High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Säugetierglykoproteine mit einer geeigneten Säugetierglykosylierung zu exprimieren, indem rekombinante Proteine auf den ER- und GOGI-vermittelten sekretorischen Weg ausgerichtet werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Immunologie zu beantworten, wie z.B. die Rolle einer Spezifikation, Muster in der Struktur und das Immunaktivierungspotenzial von Antikörpern und Antikörperfragmenten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie menschliche Zellen verwendet, um menschliche Proteine zu exprimieren, was den geeigneten zellulären Missionar bietet, um die Zielproteine richtig zu falten und zu modifizieren.

Der Inkubatorschüttler für die Zelletablierung sollte mindestens eine Stunde vor der Kulturinokulation bei 135 U/min, 80 % Luftfeuchtigkeit, 8 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius betrieben werden. Schalten Sie die UV-Lampe der Biosicherheitswerkbank ein, wärmen Sie die verschlossenen Medium A- und Medium B-Flaschen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vor. Schalten Sie die UV-Lampen aus und sterilisieren Sie die Biosicherheitswerkbank mit einer 70%igen Ethanol- und Wasserlösung.

Sterilisieren Sie einen 125-Milliliter-Erlenmeyer-Wachstumskolben mit belüfteten Pipetten, Pipetten und vorwärmten Medienflaschen, indem Sie ihn mit einer 70%igen Ethanol-in-Wasser-Lösung besprühen. Legen Sie diese Gegenstände während des gesamten Vorgangs in die Biosicherheitswerkbank. Alle Gegenstände müssen auf diese Weise sterilisiert werden, bevor sie in die Biosicherheitswerkbank gebracht werden.

Frisches Nährmedium für eine 30-Milliliter-Kultur wird vorbereitet, indem 26 Milliliter des Mediums A und drei Milliliter des Mediums B entnommen und in den 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben überführt werden. Mischen Sie durch leichtes Schütteln ein Fläschchen mit HEK 2 93 F-Zellen, die zuvor bei minus 80 Grad Celsius in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius eingefroren wurden, um die Zellen teilweise aufzutauen. Dies dauert etwa eine Minute und die Zellen sollten nicht vollständig aufgetaut sein.

Sterilisieren Sie anschließend die Außenseite des Fläschchens mit der 70%igen Ethanol-in-Wasser-Lösung und stellen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank. Entnehmen Sie die Zellsuspension mit einer Ein-Milliliter-Pipette und überführen Sie sie in den 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 29 Millilitern frischem Nährmedium. Schließen Sie den Deckel des Kulturkolbens und legen Sie den Kolben für 24 Stunden in den Inkubatorschüttler.

24 Stunden nach der Kulturimpfung. Überprüfen Sie die Zelldichte, sterilisieren Sie den Kulturkolben mit der 70%igen Ethanol- und Wasserlösung und bringen Sie ihn in die Biosicherheitswerkbank. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette und einer Pipettierer werden langsam 100 Mikroliter der Kultur entnommen und in ein steriles 0,5-Milliliter-Einor-Röhrchen überführt.

Schließen Sie den Deckel des Kulturkolbens und stellen Sie den Kulturkolben so bald wie möglich wieder in den Inkubatorschüttler ein. Mischen Sie 7,5 Mikroliter einer Trianblau-Lösung mit 7,5 Mikrolitern Zellen. Kräftig mischen und dann 7,5 Mikroliter der Mischung auf einen Zählobjektträger geben.

Schalten Sie den automatischen Zellzähler ein und setzen Sie den Zählschieber in die Ladekammer ein. Das automatische Lesegerät wird aktiviert und die Zellen werden automatisch in den Einheiten Anzahl der Zellen pro Milliliter und prozentualer Lebensfähigkeit gezählt. Bestimmen Sie das Volumen der Spenderkultur, das für den Transfer auf ein frisches Kulturmedium erforderlich ist, um eine Zelldichte von 300.000 lebenden Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Bereiten Sie das frische Kulturmedium wie zuvor beschrieben vor, indem Sie 23 Milliliter des Mediums A und drei Milliliter des Mediums B in einen frischen 125-Milliliter-Kulturkolben umfüllen. Entfernen Sie danach die Lagerflaschen von Medium A und Medium B aus der Biosicherheitswerkbank, um das Risiko einer Kontamination zu verringern. Entnehmen Sie den Zellkulturkolben HEK 2 93 F aus dem Inkubator.

Besprühen Sie es mit der 70%igen Ethanol- und Wasserlösung und legen Sie es mit einer neuen Pipette in die Biosicherheitswerkbank. Das korrekte Aliquot der Zellen wird aus der Kultur entnommen und in den Kolben mit der frischen Kultur überführt. Mittel. Übertragen Sie beide Kulturen aus der Biosicherheitswerkbank in den Inkubatorschüttler.

Züchten Sie die Zellen vor der Transfektion auf eine ungefähre Dichte von zwei bis 3 Millionen lebenden Zellen pro Milliliter. Überprüfen Sie die Zelldichte, wie bereits gezeigt, und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen für die Transfektion. Mit einer sterilen serologischen Pipette.

Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Zellsuspension in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100-fachem G für fünf Minuten. Nach der Sterilisation wird das Röhrchen mit den pelletierten Zellen in die Biosicherheitswerkbank überführt.

