Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, imaginale Scheiben von Drosophila-Larven zu sezieren. Für die Immunhistochemie wird dies erreicht, indem zunächst der Kopfkomplex, bestehend aus Mund, Haken, Auge- und Tenalscheiben, und Gehirn aus den Larven entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Kopfkomplex zu fixieren und mit primären und sekundären Antikörpern zu inkubieren. Als nächstes werden die Augen- und Tenalscheiben vom Kopfkomplex getrennt.

Der letzte Schritt besteht darin, die imaginären Scheiben in Antibleichmittel auf einen Objektträger zu montieren. Letztendlich können fluoreszierende oder LAC Z-Reporter und Antikörperfärbungen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie die räumliche und zeitliche Expression von Genen und Proteinen innerhalb des Imaginalgewebes aufdecken. Diese Technik kann jedoch verwendet werden, um Einblicke in die Gen- und Proteinlokalisation in der enten imaginalen Scheibe zu erhalten.

Es kann auch auf andere imaginale Gewebe wie das Flügelbein und den Halt aufgetragen werden. Hier. Um das Experiment zu beginnen, füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit Dissektionspuffer. Legen Sie 10 bis 20 Larven in die Petrischale und lassen Sie sie fünf Minuten lang herumschwimmen.

Um sich selbst mit einem Schädling zu reinigen, legen Sie mit Ihrer Pipette einen großen Pool aus Dissektionspuffer in der Mitte einer Dissektionsplatte auf Silikonbasis an. Platzieren Sie drei kleinere Becken um das große Becken herum und bringen Sie die Larven mit einer Pinzette in das untere Becken. Übertragen Sie dann mit der Pinzette Nummer fünf eine einzelne gereinigte Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool mit dem Dissektionspuffer.

Um mit der groben Dissektion zu beginnen, greifen Sie mit einer Pinzette nach den Mundhaken und mit der anderen Pinzette vorsichtig nach den Larven. Bei einem Drittel seiner Körperlänge hält er den Maulhaken fest. Ziehe den Rest des Körpers schnell mit einer zweiten Pinzette weg.

Lösen Sie die Larve von der Pinzette und lassen Sie die Eingeweide herauslaufen, so dass die imaginären Scheiben in ihrer normalen Bestätigung bleiben können. Fassen Sie dann die Mundhaken und entfernen Sie mit der anderen Pinzette die unteren zwei Drittel der Larven, einschließlich der inneren Eingeweide. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Speicheldrüsen, Beinscheiben und anderes Gewebe

Das einzige Gewebe, das verbleiben sollte, ist eine kleine Menge der darüber liegenden Nagelhaut. Die Mundhaken, die Augen- und Tenalscheiben, die Gehirnhälften und das Ventralganglion. Nach maximal 20 Minuten übertragen Sie alle präparierten Gewebe auf den paraformen Aldehyd-Lysin-Pariah.

Dattelfixativ oder PLP. Lassen Sie imaginale Discs nicht länger als 20 Minuten im Dissektionspuffer verbleiben, da sie sonst nach der Dissektion abgebaut werden. Übertragen Sie das präparierte Gewebe in Schritten von 100 Mikrolitern auf ein Uhrenglas, das kaltes PLP enthält.

Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das präparierte Gewebe vollständig untergetaucht ist. Inkubieren Sie das präparierte Gewebe 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in kaltem PLP-Fixiermittel ohne Rühren. Übertragen Sie als Nächstes 100 Mikroliter präpariertes Gewebe von PLP in den Waschpuffer.

Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist, und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Übertragen Sie dann das präparierte Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Entfernen Sie den Waschpuffer und ersetzen Sie ihn durch 100 Mikroliter Blocklösung.

Inkubieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung auf einem Tischrotator für 10 Minuten. Entfernen Sie nach dem Blockieren die Lösung und ersetzen Sie sie durch 100 Mikroliter Primärantikörperlösung in 10%igem Normalziegenserum. Inkubieren Sie das Gewebe je nach Stärke des Antikörpers 16 Stunden lang bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation.

