Ein GFP-komplementäres Dual-Expressionssystem zur Beurteilung des durch Cytoneme vermittelten Zell-Zell-Kontakts in lebenden Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben

Unsere Forschung konzentriert sich daher darauf, zu verstehen, wie weit entfernte Zellen in Geweben miteinander kommunizieren. Wir verwenden die Imaginalscheibe des Drosophila-Flügels als Modellsystem, um zu verstehen, wie Cytidine gebildet werden, wie sie funktionieren und welche Rolle sie bei der lokalen Kontrolle des Gewebewachstums spielen. Studien deuten darauf hin, dass Wachstumsfaktoren oft durch spezialisierte zelluläre Projektionen wie Aktin-basierte Signalfilopodien, sogenannte Zytoneme, wandern, um zu den Zielzellen transportiert zu werden.

Cytoneme sind sehr dünne und zerbrechliche Strukturen, die durch das Fixierungsprotokoll leicht gestört werden können. Um sie zu beobachten, müssen Sie spezielle Live-Imaging-Ansätze mit exprimierten fluoreszenzmarkierten Proteinen verwenden. Dies schränkt das Werkzeug und die Ansätze, die wir verwenden können, um sie zu untersuchen, stark ein.

Wir haben eine Proteinkinase namens Slik identifiziert, die an der Biogenese von Zytonemen beteiligt ist. Die Expression von Slik in einer Epiduralschicht in der Flügel-Imaginalscheibe löst die Bildung von Zytonemen aus, das das Scheibenlumen durchquert hat, und stimuliert die Proliferation von Zellen in der benachbarten Epithelschicht. In Zukunft möchten wir das Protein identifizieren, das stromabwärts von Slik wirkt, um die Zytonembildung zu fördern, den Liganden identifizieren, der über dieses Zytonem abgegeben wird, um die Perforation zu fördern, und die physiologische Bedeutung dieses Mechanismus bei der Kontrolle des Gewebewachstums besser verstehen.

Schneiden Sie zunächst einzelne Vertiefungen mit einer Schere aus dem Acht-Well-Streifen ab und schneiden Sie dann jede Vertiefung in zwei Hälften. Entfernen Sie die Schutzrückseite von einer Seite jeder Hälfte und kleben Sie die Abstandshalter mit leichtem Abstand auf den Objektträger, um einen geschützten zentralen Raum für die Platzierung der Scheibe zu schaffen. Entnehmen Sie wandernde Larven des dritten Stadiums aus dem Aufzuchtrohr nach genetischer Kreuzung und Inkubation bei 25 Grad Celsius.

Unter einem Präpariermikroskop werden die Larven in einen Tropfen Live-Imaging-Medium auf einer silikonbeschichteten Petrischale überführt. Beginnen Sie mit der Dissektion mit zwei Präparierzangen, indem Sie die Larven in etwa 1/3 Körperlänge von der Vorderseite entfernt mit einer Pinzette einklemmen, um sie ruhig zu halten. Mit dem zweiten Paar kneifen Sie den Körper knapp hinter dem ersten Punkt zusammen und ziehen Sie, um die hintere Hälfte zu trennen und den vorderen Abschnitt zu isolieren.

Drehen Sie die vordere Hälfte um, indem Sie beide Seiten des abgeschnittenen Endes mit einer Pinzette greifen und den Kopf mit einem zweiten Paar durchschieben und auf links drehen. Dadurch werden innere Strukturen wie Imaginalscheiben, Luftröhre, Speicheldrüsen, Fettkörper und Darm freigelegt. Entfernen Sie die Speicheldrüsen, den Fettkörper und den Darm mit einer Pinzette und achten Sie darauf, die seitlichen Trachealstämme, die über den Flügelscheiben liegen, nicht zu stören.

Übertragen Sie die gereinigten vorderen Hälften mit den daran befestigten Flügelscheiben mit einer Pinzette in einen Tropfen sauberes Live-Imaging-Medium mit Haken, die zwischen den Objektträgerabstandshaltern platziert sind. Um die Flügelscheiben zu isolieren, trennen Sie sie vorsichtig mit einer Klinge der Präparierzange oder einem feinen Wolframdraht, der auf einem Präpariernadelhalter montiert ist, von den feinen Trachealästen. Den restlichen Schlachtkörper entsorgen.

