Name: Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Gen- und Proteinexpression in vivo.

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Wir möchten Donald Ready und Kevin Moses für den Unterricht JPK die ursprüngliche Imaginalscheibe Dissektion Verfahren danken. Wir danken auch Bonnie Weasner für die Genitalscheibe in 1B und dem Auge Scheibe in 2A, Brandon Weasner für Abbildung 3 ist die Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Flecken und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Antikörper. CMS wurde von einem Stipendium der National Institutes of Health (NIH) GCMS Trainings Grant (T32-GM007757), die Frank W. Putnam-Forschungsstipendium, und der Robert Briggs-Forschungsstipendium unterstützt. JPK wird durch einen Zuschuss aus dem National Eye Institute unterstützt (R01 EY014863)

1. Herstellung von Larven <ol><li> Füllen Sie eine 35 mm Petrischale mit Dissektion Puffer. </li><li> Zeigen Larven in Petrischale und es ihnen ermöglichen, um für ein paar Minuten (Selbstreinigungsschritt) zu schwimmen. </li><li> Übertragen Larven zu einem Pool von Präparation Puffer auf Silikonbasis Schneideplatte. Dieser Pool ist an einer Kante der Platte ist. Die Schneideplatte aus einer Silikonlösung, die gegossen wurde und in einer Glaspetrischale ausgehärtet. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, legen Sie einen größeren Pool von Dissektion Puffer in der Mitte der Platte Dissektion. </li><li> Mit # 5 Zangen, übertragen eine einzelne gereinigt Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool von Dissektion Puffer. </li></ol> 2. Grob Dissektion der Larven <ol><li> Während die Larve noch im großen Pool von Dissektion Puffer umklammern die Larve mit der Zange. Eine Pinzette sollte verwendet werden, um die Mundhaken greifen werden, während das andere Paar der Pinzette wird die anim haltenal noch (greifen die Larve sanft 03.01 Körperlänge). </li><li> Hold Steady die Zange, die die Oberhaut in der Nähe der Mundhaken, während schnell Ziehen der Rest des Körpers weg mit dem zweiten Paar der Pinzette. </li><li> Wenn die Larve beginnt zu zerreißen Sie eine leichte Freisetzung in Spannung zu spüren. Lassen Sie die Larve aus der Zange und damit für die &quot;Innereien&quot; der Larve zu verschütten. Dies ermöglicht die Imaginalscheiben in ihre normale Konformation bleiben und verhindert, dass sie verformt wird. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Mundhaken wieder auf das vordere Ende der Larve in Position zu halten. Mit der anderen Pinzette entfernen Sie die unteren zwei Drittel der Larven einschließlich der inneren Mut. Hinweis: ein Komplex der Mundhaken, die Augenantennenscheiben, Gehirnhälften, ventralen Ganglion, die Speicheldrüsen, einige Discs mit Bein, und die darüber liegende Oberhaut wird bleiben. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen darüberliegenden Oberhaut, der Speicheldrüsen, Beinscheiben undandere Gewebe. Hinweis: nur Gewebe, die bleiben, ist die Mundhaken, Augenantennenscheiben, Gehirnhälften sollte, und ventralen Ganglion (Abbildung 3). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit zusätzlichen Larven für 15-20 min. Hinweis: Imaginalscheiben in Präparation Puffer für längere Zeit bleiben neigen zum Abbau und letztendlich als weniger ideal Proben fotografiert werden angezeigt. So, nach maximal 20 min alle seziert Gewebe sollte der PLP Fixiermittel übertragen werden (siehe unten). </li></ol> 3. Fixierung und Färbung von Gewebe mit Antikörper <ol><li> Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe auf ein Uhrglas mit kaltem Paraformaldehyd-Lysin-Periodatoxidation (PLP) Fixiermittel. Limit Volumen der übertragenen Dissektion Puffer zu 50 ul der Verdünnung von PLP zu minimieren. Achten Sie darauf, die Spitze mit einer Rasierklinge geschnitten, so dass die Spitze Öffnung groß genug, um die Gewebe seziert aufzunehmen. Verwendung einer Pinzette odereine Wolfram-Nadel sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe völlig in Ordnung für die richtige Fixierung auftreten getaucht. Inkubieren seziert Gewebe in kaltem PLP Fixiermittel für 45 min. Diese Inkubation Ort bei RT ohne Rühren erfolgen. </li><li> Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe Puffer waschen (RT) mit einem anderen geschnitten gelben Spitze für 45 min. Grenze Volumen übertragen PLP zu 50 ul der Verdünnung des Waschpuffers zu minimieren. Hinweis: Alle seziert Gewebe sollte vollständig eingetaucht werden. </li><li> Übertragen 20-30 Sätze von seziert Gewebe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn eine größere Anzahl von Blickantennenscheibe Komplexe werden im Rohr kombiniert werden, gibt es eine Möglichkeit, dass das Gewebe an der Unterseite des Rohres nicht richtig