Name: Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Erfahren Sie, wie alternative Splicing-Veränderungen während der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) in menschlichen Brustepithelzellen mittels induzierbarem EMT-Modell und quantitativer RT-PCR nachgewiesen werden.

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Die Autoren möchten Wensheng Liu für seine unschätzbare Hilfe bei der Zellbildgebung danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health (R01 CA182467), der American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), der Lynn Sage Foundation und der A Sister's Hope Foundation unterstützt.

1. Zellkultur von EMT Induktions Hinweis: EMT kann durch die Behandlung von TGFß oder ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren Twist, Schnecke, oder ZEB1 / 2 in Epithelzellen induziert werden. In diesem Protokoll beschrieben ist eine induzierbare EMT-System über die Expression des Twist-ER-Fusionsprotein in verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HMLE / Twist-ER, ein Geschenk von Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Auf 4-Hydroxytamoxifen (TAM) Behandlung transloziert das Fusionsprotein Twist-ER in den Kern, um die Transkription und führt zu einer vollständigen EMT Übergang in 12-14 Tagen 9,11,29 fahren. Zusätzliche EMT induzierbare Systeme, wie HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß und MCF10A / TGFß, finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen 11,30 gefunden werden. <ol><li> Aufrechterhaltung HMLE / Twist-ER Zellen in serumfreiem Brustepithelzellen Zellwachstumsmedium (MEGM) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Durchgang die Zellen alle 2-3 Tage, wenn sie 80% Konfluenz erreichen. Zellen mit 0,15% Trypsin bei 37 ° C für 5-10 min, und anschließend mit Trypsin zu inaktivieren, 5% Kälberserum / DMEM. Spin-down-Zellen und resuspendieren sie in MEGM. Plattenzellen in einer neuen Gewebekulturschale in einem Verhältnis von 1 bis 4 ist. </li><li> TAM in Ethanol auflösen, um eine 200 uM Lösung. TAM schützen vor Licht und bei -20 ° C. Vor Gebrauch frisch TAM in MEGM Medien Hinzufügen bei einer 1: 10.000 Verdünnung auf eine Endkonzentration von 20 nM TAM machen. </li><li> Für die Induktion der EMT, Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in zweifacher Ausfertigung. Kulturzellen mit 20 nM TAM haltigen MEGM Medien. </li><li> Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung und Behandlung Zellen mit 0,01% Ethanol als nicht-TAM-behandelten Kontroll. </li><li> Zwei Tage nach der Inkubation, machen Sie Fotos unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung zu morphologischen Veränderungen der Zellen zu erfassen. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einem Gericht der Kontrolle oder TAM-behandeltZellen. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und Ernte von Zellen Verschrottung Hälfte der Platte in der RNA-Lyse-Puffer für RNA-Isolierung und die andere Hälfte in RIPA-Puffer für die Proteinanalyse. </li><li> Passage-Zellen aus der Steuerung oder TAM-behandelten Gerichten, die von Re-Plattierung 1,6 x 10 6 Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung. Kontinuierlich behandeln die Zellen mit 20 nM TAM oder Fahrzeug. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 einmal jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu welcher Zeit, TAM-behandelten Twist-ER-Zellen zeigen eine spindelförmige Morphologie mesenchymalen, während Vehikel-behandelten Kontrollzellen pflegen die Kopfsteinpflaster-wie epitheliale Morphologie. </li></ol> 2. Charakterisierung EMT Hinweis: Ein Abschluss der EMT wird angezeigt durch: (1) Handy morphologische Veränderungen von einem pflastersteinartigen epithelialen Morphologie zu einer spindelförmigen Fibroblasten-ähnliche Aussehen; (2) Der Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen; und (3) Der Schalt Expression von EMT-Marker, die durch den Verlust definiertepithelialen Marker und Verstärkung von mesenchymalen Marker. Zelle morphologische Veränderungen durch Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung im Zeitverlauf der Induktion EMT erfasst, in Abschnitt 1. Immuno-Fluoreszenz-Detektion von E-Cadherin bei