mit einer Dean-Stark-Apparatur verbunden ist und einen magnetischen Rührstab enthält.Rühren Sie das Reaktionsgemisch 70 Grad Celsius unter einer Stickstoffatmosphäre. Fügen Sie anschließend den Katalysator Titandioxid tropfenweise über eine Spritze zu, um eine Endkonzentration von 0,8 % zu erreichen. Nach einer Stunde geben Sie ein äquivalentes Maß des Kettenverlängers 1,4-Butandiol zu, um das Copolymerisierungsprodukt zu erhalten. Erhöhen Sie die Temperatur auf 90 Grad Celsius und lassen Sie die Reaktion 24 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre laufen.Nachdem das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt ist, tropfenweise Diethylether zum Reaktionsgemisch geben, bis die Ausfällung des Polyurethan-Produkts beobachtet wird. Nach dem Übertragen des Reaktionsgemischs in ein Zentrifugenröhrchen die Lösung bei 5.300 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Abgießen das Überstandsvolumen bei Raumtemperatur trocknen, bis das Lösungsmittel verdunstet ist.Als Nächstes 200 Milligramm PU 1 34 in eine Glasflasche einwiegen. Die Probe auf eine Endkonzentration von 2 % in Chloroform oder Chloroform und Toluol im Verhältnis 1:1 oder Tetrahydrofuran oder einer Kombination aus Tetrahydrofuran und Chloromethan verdünnen. Das Gemisch im Verhältnis 1:1 für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln mit einem Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 200 Bewegungen pro Minute schütteln, bis sich eine homogene Lösung gebildet hat und kein Niederschlag mehr sichtbar ist.Wenn fertig, etwa 15 Millimeter große quadratische Glasdeckgläser auf den Spin-Coter geben. Mit einer Pipette 50 Mikroliter der PU 1–4-Lösung auf das Deckglas auftragen und jedes Deckglas sieben Sekunden lang bei 23 × g spinnen. Anschließend das Deckglas mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur lufttrocknen lassen, bevor es sterilisiert wird. Danach jedes polymerbeschichtete Deckglas durch Bestrahlung mit einer Dosis von 10 Gray für 12 Minuten in einem Laborbestrahlungsgerät gammastrahlen.Alternativ bestrahlen Sie jeden mit Polymer beschichteten Deckgläser jeweils 16 Minuten lang mit einer 30-Watt-UV-Lampe von beiden Seiten. Danach platzieren Sie das mit Polymer beschichtete Deckglas entsprechend seiner Größe in eine geeignete Zellkulturschale. Nach Kultivierung und Differenzierung der aus der humanen embryonalen Stammzelllinie abgetrennten Zellen mithilfe eines Dissoziationsreagenz, überimpfen Sie diese am neunten Tag des Differenzierungsprozesses in Anwesenheit von serumfreiem Medium auf die PU 1 34-beschichteten Deckgläser für die Rasterelektronenmikroskopie.Bilder der verschiedenen beschichteten Glasdeckgläser zeigen, dass die Beschichtung mit Toluol oder Chloroform nicht homogen war, was auf eine ungleichmäßige Beschichtung mit PE 1 34-Präzipitation hindeutet. Im Gegensatz dazu ermöglichte Tetrahydrofuran eine Spin-Beschichtung mit einer deutlich gleichmäßigeren Oberfläche. Zusätzlich zeigt die Analyse der verschiedenen Polymerbeschichtungen mittels Rasterkraftmikroskopie eine um 40 % geringere Rauheit von P 1 34, das in Tetrahydrofuran gelöst war, im Vergleich zu anderen Lösungsmitteln, was auf eine gleichmäßigere PU 1 34-Beschichtung schließen lässt. In einer biologischen Anwendung wurde die hepatische Endodifferenzierung induziert, und am neunten Tag waren hepatoblastenähnliche Zellen erkennbar, wobei der Großteil der Zellen Cytokeratin 19, Alpha-Fetoprotein und hepatären nukleären Faktor 4 Alpha exprimierte sowie geringe Albuminspiegel als Maß für die metabolische Funktion aufwies.Die Funktion des Cytochrom P450 wurde vier Tage nach dem Umpflanzien auf verschiedene polymerbeschichtete Oberflächen bewertet. Ein zweifacher Anstieg der metabolischen Aktivität in Zellen, die auf Tetrahydrofuran-PU134-beschichteten Oberflächen umgepflanzt wurden, konnte beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die metabolische Aktivität von humanen embryonalen Stammzellen abstammenden hepatozytenartigen Zellen durch eine gleichmäßigere P134-Beschichtungsoberfläche verbessert wird. Die Kontrastbildgebung zeigte keine groben Unterschiede nach UV- oder Gammabestrahlung, was durch die Analyse mittels Rasterelektronenmikroskopie weiter bestätigt wurde.Humanen embryonalen Stammzellen abgeleitete Hepatozyten, die erneut auf mit Gammastrahlung behandelten, PU 1 34-beschichteten Glasdecken ausgesät wurden, wiesen eine dreifach erhöhte CYP drei a-Aktivität im Vergleich zu Zellen auf, die auf mit UV-Strahlung behandelten, PU 1 34-beschichteten Glasdecken ausgesät wurden. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Gammastrahlenbestrahlung die optimale Sterilisationstechnik ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Homogenität der Beschichtung zwischen verschiedenen Spin-Coating-CLOs zu überprüfen, und nicht zu vergessen, dass das Arbeiten mit chemischen Lösungsmitteln und Geräten äußerst gefährlich sein kann.Maßnahmen wie das Tragen einer Schutzbrille sollten stets beachtet werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