an die Antikörper ausgesetzt werden. Für optimale Ergebnisse sollte nicht mehr als 20-30 Augenantennenscheibe Komplexe in einem einzigen Rohr vorhanden sein. Die sezierten Gewebe werden auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Daher wird in den nachfolgenden Schritten uSE Pipetman zu entfernen und zu ersetzen Waschpuffer, Blocklösung und Antikörper. </li><li> Waschpuffer zu entfernen und ersetzen mit 100 l Blocking-Lösung: 10% normalem Ziegenserum in Waschpuffer. Inkubation bei RT unter leichtem Drehen auf einer Tischdreheinrichtung für 10 min. </li><li> Blockierlösung entfernen und ersetzen mit 100 ul primären Antikörper, die entsprechend in 10% normalem Ziegenserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 16 Stunden. </li><li> Primären Antikörper zu entfernen und ersetzen mit 750 ul Waschpuffer. Die Röhrchen auf einem Kolbenpendel und lassen bei RT für 10 min nutieren. Hinweis: Der primäre Antikörper kann (Lagerung bei 4 ° C) gespeichert und später wiederverwendet werden. Wiederverwendung von Antikörpern mehrere Male bei der Verringerung der nicht-spezifischen Bindung zu helfen. </li><li> Ermöglichen, sich an die Unterseite des Rohres absetzen, dann entfernen Waschpuffer und 100 l Sekundärantikörper, die entsprechend in 10% Normalserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 2̵1, 4 Stunden. </li><li> Entfernen Sekundärantikörperlösungen aus Gewebe und ersetzen mit 500 ul Waschpuffer. Gewebe ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. </li><li> Mit Hilfe eines P-200 und einen Schnitt gelber Spitze, übertragen alle Gewebe seziert, um einen Pool von Waschpuffer, die auf dem Seziertisch Schale gelegt wurde. Während mit dem nächsten Schritt der Fein Dissektion fortfahren, wird das Gewebe in der Waschpuffer inkubiert. Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. </li></ol> 4. Fein Dissektion der Eye-Antennallobus Disc-Komplexe und Montage auf Folien <ol><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nagelhaut von den Mundhaken mit der Bauchseite des Komplexes nach unten falten. Mit einer zweiten Pinzette entfernen Sie die beiden Hirnlappen durch Schließen der zweiten Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und Auge-Discs (Bild 3, roter Pfeil) und schnell zieht das Gehirn weg von den Mundhaken. </li><li> Während Sie auf die Mundhaken halten, kneifen Siedas Gewebe so nahe wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil des Blickantennenscheibe und den Mund Haken (3, blauer Pfeil). Hinweis: Die Augenantennenscheibe Komplexe sollte frei von allen Geweben (Abbildung 1A) sein. Fortfahren, bis alle gewünschten gewünschte Gewebe, die auf Objektträger platziert werden können wurde seziert. Dieses Protokoll kann angepasst an Flügel, Haltere, Bein-und Genital Imaginalscheiben (Abbildung 1B-E) zu isolieren. </li><li> Fügen Sie zwei kleine Stücke von Tissue-Papier (Größe der Deckgläser) in ca. 3. Auseinander auf dem Seziertisch Gericht. Ein Glasobjektträger, auf dem Teller - die zwei Stücke von Tissue-Papier soll unter den Enden des Schiebers sein. Dies wird die Folie vom Kleben an der Silikonbasis der Seziersaal Gericht zu verhindern. </li><li> Verwendung eines P-20 mit einem ungeschnittenen Spitze hinzuzufügen 9 ul eines Anti-Bleichmittels zu der Mitte der Glasobjektträger. Dies verhindert, dass Bleichen der Gewebe, wenn mit fluoreszierenden angesehenLicht. </li><li> Mit der gleichen uncut Spitze, sammeln alle Augenantennenscheiben und fügen Sie sie der Tropfen Anti-Bleichmittel. Minimieren Sie die Anzahl der Waschpuffer, die über durchgeführt wird. Versuchen, die Menge an Waschpuffer auf 10 ul oder weniger zu begrenzen. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette zu trennen und verteilen Sie die Augenantennenscheiben innerhalb des Tropfens von Anti-Bleichmittel. Lassen Sie Discs in der Anti-Bleichmittel für einige Minuten inkubiert. Hinweis: Scheiben wird sich klar, wie das Gewebe absorbiert die Anti-Bleichmittel. </li><li> Mit einem feinen Pinsel vorsichtig senken einen Deckglas auf die Probe. Dies verhindert die Bildung von Luftblasen. </li><li> Objektträger bei -20 ° C bis bereit, die Auge-anten oder andere Imaginalscheiben mit Hilfe von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf die Isolierung und nachfolgende Behandlung von Augenantennenscheiben konzentriert, ist es zugänglich ist zur Isolierung und Analyse des Flügels Haltere, Bein-und Genitalscheiben (4). Die einzige erforderliche Änderung des Protokolls zur Isolierung dieser Scheiben (im Gegensatz zum Auge-Antennenscheibe) ist die Methode der Grob Dissektion (Abschnitt 2 des Protokolls). Die ersten Brustbein (T1) Paar wird an der vorderen der Larve gefunden und kann durch das Protoko...