Zellen-Übergängen beschrieben, ist in diesem Abschnitt beschrieben. Die Expression von EMT-Marker wird durch Immunoblotting nachgewiesen. Gemeinsamen epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und mesenchymalen Marker umfassen Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin. Allgemeine Vorgänge der Immunoblot werden in Abschnitt 4 beschrieben. <ol><li> Am Tag 12 der Behandlung TAM, Samen 1 x 10 5 Zellen auf einer 12 mm Glaskreisdeckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte gelegt. </li><li> 48 Stunden nach dem Aussäen absaugen mittel-und Wasch Zellen mit vorgewärmter PBS. </li><li> Fix Zellen mit vorgewärmten 4% Paraformaldehyd für 15 min. </li><li> Mit PBS waschen Zellen dreimal. </li><li> Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS Inkubieren für 15min bei RT. </li><li> Mit PBS waschen Zellen dreimal. </li><li> Zellen in 5% BSA / PBS-Inkubation für 1 h bei RT zu blockieren nichtspezifische Bindung. </li><li> Zellen, die mit dem primären Antikörper E-Cadherin Inkubieren bei 1:50 Verdünnung in 1% BSA / PBS in einer befeuchteten Kammer O / N bei 4 ° C ist. HINWEIS: Der Bereich für primäre Antikörper Verdünnung ist normalerweise zwischen 1:50 und 1: 200, und die optimale Verdünnung für jeden Antikörper sollte experimentell bestimmt werden. </li><li> Dekantiert man die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. </li><li> Zellen mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper inkubieren in einer 1: 500-Verdünnung für 1 h bei RT. Von diesem Schritt auf, schützen die Zellen vor Licht. </li><li> Dekantiert man die sekundären Antikörper und dreimal mit PBS. </li><li> Fleck Zellen mit 0,1-1 g / ml DAPI oder Hoechst für 10 min. </li><li> Spülen Zellen dreimal mit PBS. </li><li> Berg Deckgläschen mit einem Tropfen Eindeckmedium und Deckgläschen Dichtung mit Nagellack. </li><li> Beachten Zellen und nehmenBilder unter einem Fluoreszenzmikroskop 63X. </li></ol> Färbung mit zusätzlichen Antikörpern kann durchgeführt werden, um die EMT-Phänotyp zu bestätigen. Zum Beispiel können N-Cadherin und α-Aktin des glatten Muskels bei einer mesenchymalen Phänotyp 29,31,32 gefärbt werden. Reorganisation des Zytoskeletts Struktur kann durch Anfärben der Zellen mit Phalloidin für F-Actin-11 überwacht werden. Darüber hinaus können Assays auf Zellbeweglichkeit und Zelltod Widerstand durchgeführt werden, um die Eigenschaften des EMT 11 zu prüfen. 3. Nachweis der Splice-Isoformen Mit qRT-PCR-Assays <ol><li> Primer-Design HINWEIS: Primerpaare sollten sorgfältig geplant werden, um unterschiedliche Spleiß-Isoformen zu verstärken. Exon-Skipping, das am häufigsten beobachteten alternatives Spleißen Fall wird hier als Beispiel für die Strategie der Primer-Design veranschaulichen. 1A zeigt einen Vier-Exon-pre-mRNA, wobei das dritte Exon als variable Exon. Einbeziehung von Exon 3 Ergebnisse indie Herstellung eines mehr Spleiß-Isoform, wobei das Exon 3 erzeugt einen kürzeren Spleiß-Isoform. Primer müssen entwickelt, um die Exon-3-Isoform enthalten und Exon-3-Isoform unterscheiden sprungen, und die Gesamt Transkript dieser mRNA zu detektieren. <ol><li> Für den Nachweis von Exons Aufnahme sorgfältig Design eine Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exon 3 und einem Reverse-Primer in der Nähe konstitutive Exon 4, so dass für die spezifische Amplifikation der variablen Exon-Isoform enthalten. Achten Sie darauf, sowohl vorwärts als auch entwerfen und Reverse-Primer innerhalb der gleichen variable Exon, um PCR-Produkte aus genomischer DNA oder pre-mRNA verstärkt zu vermeiden. </li><li> Zur spezifischen Amplifizierung Exon-Skipping-Ereignisse, Design einer der Primer überspannt den Übergang des konstitutiven Exon 2 und Exon 4, die auf andere Weise zerstört würde, wenn variable Exon 3 enthalten sein. Entwerfen der andere Primer in dem konstitutiven Exon 4. Daher werden PCR-Produkte erzeugt, nur wenn der variable Exon 3 excludEd und die konstitutive Exon 2 und Exon 4 werden anschließend miteinander verbunden. </li><li> Um die Gesamt Transkripte des Gens zu erkennen, entwerfen die Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons 1 und 2. So werden PCR-Produkte aus allen Isoformen verstärkt. </li><li> Sicherzustellen, dass die Schmelztemperatur (Tm) für alle Primer in etwa 55 ° C, wobei die Länge jedes Primers etwa 18-22 Nukleotide, und die Größe der PCR-Produkte liegt zwischen 80 und 150 Basenpaaren. </li></ol></li><li> RNA-Extraktion: Auszug RNA mit einer Gesamt-RNA Isolation Kit (siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Sammeln Zellen in 350 ul RNA Lyse-Puffer. </li><li> Fügen Sie 350 ul 70% Ethanol zum Lysat und gründlich mischen. </li><li> Übertragung der Probe auf die Säule zur Reinigung von RNA. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min und Durchfluss verwerfen. </li><li> Einmal mit 500 ul Waschpuffer I RNA und RNA zweimal mit Waschpuffer II Die Säule. </li><li> Reste von RNA-WaschpufferII von der Säule durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten. </li><li> Übertragen die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen werden 50 ul Nuklease-freies Wasser in der Mitte des Säulenmatrix und Eluieren RNA durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit. </li></ol></li><li> Synthese von Erststrang-cDNA <ol><li> Bestimmung der Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorptionsmessung. HINWEIS: Gute Qualität RNA sollte eine 260 nm / 280 nm Absorptionsverhältnis von etwa 2,0. </li><li> Der reverse Transkriptase (RT)-Reaktionen, die 250 ng Gesamt-RNA, 0,05 ug Zufalls-Hexamer-Primer, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 ul 5 · GoScript Puffer und 1 ul RT-Enzym in einem Endvolumen von 20 ul enthalten eingestellt. </li><li> Führen RT-Reaktionen bei 42 ° C für 1 h, gefolgt von einer Inkubation bei 70 ° C für 5 min, um die RT-Enzym zu inaktivieren. </li></ol></li><li> Echtzeit-PCR <ol><li> Bis 20 ul Reaktionen, die von 10 ul SYBR Green Master Mix bestehen eingestellt,0,1-1,0 ul cDNA-Vorlage, und 5 pmol Vorwärts und Rückwärts-Primer. </li><li> Führen Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen der folgenden Schritte: 95 ° C Denaturierung für 10 Sekunden bei 58 ° C Annealing für 10 sec und 60 ° C Extension für 30 Sekunden. Führen PCR-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Überprüfen Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass ein einzelner Peak ist für jedes Primerpaar beobachtet. </li><li> Erhalten die Werte Quantifizierung Zyklus (CQ) durch die Berechnung der zweiten Ableitung Werte der Verstärkungskurven. </li><li> Berechnen der relativen Menge (RQ) des Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zu der nicht-induzierten Probe unter Verwendung des 'Delta-Delta-Cq (ΔΔCq) "-Methode, wie durch die folgende Formel gezeigt. Verwenden Housekeeping-Gene, wie GAPDH oder TBP, als Referenz. </li></ol></li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> Um genauer zu berechnen relativen Werte von Spleiß-Isoformen, ter von mehreren Referenzgenen verwenden sollten berücksichtigt werden. Die Ergebnisse können unter Verwendung eines von Pfaffl et al 33,34 beschriebenen modifizierten Absolutwert Quantifizierungsmethode analysiert werden. 4. Prüfung der Splice-Isoformen auf Proteinebene <ol><li> Sammeln Zellen in 100 ul eiskaltem RIPA-Puffer. </li><li> Stellen Lysate auf Eis für etwa 10 min. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstandes. </li><li> Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays. </li><li> Verdünnte Proteinproben in SDS-Beladungspuffer geladen 20-40 ug Proteine ​​in 10% SDS-PAGE-Gelen. </li><li> Führen SDS-PAGE-Gelen bei 20 mA für 1,5 Stunden. </li><li> Transfer-Proteine ​​auf PVDF-Membranen in einer Nasstransfersystem bei 4 ° C für 3 h bei 85 V. Einstellen der Übertragungszeit nach dem Molekulargewicht des Zielproteins. </li><li> Block Membran in 5% fettfreier Milch 30 min bis 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren Membran witen einen primären Antikörper bei 4 ° CO / N. Der Bereich für die Primärantikörperverdünnung in der Regel zwischen 1: 200 und 1: 5.000, bestimmen die optimale Verdünnung für jeden Antikörper experimentell. Die Verdünnung der Antikörper in diesem Protokoll verwendet werden, können in "Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte" zu finden. <ol><li> Um Spleiß-Isoformen erkennt, verwenden Sie spezifische Antikörper, die eine bestimmte Isoform zu erkennen. Alternativ können einen Antikörper, der das Epitop im konstitutiven Exon codierenden Region erkennt und erfassen Spleiß-Isoformen gleichzeitig aufgrund ihrer unterschiedlichen Proteingrößen. </li><li> Zur gleichen Zeit, zu überwachen EMT durch Immunoblotting EMT-Marker. Sie können den E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin als epithelialer Marker und Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin als mesenchymalen Marker. </li></ol></li><li> Waschen der Membran dreimal mit TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) in einem 5-Minuten-Intervall. </li><li> Inkubieren Membran mit einem HRP-konjugierten sekundären Ameisenibody in einer 1: 10.000-Verdünnung für 1 h bei RT. </li><li> Waschen der Membran dreimal mit TBS-T bei einer 5-min-Intervall. </li><li> Visualisieren Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und setzen die Membran auf eine Autoradiographiefilm. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis des alternativen Spleißens in einem induzierbaren EMT-Modell. Als solche dynamische Veränderungen der Spleiß-Isoform-Expression im gesamten zeitlichen Verlauf der EMT erfasst werden. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der Verwendung von unterschiedlichen epithelial- oder mesenchymalen-Zelllinien, die für den Vergleich von alternativen Spleißen, weil verschiedene genetische Hintergründe aus un-verwandten Zelllinien konnte mäßig beeinflussen alternative Spleißen. A...

Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein Entwicklungsprogramm, das Organ Morphogenese und Gewebeumbau während der Embryogenese steuert. Wenn abnorm aktiviert, fördert die EMT Tumormetastasierung und Organfibrose 1,2. Zwingende Studien haben die Bedeutung der transkriptionellen Regulierung während des Prozesses der EMT beschrieben, durch mehrere Transkriptionsfaktoren, wie Verdrehen, Schnecke, und ZEB, die die Expression des Zonula-junction-Protein E-Cadherin-Repression, was zum Verlust eines Pflaster definiert Stein wie epitheliale Morphologie und Verstärkung eines spindelförmigen mesenchymalen Phänotyp 3-8. Jüngste Studien durch genomweiten Analyse von RNAs aufgedeckt, daß es eine Gruppe von Genen, deren Klebemuster entweder mit epithelialen oder mesenchymalen Phänotypen 9,10 zugeordnet. Arbeiten aus unserem Labor alternatives Spleißen und EMT funktionell verbunden. Durch das Studium der Zelloberfläche Adhäsionsmolekül CD44 wir gezeigt, dass CD44 alterntiven Spleißen dicht bei EMT geregelt, und noch wichtiger, dass CD44 Spleiß-Isoform Schalt kausal trägt EMT 11. Alternatives Spleißen ist ein weit verbreitet und konservierten Modell der Genregulation, wie bis zu 95% der menschlichen Multi-Exon-Gene sind alternativ gespleißte 12-14. Durch die Erzeugung von mehreren Protein-Produkte von einem einzigen Gen, stellt alternative Spleißen einen wesentlichen Mechanismus für die Proteinvielfalt, indem eine weitere Schicht von Komplexität des menschlichen Genoms. Als solche könnte eine Fehlregulation von alternativem Spleißen möglicherweise tiefgreifende biologische Wirkungen verursachen Erkrankungen des Menschen führen. Tatsächlich hat abweichende alternative Spleißen in Krankheiten, für mehr als ein Jahrzehnt 15-25 dokumentiert, einschließlich der jüngsten Erkenntnisse, die Mutationen in Genen die Spleißosom Maschinen codieren, werden häufig in myelodysplastischen Syndromen 26-28 gefunden. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger Verfahren zum Nachweis von alternativ gespleißten isoforms ist von großer Bedeutung in der Erforschung der vielfältigen biologischen Prozesse, einschließlich EMT. Hier bieten wir ein Protokoll, um Veränderungen in alternative Spleißen unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modell zu erkennen. Die Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und das Nachweisen Spleiß-Isoformen sind nicht nur für die Untersuchung von alternativem Spleißen während EMT, sondern auch zur Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen. Untersuchung alternatives Spleißen während EMT ist zwingend notwendig, um ein besseres Verständnis der Mechanismen der EMT und Metastasierung von Tumoren, so die Entwicklung von Strategien, um die Krebsmetastasen zu behandeln.