stabilizing-hepatocellular-phenotype-using-optimized-synthetic

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

Robuste Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Die hier vorgestellte Methode beschreibt eine skalierbare und gute Herstellungspraxis (GMP) -fähigen Differenzierungssystem menschlichen Hepatozyten-ähnliche Zellen aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Es dient als eine kostengünstige und standardisiertes System humanen Hepatocyten-artigen Zellen für Grundlagen- und angewandten Forschung der menschlichen Leber zu erzeugen.

Definierte und Scalable Generierung von Leber-ähnlichen Zellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Herstellung von Hepatosphären aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Kultursystems und einer Zellselbstmontage. Dieses Protokoll ist in einer Reihe von Zelllinien reproduzierbar, kostengünstig und ermöglicht die Produktion von stabilen menschlichen Hepatosphären für die biomedizinische Anwendung.

Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Das Ziel dieses Artikels ist es, einen standardisierten Ansatz zur Induktion der Differenzierung des menschlichen Lebervorläufers von pluripotenten Stammzellen bereitzustellen. Die Entwicklung dieses Verfahrens mit gebrauchsfertigen Medienformulierungen bietet dem Anwender ein einfaches System zur Erzeugung menschlicher Leberzellen für die biomedizinische Forschung und Translation.

Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Aus Maushepatozyten wurde ein langfristiges Ex-vitro-3D-Organoidkultursystem etabliert. Diese Organoide können durch Lentivirus-Infektion der shRNA /ektopischen Konstruktion, siRNA-Transfektion und CRISPR-Cas9-Engineering durchpasst und genetisch manipuliert werden.

Etablierung und genetische Manipulation von murinen Hepatozyten-Organoiden

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Jüngste technische Fortschritte ermöglichten die skalierte Produktion einer In-vitro-Plattform für Anwendungen im Bereich des Arzneimittelstoffwechsels und der Toxizität. Ein rein humanes 2D+ Lebersystem (TV2D+) liefert physiologisch relevante Ergebnisse mit herkömmlichen zweidimensionalen Kulturmethoden. Dieses Protokoll unterstützt Endbenutzer bei der Einrichtung, Wartung und Anwendung des Systems.

Ein rein humanes Leberkultursystem für Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung

Erfahren Sie die Optimierung von Polymer-beschichteten Oberflächen für die Langzeitkultur stammzellbasierter Hepatozyten. Diese Methode nutzt Polyurethan-Beschichtungen, um Zelladhäsion und Lebensfähigkeit zu verbessern.

Stabilisierung Leberzell Phänotyp mit optimierten Surfaces

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