Seit mehr als einem Jahrhundert die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist einer der führenden System-Entwicklung, Verhalten und Physiologie zu studieren. Embryonalen und post-embryonale mit viel der letzteren stattfindet in Mono Epithelien genannt Imaginalscheiben 1-3: Entwicklung in der Fliege können in zwei große Phasen unterteilt werden. Zeichnungen von Imaginalscheiben wurden erstmals im Jahre 1864 von August Weismann als Teil seines breiten Monographie über Insektenentwicklung 1 veröffentlicht. Diese Scheiben ihrer Entwicklung beginnen während der Embryogenese, werden während der Larvenstadien gemustert, überleben die massiven Histolyse der frühen Puppenstadien und schließlich führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in der Erwachsenen gefunden werden fliegen 1-14. Während Larvenentwicklung jede Scheibe macht mehrere kritische Entscheidungen in Bezug auf das Schicksal, Form und Größe. Innerhalb der ersten und zweiten Larvenstadien werden die Discs mit der Annahme einer primären Schicksal beauftragt, establisHing Fach Grenzen, die Annahme der richtigen Form und die Erzeugung der erforderlichen Anzahl von Zellen 15-16. Während des dritten Larvenstadium und frühen Pre-Puppenstadium, die Imaginalscheiben weiter teilen und strukturiert, wie Zellen ihre Schicksale Terminal 16 erlassen. Während der frühen Geschichte der Drosophila Entwicklungsbiologie, wurden fast ausschließlich Imaginalscheiben im Rahmen der normalen Entwicklung und in den wenigen Fällen, in denen ein Verlust oder Gewinn-of-function-Mutante lebensfähig war sucht. Die Verwendung von Röntgenstrahlen zu veran mitotische Rekombination zur letalen Mutationen erlaubt, in Zellklone in den Larven und erwachsenen Geweben analysiert werden. Dieses Verfahren wurde durch die Einführung von transgenen Verfahren verbessert worden, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function Mutationen sowohl Larven und adulten Geweben. Die Anzahl der Antikörper, Transkriptions Reporter und Protein-Traps für die Beschreibung der molekularen Landschaft von Wildtyp und Mutante Gewebe ist auch constantly wächst. Mit Hilfe dieser molekularen Marker, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function-Mutante Zellklone hat es immer möglich, eine Echtzeit-Verständnis, wie mutierten Zellen während der Entwicklung von ihren Wildtyp abweichen Vettern zu gewinnen. Um richtig nutzen diese Werkzeuge und Reagenzien ist es wichtig, qualitativ hochwertige Präparate von Imaginalscheiben, die angezeigt werden können, fotografiert und analysiert haben. Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Herstellung der augenAntennenScheibe Komplex (Figur 1A) zu liefern. Es kann auch erfolgreich verwendet, um eine Vielzahl von zusätzlichen Scheiben einschließlich derjenigen, die zu den Flügeln halteres, T1-T3 Beine und die Genitalien (1B-E) erhalten wird, zu isolieren. Dieses Verfahren, mit geringfügigen Modifikationen, wurde verwendet, um Imaginalscheiben von Drosophila für fast 80 Jahre zu isolieren. Wie oben beschrieben, da die meisten Gene während mu exprimiertltiple Entwicklungsstufen und in einer Vielzahl von Geweben, ist es oft nicht möglich, die Effekte zu untersuchen, dass Null-Mutanten wurden auf der gesamten Augen das Tier stirbt, und vor dem dritten Larvenstadium Larvenstadium. Vier Methoden wurden die Untersuchung weiter entwickelten Geweben wie der Retina wesentlich leichter handhabbar gemacht. Die erste ist die Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) Verfahren zur Erzeugung von Mutanten-Zellklone in einem ansonsten Wildtyp-Gewebe 17-19. In diesem Fall wird das mutierte Gewebe wird durch das Fehlen einer visuellen Markierung, wie Green Fluorescent Protein (GFP) identifiziert und an die umliegenden Wildtyp-Gewebe, in dem GFP vorhanden ist (2D) verglichen werden. Das zweite ist das &quot;FLP-out&quot;-Methode, in der ein Transgen in einer Population von Zellen 20 ausgedrückt. In diesem Fall sind die Zellklone werden durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und auf die umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Reporter fehlt (Abbildung Vergleich2E). Die dritte ist die