<table><tbody><tr><td>4-Hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Stellen Sie eine Stammlösung her, indem Sie 4-Hydroxytamoxifen in Ethanol auf 200 &#956;M auflösen. Halten Sie die Lösung bei -20 &#176; C vor Licht geschützt.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation Kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagenz für qRT-PCR Assay</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagenz für qRT-PCR Assay</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment für qRT-PCR Assay</td></tr><tr><td>CD44 Antikörper</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>E-Cadherin Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2.500 Verdünnung für Immunblotting; 1:50 Verdünnung für Immunfluoreszenz</td></tr>&<tr><td>Gamma;-Catenin Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Occludin Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Fibronektin Antikörper</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>N-Cadherin Antikörper</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Vimentin Antikörper</td><td>NeoMarker</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western-Blotting-Detektionsreagenz</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Chemilumineszenz-System</td></tr></tbody></table>

nachweis von alternative splicing während epithelial-mesenchymale transition

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternatives Spleißen spielt eine entscheidende Rolle bei der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT), einem essentiellen zellulären Programm, das in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen abläuft. Hier beschreiben wir eine Strategie zum Nachweis alternatives Spleißen während der EMT unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modells durch Expression des Transkriptionsrepressors Twist. Die EMT wird durch Veränderungen in der Zellmorphologie, den Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen und die geschaltete Expression von EMT-Markern, wie z. B. den Verlust der epithelialen Marker E-Cadherin und γ-Catenin und den Gewinn der mesenchymalen Marker N-Cadherin und Vimentin, überwacht. Unter Verwendung von isoformspezifischen Primer-Sets wird das alternative Spleißen interessierter mRNAs mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Die Herstellung entsprechender Proteinisoformen wird durch Immunblotting-Assays validiert. Das hier beschriebene Verfahren zum Nachweis von Spleißisoformen eignet sich auch für die Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen.

Die oben beschriebenen Verfahren stellen eine robuste Methode zur alternatives Spleißen während EMT erfassen. Repräsentative Ergebnisse der CD44 splice Isoform Schalt bei Twist-induzierte EMT sind nachfolgend als Beispiel angegeben. Twist-induzierte EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen wurde durch einen Übergang von einem Kopfstein wie epitheliale Phänotyp zu einem länglichen Fibroblasten-Phänotyp (2A), das Fehlen von epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und die d...

