Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Veränderungen im alternativen Spleißen während der EMT zu erkennen. Dies wird durch die Verwendung eines induzierbaren EMT-Modells erreicht, in dem die Expression des Fusionsproteins verdreht ist. In der menschlichen Brust lösen Epithelzellen die Zellen aus, sich in einem zweiten Schritt einer EMT zu unterziehen, nachdem Tamoxifen

Die Expression von Spleißisoformen wird durch quantitatives R-T-P-C-R unter Verwendung isoformspezifischer Primersätze analysiert, was alternative Spleißänderungen auf RNA-Ebene aufzeigt. Als nächstes wird die Häufigkeit des Proteins, das jeder Isoform entspricht, durch Immunblotting bestimmt, um die Expression von Spleißisoformen auf Proteinebene zu bestätigen, es werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen im alternativen Spleißen in Genen von Interesse während der EMT zeigen, basierend auf quantitativen R-T-P-C-R- und Immunblotting-Analysen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des alternativen Spleißens von RN und EMT zu beantworten. z.B. wie alternatives Spleißen während der EMT reguliert wird und wie sich diese Regulation auf EMT und EMT-bedingte pathologische Prozesse auswirkt. Die Implikationen dieser Technik sind für die Krebstherapie, da EMT eine wichtige Rolle bei der Förderung der Tumorinvasion und Metastasierung spielt.

Diese Methode kann jedoch einen Einblick in alternatives Spleißen während der EMT geben. Die Methode zur isoformspezifischen MRA-Detektion kann auch in anderen Systemen angewendet werden, wie z.B. bei der Untersuchung des alternativen Spleißens bei der Neuronendifferenzierung und dem Programm Zelltod. Der erste Schritt besteht darin, Zellen, die das Twist-ER-Fusionsprotein exprimieren, zu plattieren, die Zellen in einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturschale in Duplikaten auszusäen, dann die Tamoxifen-Lösung vorzubereiten und zu lichtschützen, um den epithelialen mesenchymalen Übergang zu induzieren, oder EMT-Zellen mit 20 nanomolaren Tamoxifen-haltigen Medien für eine nicht mit Tamoxifen behandelte Kontrollgruppe zu behandeln und zwei Tage nach der Inkubation 0,01 % Ethanol zu einem zusätzlichen Satz von Zellen hinzuzufügen.

Nehmen Sie Bilder unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf, um morphologische Veränderungen festzuhalten. Waschen Sie anschließend die Zellen mit kaltem PBS. Kratzen Sie die Zellen von einer Hälfte der Platte in einen RNA-Lysepuffer für die RNA-Isolierung und die andere Hälfte in 100 Mikroliter eiskalten Ripa-Puffer für die Proteinanalyse, passieren Sie die Zellen aus beiden Gruppen, wie zuvor gezeigt, und behandeln Sie kontinuierlich mit 20 nanomolaren Tamoxifen oder Vehikel.

Wiederholen Sie diese Schritte jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu diesem Zeitpunkt sollten mit Tamoxifen behandelte Twist-ER-Zellen eine spindelförmige mesenchymale Morphologie aufweisen. Während Vehikel-behandelte Kontrollen die kopfsteinpflasterartige Epithelmorphologie beibehalten sollten. Hier wird eine Vier-Exon-Prem-NNA als Beispiel für den Nachweis von Exon-Einschluss verwendet.

Entwerfen Sie einen Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exons drei und einen umgekehrten Primer innerhalb des nahegelegenen konstitutiven Exons vier. Ermöglicht die spezifische Amplifikation der variablen Exon-eingeschlossenen Isoform, um Exon-Skipping-Ereignisse spezifisch zu amplifizieren. Entwerfen Sie Primer, die die Verbindung zwischen dem konstitutiven Exon zwei und dem Exon vier überspannen und die andernfalls zerstört würden, wenn das variable Exon drei einbezogen wird.

Entwerfen Sie den anderen Primer innerhalb des konstitutiven Exons vier, um die Gesamttranskripte des Gens zu detektieren und PCR-Produkte zu vermeiden, die aus genomischer DNA amplifiziert wurden, oder Prem-NA.Design-Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons, wenn sie bereit sind. Befolgt standardmäßige RNA-Extraktionsverfahren, um die RNA aus den zuvor entnommenen Zellproben zu isolieren. Bestimmen Sie die Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorption, um den ersten Strang CD NA zu synthetisieren, und richten Sie reverse Transkriptase-Reaktionen in einem Endvolumen von 20 Mikrolitern ein.