Mosaik-Analyse mit einem Reprimierbare Zellmarker (MARCM)-Technik, die Elemente des FLP / FRT-Mutante Klon und FLP-out-Expressionssysteme 21 verbindet. Mit diesem Verfahren wird ein Transgen in einer Population von Zellen, die gleichzeitig für einen einzelnen mutierten genetischen Locus exprimiert werden. Wie FLP-out-Klone sind Klone MARCM durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und im Vergleich zu den umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Markierung (2F) fehlt. Und schließlich können die Gene und RNAi-Konstrukten in imaginal Gewebe unter der Kontrolle spezifischer Promotor GAL4-Konstrukten exprimiert werden. Diese vier Methoden haben das Interesse an einem Studium Imaginalscheiben seit Mutante oder Überexpression Klone oder Muster können direkt miteinander verglichen werden, um benachbarte Wildtyp-Gewebe erhöht. Die in diesem Verfahren beschriebenen Methode wurde so entwickelt, dass Forscher, die die post-embryonale Entwicklung von adulten Geweben in Drosophila zu untersuchen,insbesondere aus dem Blickantennenscheibe stammen, werden in der Lage, qualitativ hochwertige Gewebe für die Analyse zu erhalten. Obwohl einzelne Forscher haben leichte Modifikationen vorgenommen, hat der Kern dieses Verfahrens (die wir hier beschreiben) weitgehend unverändert geblieben. Seit Erlangung hochwertigen Gewebe ist entscheidend, um das Studium der Imaginalscheiben wir hoffen, dass dieses Protokoll geschrieben und dazugehörige Video wird als wertvolles Lehrmittel dienen.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 KG</td><td>Wird verwendet, um eine Basis für die Sezierplatte zu erstellen</td></tr><tr><td>Pryex Glas Petrischale 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Verwenden Sie die Abdeckung für die Sezierplatte</td></tr><tr><td>#5 Präparierzange</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Pinzette muss sehr scharf gehalten werden</td></tr><tr><td>9 gut Uhrenglas</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Wird zur Fixierung von imaginalen Scheibenkomplexen</td></tr><tr><td>verwendet 50 ml Erlenmeyerkolben</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Rührstab</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>Klein genug, um in den Erlenmeyerkolben zu passen</td></tr><tr><td>50 ml Konische Röhrchen</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td> Je <td>nach Anwendung Klar oder dunkel</td></tr><tr><td>Mikrofuge-Gestell</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tischrotator</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>100 &#956; l Volumen sollte bei niedriger Einstellung nicht spritzen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Dient als Fixiermittel</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Wird zur Herstellung von Dissektions- und Waschpuffern verwendet</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Wird zur Herstellung von Dissektions- und Waschpuffern</td></tr><tr><td>verwendet Lysin</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Wird in der Fixierlösung</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Verwendet in der Fixierlösung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Wird verwendet, um Imaginalscheiben zu perforieren</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Wird verwendet, um Paraformaldehyd aufzulösen</td></tr><tr><td>100% normales Ziegenserum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Dient als Blockierungslösung</td></tr><tr><td>Primäre Antikörper</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>Verdünnen in 10 % Ziegenserum nach Anweisung des Herstellers</td></tr><tr><td>Sekundäre Antikörper</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>Verdünnen in 10 % Ziegenserum nach Anweisung des Herstellers</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molekulare Sonden</td><td>H-1000</td><td>Verhindert das Ausbleichen von Proben</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>Verhindert das Anhaften von Objektträgern an der Silikonbasis</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Verschiedene Anbieter</td><td></td><td>Zum sanften Absenken des Deckglases auf Proben</td></tr></tbody></table>

