High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Säugetier-Glykoproteine mit geeigneter Säugetier-Glykosylierung zu exprimieren, indem rekombinante Proteine gezielt auf den ER- und GOGI-vermittelten Sekretionsweg ausgerichtet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Immunologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle eine Spezifikation, Muster in der Struktur sowie das Potenzial zur Immunaktivierung von Antikörpern und Antikörperfragmenten spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass menschliche Zellen zur Expression menschlicher Proteine verwendet werden, was die geeignete zelluläre Umgebung bietet, um die Zielproteine korrekt zu falten und zu modifizieren.

Der Inkubator-Schüttler für die Zellkultivierung sollte mindestens eine Stunde vor der Kulturinokulation bei 135 U/min, 80 % Luftfeuchtigkeit, 8 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius betrieben werden. Schalten Sie die UV-Lampe des Biosicherheitsschrankes ein und temperieren Sie die verschlossenen Flaschen mit Medium A und Medium B im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vor. Schalten Sie das UV-Licht aus und desinfizieren Sie den Biosicherheitsschrank mit einer Lösung aus 70 % Ethanol und Wasser.

Sterilisieren Sie einen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit Belüftungskappe, Pipetten, Pipettierhilfen und vorgewärmte Medienflaschen, indem Sie sie mit einer 70 %igen Ethanol-Wasser-Lösung besprühen. Stellen Sie diese Artikel während des gesamten Verfahrens in den Sicherheitswerkbank. Alle Gegenstände müssen auf diese Weise sterilisiert werden, bevor sie in die Sicherheitswerkbank gebracht werden.

Bereiten Sie frisches Kulturmedium für eine 30-Milliliter-Kultur vor, indem Sie 26 Milliliter Medium A und drei Milliliter Medium B entnehmen und in den 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben umfüllen. Mischen Sie durch vorsichtiges Schütteln. Erwärmen Sie ein Gefäß mit zuvor bei minus 80 Grad Celsius eingefrorenen HEK 293F-Zellen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Zellen teilweise aufzutauen. Dies dauert etwa eine Minute, und die Zellen sollten nicht vollständig aufgetaut sein.

Als Nächstes die Außenfläche des Gefäßes mit der 70 %igen Ethanol-Lösung in Wasser desinfizieren und es in den Sicherheitswerkbank verschieben. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette die Zellsuspension aufnehmen und in den 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben überführen, der 29 Milliliter frisches Kulturmedium enthält. Den Deckel des Kulturkolbens schließen und den Kolben für 24 Stunden in den Inkubations-Schüttler stellen.

24 Stunden nach der Kulturbepflanzung. Überprüfen Sie die Zelldichte, sterilisieren Sie den Kulturkolben mit einer 70 %igen Ethanol-Wasser-Lösung und bringen Sie ihn in den Sicherheitswerkbank. Entnehmen Sie mithilfe einer Ein-Milliliter-Pipette und einer Pipettierhilfe langsam 100 Mikroliter der Kultur und überführen Sie diese in ein steriles 0,5-Milliliter-Einmalröhrchen.

Schließen Sie den Deckel des Kulturkolbens und stellen Sie den Kulturkolben so schnell wie möglich in den Inkubationsschüttler zurück. Mischen Sie 7,5 Mikroliter einer Trypanblaulösung mit 7,5 Mikrolitern der Zellen. Mischen Sie kräftig und übertragen Sie anschließend 7,5 Mikroliter der Mischung auf einen Zählobjektträger.

Schalten Sie den automatischen Zellzähler ein und legen Sie den Zähl-Objektträger in die Ladekammer ein. Der Automatikzähler wird aktiviert und zählt die Zellen automatisch in der Einheit Anzahl Zellen pro Milliliter und Prozent Vitalität. Bestimmen Sie das Volumen der Spenderkultur, das zur Übertragung in ein frisches Kulturmedium benötigt wird, um eine Zelldichte von 300.000 lebenden Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Bereiten Sie frisches Kulturmedium wie zuvor beschrieben vor, indem Sie 23 Milliliter Medium A und drei Milliliter Medium B in einen frischen 125-Milliliter-Kulturkolben umpipettieren. Danach entfernen Sie die Vorratsflaschen mit Medium A und Medium B aus dem Sicherheitswerkbank, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Entnehmen Sie den HEK 293F-Zellkulturkolben aus dem Inkubator.

Sprühen Sie es mit der 70 % Ethanol-Wasser-Lösung ein und stellen Sie es unter Verwendung einer neuen Pipette in den Sicherheitswerkbank. Entnehmen Sie den richtigen Aliquot an Zellen aus der Kultur und überführen Sie ihn in den Kolben mit frischem Kulturmedium. Überführen Sie beide Kulturen aus der Sicherheitswerkbank in den Inkubator-Shaker.

Züchten Sie die Zellen bis zu einer Dichte von etwa zwei bis drei Millionen lebenden Zellen pro Milliliter vor der Transfektion. Überprüfen Sie die Zelldichte, wie zuvor gezeigt, und bestimmen Sie die Menge an Zellen für die Transfektion. Verwenden Sie dazu eine sterile serologische Pipette.

Übertragen Sie das geeignete Volumen der Zellsuspension in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 ×g für fünf Minuten. Nach der Sterilisation überführen Sie das Röhrchen mit den pelletierten Zellen in den Sicherheitswerkbank.

Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Überstand, der aus verbrauchtem Kulturmedium besteht, abzugießen. Resuspendieren Sie die Zellenpellets kräftig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit 10 Milliliter frischem Kulturmedium und überführen Sie sie in einen vorbereiteten Kolben mit frischem Transfektionskulturmedium. Verschließen Sie den Deckel des belüfteten Zellkulturkolbens und inkubieren Sie den Kolben im Inkubationsshaker für 15 Minuten bis eine Stunde, während die Zellen inkubiert werden.

Verdünnen Sie die Plasmid-DNA- und POLYETHERAMINE- oder PEI-Stammlösungen mit frischem Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter. Entfernen Sie den Kulturkolben mit den dispergierten Zellen aus dem Inkubatorschüttler und bringen Sie ihn in die Sicherheitswerkbank. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette 300 Mikroliter Plasmid-DNA zur Kultur hinzu und mischen Sie vorsichtig durch manuelles Schütteln; anschließend 900 Mikroliter PEI zur Kultur geben und erneut mischen. Danach 3,8 Milliliter frisches Kulturmedium hinzufügen.

Überführen Sie den Kolben für 24 Stunden in den Inkubationsschüttler. 24 Stunden nach der Transfektion muss die Zellkultur verdünnt werden. Bereiten Sie zunächst das Verdünnungsmedium vor, indem Sie mit einer sterilen einmilliliter-Serologiepipette ein Milliliter PREWARM 220 Millimolar Valproinsäure oder VPA entnehmen und in ein steriles 50-Milliliter-Gefäß überführen.

Als Nächstes mit einer sterilen serologischen Pipette fünf Milliliter vorgewärmtes Medium B und 44 Milliliter vorgewärmtes Medium A zur VPA-Lösung hinzufügen. Dadurch entstehen 50 Milliliter frisches Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 4,4 Millimolar VPA. Die transfizierte Kultur aus dem Inkubator entnehmen.

Desinfizieren Sie die Außenfläche des Kolbens und stellen Sie den Kolben in den Sicherheitswerkbank. Geben Sie das vorbereitete Verdünnungsmedium zur Kultur hinzu. Überführen Sie den Kolben für weitere vier bis fünf Tage nach der Transfektion zurück in den Inkubator-Schüttler.

Überwachen Sie die Zellviabilität täglich mithilfe des zuvor gezeigten Verfahrens. Aliquote sollten außerdem jeden Tag zur Analyse der Proteinexpression entnommen werden, fünf bis sechs Tage nach der Transfektion oder falls die Zellviabilität unter 50 % fällt. Gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation von Zellen und Medium bei 1000 × g für fünf Minuten. Sammeln Sie das Überstand, der das sezernierte Protein enthält, und geben Sie fünf Milliliter einer 10 %igen Bleichlösung zum HEK-Zellpellet, anschließend als Bioabfall entsorgen.

Anschließend wird das Protein aus dem gesammelten Überstand gereinigt. Dieses Expressionssystem lieferte eine hohe Ausbeute an glykosylierten Proteinen, wie durch dieses typische Expressionsmuster von IgG1-Fc nach transienter Transfektion von HEK293F-Zellen veranschaulicht. Die Affinitätsreinigung mithilfe einer Protein-Säule für IgG1-Fc oder einer Nickel-Säule für histidinmarkiertes GFP mit FCγ-Rezeptor 3A ergab Proteine hoher Reinheit.

Dieses System exprimierte effizient isotopisch angereicherten IgG1-Fc in diesem zweidimensionalen NMR-Spektrum, das die Resonanzfrequenz von Wasserstoffkernen und des direkt gebundenen Amidstickstoffs korreliert. Es wurden gut dispergierte Signale von 15N-Atomen beobachtet. Unterschiedliche Glykoformen wurden mit HEK 293-F- und HEK 293S-Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen hergestellt, wie durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie-Analysen gezeigt wurde.

IgG eins FC, exprimiert aus HEK 293S-Zellen, enthielt Glykane in einer Form mit fünf Mannose-Einheiten plus zwei N-Acetylglucosamin-Resten und wies keine Fucosyl-glykane auf. Glykane aus HEK 293F-Expressionsmaterial waren vom komplexen Typ mit biantennären Strukturen, enthielten Kernfucose und hauptsächlich terminale N-Acetylglucosamin-Reste oder zu einem geringen Anteil mono- oder di-sialylierte Formen. Die Zugabe eines Glykosylierungshemmers zu einer Expression, die mit HEK 293F-Zellen durchgeführt wurde, führte zu einer Reduktion der Fucosylierung um mehr als 90 %. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die transiente Transfektion am ersten Tag innerhalb von 1,5 Stunden und am zweiten Tag innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen werden. Nach einer Expressionsdauer von vier bis sechs Tagen kann die Lösung, die das Protein enthält, innerhalb von 15 Minuten gewonnen werden.

Schließlich dauert die Reinigung des Proteins etwa 1,5 Stunden. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine stabile Kultur vor der Transfektion aufrechtzuerhalten, aktiv wachsende Zellen zu transfizieren und die DNA vor der Zugabe von PEI hinzuzufügen. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die funktionelle Charakterisierung des Proteins mithilfe einer Reihe biophysikalischer Techniken durchgeführt werden, um Struktur und Funktion des exprimierten Glykoproteins nach dessen Herstellung zu untersuchen.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Immunologie, die Struktur-Wirkungs-Beziehung von IgG und Glykosylierung in vitro und in vivo zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykoproteine mithilfe unserer Kombination aus K 2 93 F-Zellen und dem PZ N zwei Vektor herstellt und reinigt.