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Veränderungen im alternativen Spleißen während der EMT zu erkennen. Dies wird durch die Verwendung eines induzierbaren EMT-Modells erreicht, in dem die Expression des Fusionsproteins verdreht ist. In der menschlichen Brust lösen Epithelzellen die Zellen aus, sich in einem zweiten Schritt einer EMT zu unterziehen, nachdem Tamoxifen behandelt wurde.Die Expression von Spleißisoformen wird durch quantitatives R-T-P-C-R unter Verwendung isoformspezifischer Primersätze analysiert, was alternative Spleißänderungen auf RNA-Ebene aufzeigt. Als nächstes wird die Häufigkeit des Proteins, das jeder Isoform entspricht, durch Immunblotting bestimmt, um die Expression von Spleißisoformen auf Proteinebene zu bestätigen, es werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen im alternativen Spleißen in Genen von Interesse während der EMT zeigen, basierend auf quantitativen R-T-P-C-R- und Immunblotting-Analysen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des alternativen Spleißens von RN und EMT zu beantworten. z.B. wie alternatives Spleißen während der EMT reguliert wird und wie sich diese Regulation auf EMT und EMT-bedingte pathologische Prozesse auswirkt. Die Implikationen dieser Technik sind für die Krebstherapie, da EMT eine wichtige Rolle bei der Förderung der Tumorinvasion und Metastasierung spielt.Diese Methode kann jedoch einen Einblick in alternatives Spleißen während der EMT geben. Die Methode zur isoformspezifischen MRA-Detektion kann auch in anderen Systemen angewendet werden, wie z.B. bei der Untersuchung des alternativen Spleißens bei der Neuronendifferenzierung und dem Programm Zelltod. Der erste Schritt besteht darin, Zellen, die das Twist-ER-Fusionsprotein exprimieren, zu plattieren, die Zellen in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale in Duplikaten auszusäen, dann die Tamoxifen-Lösung vorzubereiten und zu lichtschützen, um den epithelialen mesenchymalen Übergang zu induzieren, oder EMT-Zellen mit 20 nanomolaren Tamoxifen-haltigen Medien für eine nicht mit Tamoxifen behandelte Kontrollgruppe zu behandeln und zwei Tage nach der Inkubation 0,01 % Ethanol zu einem zusätzlichen Satz von Zellen hinzuzufügen.Nehmen Sie Bilder unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf, um morphologische Veränderungen festzuhalten. Waschen Sie anschließend die Zellen mit kaltem PBS. Kratzen Sie die Zellen von einer Hälfte der Platte in einen RNA-Lysepuffer für die RNA-Isolierung und die andere Hälfte in 100 Mikroliter eiskalten Ripa-Puffer für die Proteinanalyse, passieren Sie die Zellen aus beiden Gruppen, wie zuvor gezeigt, und behandeln Sie kontinuierlich mit 20 nanomolaren Tamoxifen oder Vehikel.Wiederholen Sie diese Schritte jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu diesem Zeitpunkt sollten mit Tamoxifen behandelte Twist-ER-Zellen eine spindelförmige mesenchymale Morphologie aufweisen. Während Vehikel-behandelte Kontrollen die kopfsteinpflasterartige Epithelmorphologie beibehalten sollten. Hier wird eine Vier-Exon-Prem-NNA als Beispiel für den Nachweis von Exon-Einschluss verwendet.Entwerfen Sie einen Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exons drei und einen umgekehrten Primer innerhalb des nahegelegenen konstitutiven Exons vier. Ermöglicht die spezifische Amplifikation der variablen Exon-eingeschlossenen Isoform, um Exon-Skipping-Ereignisse spezifisch zu amplifizieren. Entwerfen Sie Primer, die die Verbindung zwischen dem konstitutiven Exon zwei und dem Exon vier überspannen und die andernfalls zerstört würden, wenn das variable Exon drei einbezogen wird.Entwerfen Sie den anderen Primer innerhalb des konstitutiven Exons vier, um die Gesamttranskripte des Gens zu detektieren und PCR-Produkte zu vermeiden, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, oder Prem-NA.Design-Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons, wenn sie bereit sind. Befolgt standardmäßige RNA-Extraktionsverfahren, um die RNA aus den zuvor entnommenen Zellproben zu isolieren. Bestimmen Sie die Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorption, um den ersten Strang CD NA zu synthetisieren, und richten Sie reverse Transkriptase-Reaktionen in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern ein.Führen Sie RT-Reaktionen bei 42 Grad Celsius für eine Stunde durch, gefolgt von einer Inkubation bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Um das RT-Enzym in Echtzeit zu inaktivieren. Bei der PCR wurden 20 Mikroliter Reaktionen durchgeführt, die aus 