präparation und immunfärbung von imaginalscheiben aus drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Ein wesentlicher Teil der Post-embryonalen Entwicklung in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, findet innerhalb einer Reihe von sackartigen Strukturen genannt Imaginalscheiben. Diese Scheiben führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in die erwachsene Fliege zu finden sind. Hier haben wir ein Protokoll, das so optimiert wurde, um diese Scheiben zu erholen und bereiten sie für die Analyse mit Antikörpern, Transkriptions Reporter und Protein-Traps zu beschreiben. Dieses Verfahren ist am besten für dünne Gewebe wie Imaginalscheiben geeignet, kann aber leicht für die Verwendung mit dicker Gewebe modifiziert werden, wie die Larven und erwachsene Gehirn Eierstock. Die schriftliche Protokoll und begleitende Video den Leser / Betrachter durch die Zerlegung des dritten Larvenstadium, Fixierung von Gewebe, und die Behandlung von Imaginalscheiben mit Antikörpern führen. Das Protokoll kann verwendet werden, um Imaginalscheiben von jüngeren ersten und zweiten Larvenstadium sowie sezieren werden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, daß sie relativ kurz ist, und es hat seinen für die hohe Qualität Erhaltung der sezierten Gewebe optimiert. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fixierung Verfahren, das eingesetzt wird, funktioniert gut mit der überwiegenden Anzahl von Antikörpern, die Drosophila-Proteine ​​zu erkennen. Nach unserer Erfahrung gibt es eine sehr kleine Anzahl von empfindlichen Antikörper, die nicht gut mit diesem Verfahren arbeiten. In diesen Situationen wird das Heilmittel zu sein, um eine alternative Fixierung Cocktail nutzen und dabei die Richtlinien, die wir weiter für die Dissektion Schritte und Antikörperinkubationen haben zu folgen.