Richten Sie die Flügelscheiben mit einer Präparierzange, einer Klinge oder einer Wolframnadel so aus, dass die Seite der Peripodialmembran nach oben zeigt. Stellen Sie das mittlere Volumen so ein, dass es die Vertiefung oberhalb des Abstandshalters leicht überfüllt. Entfernen Sie die obere Schutzrückseite vom Abstandshalter für die Bildgebung und senken Sie vorsichtig einen Deckschirm über die Probe.

Drücken Sie den Deckglas mit dem abgerundeten Ende der Pinzette an die Kontaktpunkte des Abstandshalters, um eine gute Haftung zu gewährleisten. Um die Bildstapel in ImageJ zu projizieren, wählen Sie Bild, dann Stapel, gefolgt von Z-Projekt und wählen Sie im Menü die Option Maximale Intensität. Identifizieren Sie in den Projektionsbildern mit maximaler Intensität den Bereich der Flügeltasche anhand des Faltmusters der Flügelscheibe mithilfe des Hakenkanals und des Polygonauswahlwerkzeugs.

Wenden Sie dieselbe Auswahl auf den GFP-Kanal an und wählen Sie "Bearbeiten" gefolgt von "Außen löschen", um Rauschen außerhalb des ausgewählten Bereichs zu eliminieren. Verwenden Sie den Hakenkanal in den Projektionsbildern mit maximaler Intensität, um die künstlichen Flecken in den GFP-Bildern zu identifizieren. Wählen Sie dann den Bereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug aus.

Klicken Sie auf Bearbeiten und wählen Sie Löschen. Wählen Sie in den bereinigten Projektionsbildern mit maximaler Intensität die Option Analysieren aus, gefolgt von Histogramm, und wählen Sie Liste aus, um alle Pixelwerte abzurufen. Kopieren Sie diese Liste in eine Tabellentabelle.

Um einen Schwellenwert festzulegen, analysieren Sie das Hintergrundsignal in den negativen Kontrollproben und bestätigen Sie diesen Wert mit anderen Beispielbildern. Berechnen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Oberfläche, indem Sie die Anzahl der Pixel über dem Schwellenwert durch die Gesamtzahl der gültigen Pixel dividieren und das Ergebnis mit 100 multiplizieren. Normalisieren Sie abschließend jeden berechneten Wert, nachdem Sie ihn durch den Mittelwert der Referenzbedingung dividiert haben, die auf eins gesetzt ist.

In Wildtyp-Scheiben, denen beide gespaltenen GFP-Komponenten fehlten, wurde nur eine minimale granulare GFP-Autofluoreszenz in der Nähe des Zentrums der Flügeltasche beobachtet, und dieses Basissignal wurde verwendet, um eine Fluoreszenzschwelle zu definieren. Scheiben, die nur CD4-gespaltenes GFP1-10 in der eigentlichen Schicht der Scheibe exprimierten, zeigten Fluoreszenzwerte, die nicht von Wildtyp zu unterscheiden waren, was die nicht-fluoreszierende Natur von GFP1-10 allein bestätigt. Die Co-Expression von CD4-gespaltenem GFP1-10 in der eigentlichen Bandscheibe und CD4spGFP11 in der peripodialen Membran führte zu einer deutlichen Zunahme diskreter, heller GFP-Flecken, die im Scheibenlumen lokalisiert waren, mit einem signifikant größeren fluoreszenzpositiven Bereich oberhalb des Schwellenwerts als bei Kontrollen.

Die Slik-Expression in der eigentlichen Scheibe verursachte einen starken Anstieg der Dichte der peripodialen Membrankerne und einen dramatischen Anstieg der GFP-Signalintensität im gesamten Bereich der Flügeltasche, was darauf hindeutet, dass die durch Slik induzierten Zytoneme einen verstärkten Kontakt mit peripodialen Membranzellen herstellen.