Entfernen Sie anschließend den primären Antikörper und ersetzen Sie ihn durch 750 Mikroliter Waschpuffer. Legen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Mutator. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Mutator und lassen Sie die Köpfe am Boden des Röhrchens absetzen.

Entfernen Sie dann den Waschpuffer und fügen Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörperlösung in 10%Normal Serum hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation für mindestens zwei Stunden, abhängig von der Stärke des Antikörpers. Entfernen Sie nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung aus dem Gewebe.

Ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Waschpuffer und lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen. Legen Sie drei Pools Waschpuffer auf eine Silikon-Präparierplatte. Übertragen Sie alle präparierten Gewebe in den großen Pool mit Waschpuffer, der auf die Präparierschale gelegt wurde.

Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen, um mit der Feindissektion zu beginnen, den Kopfkomplex mit der Bauchseite nach unten zu platzieren und die Nagelhaut an den Mundhaken zu umschließen. Platzieren Sie eine zweite Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und den Augenscheiben und ziehen Sie das Gehirn schnell von den Mundhaken weg, um die beiden Hirnlappen zu entfernen, während Sie sich weiterhin an den Mundhaken festhalten. Kneifen Sie das Gewebe so nah wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil der Augenantennenscheibe und dem Mundhaken ab.

Fahren Sie fort, bis das gewünschte Gewebe präpariert wurde. Legen Sie als Nächstes zwei kleine Stücke Seidenpapier in der Größe von Deckgläsern im Abstand von drei Zentimetern auf die Sezierschale. Legen Sie einen Objektträger aus Glas auf diese Papierstücke, um zu verhindern, dass der Objektträger an der Silikonbasis der Sezierschale kleben bleibt.

Mit einer P 20 Pipette für Männer neun Mikroliter Antibleichmittel in die Mitte des Glasobjektträgers geben, um ein Ausbleichen des Gewebes durch Fluoreszenzlicht mit derselben ungeschnittenen Spitze zu verhindern, alle I- und Tenalscheiben sammeln und zum Tropfen des Anti-Bleaching-Reagenzes geben. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Augen- und Tenalscheiben in dem Tropfen des Anti-Bleaching-Reagenzes zu trennen und zu verteilen, bis sich keine imaginären Scheiben mehr berühren. Senken Sie mit einem feinen Pinsel einen Deckslip vorsichtig auf den Tropfen des Antibleichmittels, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.

Lagern Sie die Objektträger schließlich bei minus 20 Grad Celsius, bis sie bereit sind, die Ionen-Tenalscheiben mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie zu betrachten und abzubilden. Diese Methode erzeugt zuverlässig qualitativ hochwertiges Material für die Analyse, wie es durch diese konfokalen Bilder von imaginalen Scheiben vermittelt wird. Die Scheiben wurden mit einem Foid und konjugiertem Fluor-Four behandelt, das an F-Aktin bindet und somit jede Zelle umreißt.

Eines der auffälligsten Merkmale der Entalscheibe ist die morphogenetische Furche, die als Vertiefung im Gewebe zu sehen ist, die entlang der dorsalen ventralen Achse verläuft. Während die Furche über das Augenfeld fortschreitet, verwandelt sich das Meer ungeordneter Zellen in eine geordnete Anordnung von periodisch verteilten Einheitsaugen oder Oma Tedia. Die Verifizierung der klonalen Expression und die Analyse der I-Imaginalscheibe sind mögliche nachgelagerte Anwendungen dieser Methode.

Die oberen drei Panels zeigen Scheiben, die mit verschiedenen Antikörpern wie ilis, A DPP, LAC Z Transkriptionsreporter und zellspezifischen Markern wie embryonal, letal, abnormalem Sehen oder vy gefärbt wurden, das für ein panneuronales, RNA-bindendes Protein kodiert. Die unteren drei Felder zeigen Scheiben, in denen GFP zur Markierung von Zellpopulationen verwendet wird. Sobald der Kurs gemeistert ist, dauert die Isolierung von Kopfkomplexen von 10 bis 20 Larven etwa 10 Minuten, und zusätzlich wird die Feinisolierung der Ionen-Tenallscheibe von diesen Komplexen ebenfalls etwa 10 Minuten dauern.