Führen Sie RT-Reaktionen bei 42 Grad Celsius für eine Stunde durch, gefolgt von einer Inkubation bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Um das RT-Enzym in Echtzeit zu inaktivieren. Bei der PCR wurden 20 Mikroliter Reaktionen durchgeführt, die aus 10 Mikrolitern Cyber Green Mastermix, 0,1 bis 1,0 Mikrolitern CD NA-Template und fünf Picomolen, Forward- und Reverse-Primern bestehen.

Führen Sie eine Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen in dreifacher Ausführung durch. Überprüfen Sie die Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass für jedes Primer-Set ein einzelner Peak beobachtet wird. Erhalten Sie die Werte des Quantifizierungszyklus, indem Sie die Werte der zweiten Ableitung der Amplifikationskurven berechnen.

Berechnen Sie die relative Menge an Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zur nicht induzierten Probe unter Verwendung der Delta-Delta-CQ-Methode, wie in dieser Formel gezeigt. Lassen Sie die für die Proteinanalyse gesammelten Zellen etwa 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie sie zentrifugieren und den Überstand sammeln. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration verdünnen Sie die Proben in SDS-Beladung, puffern und laden Sie 20 bis 40 Mikrogramm Proteine in 10%ige SDS-Seitengele.

Führen Sie SDS-Seitengele 1,5 Stunden lang bei 20 Milliampere aus. Nach dieser Zeit übertragen Sie Proteine in einem Nasstransfersystem bei vier Grad Celsius für drei Stunden bei 85 Volt auf PVDF-Membranen. Passen Sie die Transferzeit entsprechend dem Molekulargewicht der Zielproteine an.

Blockieren Sie anschließend die Membran 30 Minuten bis eine Stunde lang in 5% fettfreier Milch. Inkubieren Sie die Membran bei Raumtemperatur mit einem Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht. Der Primärantikörper erkennt das Epitop in der konstitutiven Exon-Beschichtungsregion und detektiert gleichzeitig Slic-Isoformen anhand ihrer unterschiedlichen Proteingrößen.

Überwachen Sie gleichzeitig die EMT durch Immunblotting. Für EMT-Markierer. Verwenden Sie eec, ahern, gamma-Catenin und Occludin als epitheliale Marker und Fibronektin, n, Cadherin und Menton als mesenchymale Marker.

Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal im Fünf-Minuten-Takt mit TBST. Als nächstes inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von ein bis 10.000 Grad für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran nach dieser Zeit dreimal im Abstand von fünf Minuten mit TBST.

Visualisieren Sie schließlich die Proteine mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und belichten Sie die Membran mit einem Autoradiographiefilm. Die Twist-induzierte EMT war gekennzeichnet durch einen Übergang von einem kopfsteinpflasterartigen Epithel-Phänotyp zu einem länglichen fibroblastischen Phänotyp, der das Fehlen von epithelialen Markern wie e-Cadherin, Gamma-Catenin und Occludin sowie die Hochregulierung der mesenchymalen Marker, Fibronektin, Cadherin und Vimentin zeigte. Des Weiteren wurde die EMT anhand des Verlusts der EC-Cadherin-Lokalisation an den dargestellten Zellverbindungen bewertet.

Hier sind die Primer-Designs für die Detektion von CD 44-Spleiß-Isoformen. Die Positionen der Grundierungen sind durch die verschiedenfarbigen Pfeile gekennzeichnet. Die Ergebnisse der Q-R-T-P-C-R-Analysen deuten auf eine signifikante Abnahme der CD-44-V-mRNA und eine Zunahme der CD-44-s-mRNA nach 14-tägiger TAM-Behandlung hin.

Im Gegensatz dazu blieb das Gesamttranskript von CD 44 während der EMT unverändert, was mit den Ergebnissen von Q-R-T-P-C-R übereinstimmte, der Proteinspiegel von CD 44 V nahm bemerkenswert ab, während die Expression des CD 44 s-Proteins während der Teilnahme an diesem Verfahren stark hochreguliert war. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine erfolgreiche HNO-Einleitung sehr wichtig ist. Daher muss die HNO mit verschiedenen Methoden, wie z.B. dem Nachweis von Veränderungen in der Zellmorphologie, der Expression von HNO-Markern und der Lokalisation von RIN auf der Zelloberfläche, sorgfältig bestätigt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie das Spleißen von Reportern und das Verwalten des Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie diese wirkenden Elemente und die Transaktionsfaktoren die alternative Spleißregulation nach ihrer Entwicklung beeinflussen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie, Entwicklungsbiologie und Krebsbiologie den Weg, um eine alternative Spleißregulation in den EMT-Prozessen während der normalen Entwicklung und der Krebsmetastasierung zu erforschen.