Die Methode, die oben beschrieben ist zuverlässig produziert hochwertige Material für die Analyse mit In-situ-Sonden, Transkriptions Reportern, Protein-Traps und Antikörper. In Abbildung 1 zeigen wir Augen Antenne, genital, Flügel, Haltere und Beinscheiben, die routinemäßig mit diesem Verfahren gewonnen werden. Diese Scheiben sind mit einer Phalloidin-konjugierten Fluorophor, die F-Aktin bindet und daher beschreibt jede Zelle behandelt. Wenn das Gewebe richtig dann die morphogenetischen Furche ...

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, imaginale Scheiben von Drosophila-Larven zu sezieren. Für die Immunhistochemie wird dies erreicht, indem zunächst der Kopfkomplex, bestehend aus Mund, Haken, Auge- und Tenalscheiben, und Gehirn aus den Larven entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Kopfkomplex zu fixieren und mit primären und sekundären Antikörpern zu inkubieren. Als nächstes werden die Augen- und Tenalscheiben vom Kopfkomplex getrennt.Der letzte Schritt besteht darin, die imaginären Scheiben in Antibleichmittel auf einen Objektträger zu montieren. Letztendlich können fluoreszierende oder LAC Z-Reporter und Antikörperfärbungen mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie die räumliche und zeitliche Expression von Genen und Proteinen innerhalb des Imaginalgewebes aufdecken. Diese Technik kann jedoch verwendet werden, um Einblicke in die Gen- und Proteinlokalisation in der enten imaginalen Scheibe zu erhalten.Es kann auch auf andere imaginale Gewebe wie das Flügelbein und den Halt aufgetragen werden. Hier. Um das Experiment zu beginnen, füllen Sie eine 35-Millimeter-Petrischale mit Dissektionspuffer. Legen Sie 10 bis 20 Larven in die Petrischale und lassen Sie sie fünf Minuten lang herumschwimmen.Um sich selbst mit einem Schädling zu reinigen, legen Sie mit Ihrer Pipette einen großen Pool aus Dissektionspuffer in der Mitte einer Dissektionsplatte auf Silikonbasis an. Platzieren Sie drei kleinere Becken um das große Becken herum und bringen Sie die Larven mit einer Pinzette in das untere Becken. Übertragen Sie dann mit der Pinzette Nummer fünf eine einzelne gereinigte Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool mit dem Dissektionspuffer.Um mit der groben Dissektion zu beginnen, greifen Sie mit einer Pinzette nach den Mundhaken und mit der anderen Pinzette vorsichtig nach den Larven. Bei einem Drittel seiner Körperlänge hält er den Maulhaken fest. Ziehe den Rest des Körpers schnell mit einer zweiten Pinzette weg.Lösen Sie die Larve von der Pinzette und lassen Sie die Eingeweide herauslaufen, so dass die imaginären Scheiben in ihrer normalen Bestätigung bleiben können. Fassen Sie dann die Mundhaken und entfernen Sie mit der anderen Pinzette die unteren zwei Drittel der Larven, einschließlich der inneren Eingeweide. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Speicheldrüsen, Beinscheiben und anderes Gewebe.Das einzige Gewebe, das verbleiben sollte, ist eine kleine Menge der darüber liegenden Nagelhaut. Die Mundhaken, die Augen- und Tenalscheiben, die Gehirnhälften und das Ventralganglion. Nach maximal 20 Minuten übertragen Sie alle präparierten Gewebe auf den paraformen Aldehyd-Lysin-Pariah.Dattelfixativ oder PLP. Lassen Sie imaginale Discs nicht länger als 20 Minuten im Dissektionspuffer verbleiben, da sie sonst nach der Dissektion abgebaut werden. Übertragen Sie das präparierte Gewebe in Schritten von 100 Mikrolitern auf ein Uhrenglas, das kaltes PLP enthält.Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das präparierte Gewebe vollständig untergetaucht ist. Inkubieren Sie das präparierte Gewebe 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in kaltem PLP-Fixiermittel ohne Rühren. Übertragen Sie als Nächstes 100 Mikroliter präpariertes Gewebe von PLP in den Waschpuffer.Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist, und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur ohne Rühren. Übertragen Sie dann das präparierte Gewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen. Entfernen Sie den Waschpuffer und ersetzen Sie ihn durch 100 Mikroliter Blocklösung.Inkubieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung auf einem Tischrotator für 10 Minuten. Entfernen Sie nach dem Blockieren die Lösung und ersetzen Sie sie durch 100 Mikroliter Primärantikörperlösung in 10%igem Normalziegenserum. Inkubieren Sie das Gewebe je nach Stärke des Antikörpers 16 Stunden lang bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation.Entfernen Sie anschließend den primären Antikörper und ersetzen Sie ihn durch 750 Mikroliter Waschpuffer. Legen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Mutator. