Hepatischer Vorläufer aus pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems

Dieses Protokoll bietet ein aus Stammzellen gewonnenes hepatisches Differenzierungssystem, das ein reproduzierbares Werkzeug für die Untersuchung der Leberbiologie sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die klinische Forschung bietet. Durch die Kombination eines standardisierten und leicht zu befolgenden Protokolls mit handelsüblichen Kulturreagenzien ermöglicht dieses System die Produktion von hepatischen Vorläuferzellen und hepatozytenähnlichen Zellen in großem Maßstab. Halten Sie menschliche pluripotente Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer 10-Zentimeter-Schale mit Laminin-531 und füttern Sie sie täglich mit 10 Millilitern Stammzellerhaltungsmedium pro Schale.

Zur Herstellung von Laminin 521-Platten wird aufgetautes Laminin 521 in eiskaltem DPBS mit Calcium und Magnesium auf eine Endkonzentration von acht Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Geben Sie 250 Mikroliter der Lamininlösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte oder 50 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Schütteln Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die Vertiefungen gleichmäßig zu beschichten, versiegeln Sie die Platten dann mit einer halbtransparenten flexiblen Folie und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am Tag der Zellaussaat erwärmen Sie die vorbeschichteten Platten in einem Zellkultur-Inkubator für 30 bis 60 Minuten. Aspirieren Sie die Laminin 521-Lösung und geben Sie Stammzellerhaltungsmedium, das mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren ergänzt ist, in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Wenn die flüssige Zellzahl 70 bis 80 % erreicht, aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus der Kulturschale und waschen Sie jede Kulturschale mit fünf Millilitern DPBS ohne Kalzium oder Magnesium bei Raumtemperatur.

Aspirieren Sie die DPBS-Wäsche aus der Kulturschale, geben Sie dann fünf Milliliter enzymfreies Dissoziationsreagenz in die Schale und inkubieren Sie die Platte acht bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen sichtbar von der Schale gelöst haben. Lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber von der Kulturschale und pipettieren Sie dann den Inhalt jeder Vertiefung mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette auf und ab, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten. Für jede Zelllinie werden Zellen aus allen Erhaltungsvertiefungen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen gepoolt.

Waschen Sie jede geleerte Kulturschale mit fünf Millilitern dieses Erhaltungsmediums für Stammzellen und geben Sie die Waschungen in das entsprechende Röhrchen mit den gepoolten Zellen. Führen Sie drei Zählungen lebensfähiger Zellen an jeder gepoolten Probe durch. Die gepoolten Proben werden fünf Minuten lang bei 250 x g zentrifugiert.

Anschließend aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen bei ein bis drei Millilitern Raumtemperatur als Stammzellerhaltungsmedium, das mit dem 10-mikromolaren ROCK-Inhibitor Y27632 ergänzt wird. Nachdem Sie die erforderliche Anzahl von Zellen berechnet haben, die zum Erreichen der gewünschten Seeding-Dichte erforderlich sind, resuspendieren Sie die Zellen auf die entsprechende Konzentration und geben sie in die vorbeschichteten Platten. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung sollte bei einer 24-Well-Platte einen Milliliter und bei einer 96-Well-Platte 0,1 Milliliter betragen.

Bewegen Sie die Platten vorsichtig von einer Seite zur anderen und hin und her, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten, und legen Sie die ausgesäten Platten in den Inkubator, indem Sie sie hin und her und von einer Seite zur anderen schaukeln. Bereiten Sie Medien für die definitive Endoderm-Induktion und für die anschließende Differenzierung der hepatischen Vorläuferzellspezifikation vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Entfernen Sie am ersten Tag der Differenzierung das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen und ersetzen Sie es durch das Medium der ersten Stufe.

Entfernen Sie an den Tagen zwei, drei und vier das verbrauchte Medium und füttern Sie jedes gut mit Medium der Stufe eins, zwei. Reparieren Sie am fünften Tag die Vertiefungen, die für die endgültige Analyse der Endodermdifferenzierung vorgesehen sind. Entfernen Sie für die verbleibenden Vertiefungen das verbrauchte Medium und füttern Sie jede Vertiefung mit Stammdiff hepatischem Vorläufermedium.

Am Tag 10 werden Zellen für die Analyse der hepatischen Vorläuferdifferenzierung entnommen oder mit einer weiteren hepatozytenähnlichen Zelldifferenzierung fortgefahren. Um die hepatischen Vorläufer-Differenzierungskulturen zu charakterisieren, verwenden Sie Immunfärbung, um die Expression definitiver endodermspezifischer Marker am fünften Tag und hepatischer Vorläufer-spezifischer Marker an Tag 10 nachzuweisen und den Prozentsatz der HNF4-alpha-positiven Zellen zu quantifizieren. Messen Sie an Tag 10 auch die Alpha-Fetoprotein- und Albuminsekretion über ELISA.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um hepatische Vorläuferzellen sowohl von humanen embryonalen Stammzellen als auch von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu unterscheiden. Am fünften Tag des Differenzierungsprotokolls wurde die definitive Endodermspezifikation über die Sox-17-Expression bestimmt. In beiden Zelllinien wurde Sox 17 stark exprimiert, wobei 80 bzw. 87,8% der Sox 17-positiven Zellen für H9 und P106 waren.

Am Tag 10 zeigten die hepatischen Vorläuferzellen eine kopfsteinpflasterartige Morphologie. Darüber hinaus wurde die Spezifikation der hepatischen Vorläuferzellen für die Expression von HNF4 alpha, AFP, Albumin und Cytokeratin 19 untersucht. Beide hepatischen Vorläuferkulturen exprimierten fetale Lebermarker wie HNF4 alpha, AFP und CK 19.

Die Alpha-Fetoprotein-Sekretion wurde an Tag 10 in beiden Zelllinien nachgewiesen, während die Albuminsekretion mit ELISA nicht nachgewiesen wurde. Die Variabilität der Zellzahl und die Effizienz der hepatischen Vorläuferdifferenzierung wurden durch Quantifizierung der HNF4-alpha-Expression bewertet. An Tag 10 zeigten die hepatischen Vorläuferzellen keine signifikante Variabilität zwischen den Reihen mit über 95 bzw. 97 % HNF4-alpha-positiven Zellen pro Vertiefung für H9 bzw. P106.

Eine gleichmäßige Zellverteilung vor Beginn der Differenzierung ist der Schlüssel zur Gewährleistung einer homogenen Population von hepatischen Vorläuferzellen. Um dies zu erreichen, schütteln Sie die Platten vorsichtig von einer Seite zur anderen und hin und her, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Lebervorläuferzellen, die mit diesem Protokoll hergestellt werden, können für andere Assays weiter zu hepatozytenähnlichen Zellen differenziert werden, was ein reproduzierbares und standardisiertes Werkzeug für die Modellierung von Krankheiten oder das Wirkstoffscreening bietet.