10 Mikrolitern Cyber Green Mastermix, 0,1 bis 1,0 Mikrolitern CD NA-Template und fünf Picomolen, Forward- und Reverse-Primern bestehen.Führen Sie eine Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen in dreifacher Ausführung durch. Überprüfen Sie die Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass für jedes Primer-Set ein einzelner Peak beobachtet wird. Erhalten Sie die Werte des Quantifizierungszyklus, indem Sie die Werte der zweiten Ableitung der Amplifikationskurven berechnen.Berechnen Sie die relative Menge an Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zur nicht induzierten Probe unter Verwendung der Delta-Delta-CQ-Methode, wie in dieser Formel gezeigt. Lassen Sie die für die Proteinanalyse gesammelten Zellen etwa 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie sie zentrifugieren und den Überstand sammeln. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration verdünnen Sie die Proben in SDS-Beladung, puffern und laden Sie 20 bis 40 Mikrogramm Proteine in 10%ige SDS-Seitengele.Führen Sie SDS-Seitengele 1,5 Stunden lang bei 20 Milliampere aus. Nach dieser Zeit übertragen Sie Proteine in einem Nasstransfersystem bei vier Grad Celsius für drei Stunden bei 85 Volt auf PVDF-Membranen. Passen Sie die Transferzeit entsprechend dem Molekulargewicht der Zielproteine an.Blockieren Sie anschließend die Membran 30 Minuten bis eine Stunde lang in 5% fettfreier Milch. Inkubieren Sie die Membran bei Raumtemperatur mit einem Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht. Der Primärantikörper erkennt das Epitop in der konstitutiven Exon-Beschichtungsregion und detektiert gleichzeitig Slic-Isoformen anhand ihrer unterschiedlichen Proteingrößen.Überwachen Sie gleichzeitig die EMT durch Immunblotting. Für EMT-Markierer. Verwenden Sie eec, ahern, gamma-Catenin und Occludin als epitheliale Marker und Fibronektin, n, Cadherin und Menton als mesenchymale Marker.Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal im Fünf-Minuten-Takt mit TBST. Als nächstes inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von ein bis 10.000 Grad für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran nach dieser Zeit dreimal im Abstand von fünf Minuten mit TBST.Visualisieren Sie schließlich die Proteine mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und belichten Sie die Membran mit einem Autoradiographiefilm. Die Twist-induzierte EMT war gekennzeichnet durch einen Übergang von einem kopfsteinpflasterartigen Epithel-Phänotyp zu einem länglichen fibroblastischen Phänotyp, der das Fehlen von epithelialen Markern wie e-Cadherin, Gamma-Catenin und Occludin sowie die Hochregulierung der mesenchymalen Marker, Fibronektin, Cadherin und Vimentin zeigte. Des Weiteren wurde die EMT anhand des Verlusts der EC-Cadherin-Lokalisation an den dargestellten Zellverbindungen bewertet.Hier sind die Primer-Designs für die Detektion von CD 44-Spleiß-Isoformen. Die Positionen der Grundierungen sind durch die verschiedenfarbigen Pfeile gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Q-R-T-P-C-R-Analysen deuten auf eine signifikante Abnahme der CD-44-V-mRNA und eine Zunahme der CD-44-s-mRNA nach 14-tägiger TAM-Behandlung hin.Im Gegensatz dazu blieb das Gesamttranskript von CD 44 während der EMT unverändert, was mit den Ergebnissen von Q-R-T-P-C-R übereinstimmte, der Proteinspiegel von CD 44 V nahm bemerkenswert ab, während die Expression des CD 44 s-Proteins während der Teilnahme an diesem Verfahren stark hochreguliert war. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine erfolgreiche HNO-Einleitung sehr wichtig ist. Daher muss die HNO mit verschiedenen Methoden, wie z.B. dem Nachweis von Veränderungen in der Zellmorphologie, der Expression von HNO-Markern und der Lokalisation von RIN auf der Zelloberfläche, sorgfältig bestätigt werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Spleißen von Reportern und das Verwalten des Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie diese wirkenden Elemente und die Transaktionsfaktoren die alternative Spleißregulation nach ihrer Entwicklung beeinflussen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie, Entwicklungsbiologie und Krebsbiologie den Weg, um eine alternative Spleißregulation in den EMT-Prozessen während der normalen Entwicklung und der Krebsmetastasierung zu erforschen.

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

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Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

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