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Mutator und lassen Sie die Köpfe am Boden des Röhrchens absetzen.Entfernen Sie dann den Waschpuffer und fügen Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörperlösung in 10%Normal Serum hinzu. Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur mit sanfter Rotation für mindestens zwei Stunden, abhängig von der Stärke des Antikörpers. Entfernen Sie nach der Inkubation die sekundäre Antikörperlösung aus dem Gewebe.Ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter Waschpuffer und lassen Sie das Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen. Legen Sie drei Pools Waschpuffer auf eine Silikon-Präparierplatte. Übertragen Sie alle präparierten Gewebe in den großen Pool mit Waschpuffer, der auf die Präparierschale gelegt wurde.Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen, um mit der Feindissektion zu beginnen, den Kopfkomplex mit der Bauchseite nach unten zu platzieren und die Nagelhaut an den Mundhaken zu umschließen. Platzieren Sie eine zweite Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und den Augenscheiben und ziehen Sie das Gehirn schnell von den Mundhaken weg, um die beiden Hirnlappen zu entfernen, während Sie sich weiterhin an den Mundhaken festhalten. Kneifen Sie das Gewebe so nah wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil der Augenantennenscheibe und dem Mundhaken ab.Fahren Sie fort, bis das gewünschte Gewebe präpariert wurde. Legen Sie als Nächstes zwei kleine Stücke Seidenpapier in der Größe von Deckgläsern im Abstand von drei Zentimetern auf die Sezierschale. Legen Sie einen Objektträger aus Glas auf diese Papierstücke, um zu verhindern, dass der Objektträger an der Silikonbasis der Sezierschale kleben bleibt.Mit einer P 20 Pipette für Männer neun Mikroliter Antibleichmittel in die Mitte des Glasobjektträgers geben, um ein Ausbleichen des Gewebes durch Fluoreszenzlicht mit derselben ungeschnittenen Spitze zu verhindern, alle I- und Tenalscheiben sammeln und zum Tropfen des Anti-Bleaching-Reagenzes geben. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Augen- und Tenalscheiben in dem Tropfen des Anti-Bleaching-Reagenzes zu trennen und zu verteilen, bis sich keine imaginären Scheiben mehr berühren. Senken Sie mit einem feinen Pinsel einen Deckslip vorsichtig auf den Tropfen des Antibleichmittels, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.Lagern Sie die Objektträger schließlich bei minus 20 Grad Celsius, bis sie bereit sind, die Ionen-Tenalscheiben mit Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie zu betrachten und abzubilden. Diese Methode erzeugt zuverlässig qualitativ hochwertiges Material für die Analyse, wie es durch diese konfokalen Bilder von imaginalen Scheiben vermittelt wird. Die Scheiben wurden mit einem Foid und konjugiertem Fluor-Four behandelt, das an F-Aktin bindet und somit jede Zelle umreißt.Eines der auffälligsten Merkmale der Entalscheibe ist die morphogenetische Furche, die als Vertiefung im Gewebe zu sehen ist, die entlang der dorsalen ventralen Achse verläuft. Während die Furche über das Augenfeld fortschreitet, verwandelt sich das Meer ungeordneter Zellen in eine geordnete Anordnung von periodisch verteilten Einheitsaugen oder Oma Tedia. Die Verifizierung der klonalen Expression und die Analyse der I-Imaginalscheibe sind mögliche nachgelagerte Anwendungen dieser Methode.Die oberen drei Panels zeigen Scheiben, die mit verschiedenen Antikörpern wie ilis, A DPP, LAC Z Transkriptionsreporter und zellspezifischen Markern wie embryonal, letal, abnormalem Sehen oder vy gefärbt wurden, das für ein panneuronales, RNA-bindendes Protein kodiert. Die unteren drei Felder zeigen Scheiben, in denen GFP zur Markierung von Zellpopulationen verwendet wird. Sobald der Kurs gemeistert ist, dauert die Isolierung von Kopfkomplexen von 10 bis 20 Larven etwa 10 Minuten, und zusätzlich wird die Feinisolierung der Ionen-Tenallscheibe von diesen Komplexen ebenfalls etwa 10 Minuten dauern.