Verwenden Sie eine sterile Pipette, um den Überstand bestehend aus verbraucht zu dekantieren. Das Nährmedium schickt die pelletierten Zellen kräftig zurück, indem es mit 10 Millilitern frischem Kulturmedium auf und ab pipettiert und in einen vorbereiteten Kolben mit frischer Transfektionskultur überführt wird. Mittel. Schrauben Sie den Deckel auf den belüfteten Zellkulturkolben und inkubieren Sie den Kolben im Inkubatorschüttler für 15 Minuten bis eine Stunde, während die Zellen inkubiert werden.

Die Plasma-DNA und die POLYETHERAMIN- oder PEI-Stämme werden mit frischem Nährmedium auf eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt. Nehmen Sie den Kulturkolben mit den dispergierten Zellen aus dem Inkubatorschüttler und bringen Sie ihn mit einer Mikropipette in die Biosicherheitswerkbank und geben Sie 300 Mikroliter Plasma-DNA in die Kultur und mischen Sie durch sanftes manuelles Schütteln bei 900 Mikrolitern PEI in die Kultur und mischen Sie erneut. Dann bei 3,8 Millilitern frischem Nährboden.

Der Kolben wird für 24 Stunden in den Inkubatorschüttler gestellt. 24 Stunden nach der Transfektion muss die Zellkultur verdünnt werden. Um das Verdünnungsmedium vorzubereiten, entnehmen Sie zunächst mit einer sterilen serologischen Ein-Milliliter-Pipette einen Milliliter PREWARM 220 millimolare Valproinsäure oder VPA und überführen Sie es in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie anschließend mit einer sterilen serologischen Pipette fünf Milliliter Vorwärmmedium B und 44 Milliliter Vorwärmmedium A in die VPA-Lösung. Daraus ergeben sich 50 Milliliter Frischkulturmedium mit einer Endkonzentration von 4,4 Millimolar VPA. Entnehmen Sie die transfizierte Kultur aus dem Inkubator.

Sterilisieren Sie das Äußere des Kolbens und legen Sie den Kolben in die Biosicherheitswerkbank. Geben Sie das vorbereitete Verdünnungsmedium in die Kultur. Den Kolben nach der Transfektion für weitere vier bis fünf Tage in den Inkubatorschüttler zurückstellen.

Überwachen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen täglich nach dem zuvor gezeigten Verfahren. Aliquots sollten auch jeden Tag für die Proteinexpressionsanalyse aufbewahrt werden, fünf bis sechs Tage nach der Transfektion oder, wenn die Zellviabilität unter 50 % fällt. Ernten Sie Zellen, indem Sie die Zellen plus Medium fünf Minuten lang bei 1000-fachem G zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand, der das sekretierte Protein enthält, in fünf Millilitern einer 10%igen Bleichlösung für das HEK-Zellpellet und entsorgen Sie ihn als biologische Gefahr.

Anschließend wird das Protein aus dem gesammelten Überstand gereinigt. Dieses Expressionssystem erzeugte eine hohe Ausbeute an glykosylierten Proteinen, was durch dieses typische Expressionsmuster von IgG one fc nach transienter Transfektion von HK 2 93 F-Zellen veranschaulicht wird. Die Affinitätsreinigung mit einer Proteinsäule für IgG mit einem FC oder einer Nickelsäule für Histamin-markiertes GFP mit FC-Gamma-Rezeptor drei A führte zu Proteinen mit hoher Reinheit.

Dieses System exprimierte effizient isotopenangereichertes IgG mit einem FC in diesem zweidimensionalen NMR-Spektrum, das die Resonanzfrequenz von Wasserstoffkernen und dem direkt gebundenen Amidstickstoff korreliert. 15 Atome zeigten gut verteilte Signale. Verschiedene Glykoformen wurden mit HEK 2 93 F und HEK 2 93 s Zellen unter unterschiedlichen Kulturbedingungen hergestellt, wie matrixgestützte Laser-DESORPTIONS-Ionisations-Massenspektrometrie-Analysen zeigten.

IgG ein FC, das aus HEK 2 93 s-Zellen exprimiert wurde, beherbergte und Glykane, die eine Form mit fünf anos plus zwei N-Acetylglucosaminresten hatten, die keine FU-Glukoseglykane aus HEK 2 93 F-exprimiertem Material enthielten, waren komplexe Typ-bi-Wegeformen mit Kern-FU-Glukose und meist mit terminalem N-Acetylglucosamin oder einem kleinen Anteil von mono- oder dilatierten Formen. Die Zugabe eines Glykanierungsinhibitors zu einer Expression, die mit HEK 2 93 F-Zellen durchgeführt wurde, zeigte eine Verringerung des Fuco-Einbaus um mehr als 90 %. Nach der Beherrschung kann die Etablierung der transienten Transfektion am ersten Tag in 1,5 Stunden und am zweiten Tag in 15 Minuten abgeschlossen werden. Nach einer Expressionszeit von vier bis sechs Tagen kann die Lösung, die das Protein enthält, in 15 Minuten geerntet werden.

Schließlich dauert die Reinigung des Proteins etwa 1,5 Stunden, während dieses Verfahren versucht wird, ist es wichtig, daran zu denken, eine stabile Kultur vor der Transfektion aufrechtzuerhalten, aktiv wachsende Zellen zu transfizieren und DNA hinzuzufügen, bevor PEI hinzugefügt wird. Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie z.B. die funktionelle Charakterisierung von Proteinen mit einer Reihe von biophysikalischen Techniken, können durchgeführt werden, um die Struktur und Funktion des exprimierten Glykoproteins nach seiner Entwicklung zu untersuchen.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, die Struktur-Wirkungs-Beziehung von IgG und Glykosylierung in vitro und in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykoproteine mit unserer Kombination aus einer K 2 93 F-Zelle und dem PZ N 2-Vektor herstellt und reinigt.