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt die Dissektionstechnik zur Isolierung Imaginalscheiben von Drosophila-Larven im 3. Larvenstadium Stufe eingesetzt. Verfahren zur Festsetzung des Gewebes nach Worten und dem Entfernen der Flügel-, Bein-und Augen-Scheiben werden direkt auf einem Objektträger für spätere Visualisierung unter Beweis gestellt.

Dissection der Imaginalscheiben vom 3. Instar Drosophila-Larven

Wir beschreiben ein neuartiges rot fluoreszierendes Protein (RFP) Reporter, der speziell in den...

A Novel RFP Reporter in der Visualisierung des Eye Imaginalscheibe in Aid Drosophila</em

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

Bei der Färbung von Drosophila-Imaginalscheiben wird oft eine grobe Dissektion durchgeführt, bei der die Scheiben freigelegt werden, aber am Körper haften. Nach dem Färben werden die interessierenden Discs isoliert und montiert. Das Beispielprotokoll demonstriert ein Verfahren zum Disparieren und Montieren von Flügel-Imaginalscheiben.

Drosophila Dissektion der Imaginalscheibe der Larva: Eine Methode zur Beobachtung der Entwicklung von Epithelien

Das Ziel dieser Technik ist es, Forschern die Möglichkeit zu geben, Puppenaugenscheiben jeden Alters zu dissektionieren, Immunfärbung  und Montage von Puppenaugenscheiben durchzuführen.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung von Kontakten zwischen Zellen in benachbarten Epithelschichten in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben unter Verwendung eines GFP-rekonstitutionsbasierten Ansatzes.

Ein GFP-komplementäres Dual-Expressionssystem zur Beurteilung des durch Cytoneme vermittelten Zell-Zell-Kontakts in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben

Dieser Artikel beschreibt ein effizientes Protokoll zur dissektion der imaginären Bandscheiben und zur Färbung von Antikörpern, das mit Reagenzien sparsam ist und den Umgang mit imaginären Bandscheiben in kleinen Mengen erleichtert.

Kleinskalige Dissektion und Antikörperfärbung der Augen-, Antennen- und Flügel-Imaginalscheiben von Drosophila melanogaster

Lernen Sie die Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Gen- und Proteinexpression in vivo.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

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