Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die konfokale 3D-Laserscanning-Mikroskopie für die Zeitrafferbildgebung zu nutzen, um die in vitro Biokompatibilität von Zahnkompositen qualitativ und quantitativ zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst sphärische Proben von nicht ausgehärtetem Zahnkomposit entnommen werden. Humane gingivale Fibroblasten werden in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Kompositextrakte kultiviert, und dann werden die Zellen mit Lebendtotfärbung markiert.

Anschließend werden Kartenbilder der Zellkulturen erstellt und Overlay-Bilder für die interessierenden Bereiche erstellt. Letztendlich können die Echtzeit-Unterschiede im Zellverhalten, die in Gegenwart oder Abwesenheit der getesteten Komposite auftreten, anhand der in den Bildern beobachteten Veränderungen der grünen oder roten Fluoreszenzsignale überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die Echtzeitüberwachung lebender Zellen ermöglicht, ohne Veränderungen in der Zellstruktur hervorzurufen.

Nach der Zellfärbung oder vor der Zeitrafferbetrachtung sind keine Fixierungs- oder Trocknungsschritte erforderlich. Um den Kompositextrakt herzustellen, verwenden Sie zunächst einen maßgeschneiderten Halter mit einem Radius von zwei Millimetern, um kugelförmige Proben des nicht ausgehärteten Zahnkomposits zu bilden. Übertragen Sie die Proben in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, die einen Milliliter Kulturmedium enthält, wobei darauf zu achten ist, dass einige Vertiefungen mit dem Medium für Kontrollzellkulturen in Ruhe bleiben, und ordnen Sie dann eine LED-Lampe mit einer Intensität von 1070 Milliwatt Quadratzentimeter innerhalb von 0,5 Millimetern um die Proben an.

härteten die Proben 40 Sekunden lang aus, um den vorübergehenden Kontakt zwischen den Zähnen und dem unversorgten Zahnkomposit zu simulieren, und inkubierten die Kompositproben dann 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage und die Passagezellen alle fünf Tage. Nachdem die Kultur die Kofluenz erreicht hat, ernten Sie die Zellen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 90 mal G und bei 37 Grad Celsius.

Resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedium und säen Sie die Zellsuspension nach dem Zählen der Zellen bei einer Zelldichte von 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter in einem Kammer-Objektträgersystem über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid aus. Am nächsten Morgen wird das Medium in zwei Vertiefungen des Kammerobjektträgers durch einen Milliliter der getesteten Kompositextrakte ersetzt und der Objektträger wieder in den Inkubator gelegt, um die Zellen konfokal abzubilden. Zeitraffer-Bildgebung.

Markieren Sie zunächst die kokultivierten Komposit- und Kontrollzellen mit lebender toter Zytotoxizitätsfärbung für eukaryotische Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. 15 Minuten nach der Färbung legen Sie den Objektträger im Dunkeln in die konfokale integrierte Kammer unter Zellkulturbedingungen und erwärmen Sie die 473-Nanometer- und 559-Nanometer-Laser. Als nächstes stellen Sie mit einem Detektor mit einem neu entwickelten Spektrum automatisch die Abbildungsbedingungen für den 473-Nanometer-Laser ein.

Verwenden Sie die Bildausschnitt- und Zoomfunktionen, um den Interessenbereich auszuwählen, und wählen Sie dann den Beobachtungsmodus aus. Wählen Sie je nach Bedarf bis zu fünf Arten von Beobachtungsmodi, einschließlich Zeitraffer-Zack und Multi-Area, und erfassen Sie dann schnell fünf Kartenbilder mit einem 473-Nanometer-Laser unter dem 10-fach-Objektiv sowohl für die Testprobe als auch für die Kontrollzellen, wenn die gewünschten Bilder aufgenommen wurden. Schalten Sie auf den 559-Nanometer-Laser um und nehmen Sie Bilder der Zelle bei der zweiten Fluoreszenz auf, wie gerade gezeigt.

Alternativ können Sie die Fluoreszenz- und Lichtkontrastbilder mit dem ausgewählten Punkt auf dem X 60-Live-Bildschirm überlagern, um den Live-Bildspeicher zu beobachten. Die Kartenbilder im Olympus-Bildformat für die Signalanalyse und die maximalen Projektionsbilder betragen 24 Bit pro Pixel. TIFF-Dateien verwenden dann die verschiedenen Analysewerkzeuge, um das Intensitätsprofil des Signals und das Intensitätsverhältnis zwischen den beiden Fluoreszenzkanälen zu messen.

Analysieren Sie schließlich die Unterschiede in der Signalübertragung der Fluoreszenzzellen zwischen den beiden Gruppen mit der entsprechenden Software. In diesen Kartenbildern von lebenden TED-Färbezellen in Medien allein oder mit Kompositextrakt exponiert, wurden keine Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen 15 Minuten nach dem Zeitraffer beobachtet. Hier zeigen maximale Projektionsbilder der Kontrollzellen das vergrößerte Schicksal der Zellen innerhalb der ersten 15 Minuten und fünf Stunden später, am Ende der Zeitrafferperiode, wie beobachtet, gab es keine signifikante Variation in der Fluoreszenz innerhalb der Kontrollzellen über die Inkubationszeit.

Die ELS-exponierten Zellen mit extra geringer Schrumpfung nahmen eine ähnliche Spindelmorphologie wie die Kontrollzellen an, zeigten jedoch eine leichte Abnahme des grünen Fluoreszenzsignals und eine sehr geringe Zunahme der roten Fluoreszenz am Ende der Zeitrafferperiode. Das Intensitätsprofil der gefärbten Zellen ist in diesen Diagrammen dargestellt, wobei die Fluoreszenzemissionsintensitäten des Calcium-Endothel-Homodimers an Kontroll- und Komposit-exponierten Zellen in einstündigen Intervallen für bis zu fünf Stunden gemessen wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Signalübertragung zwischen den beiden Kulturen beobachtet.

Die Viabilitätsverhältnisse für die Kontrollzellen und die exponierten zusammengesetzten Zellen sind in der Tabelle aufgeführt. In Gegenwart des getesteten Komposits wurde festgestellt, dass der Anteil lebender Zellen nach einer Stunde Kontakt nach fünf Stunden leicht von 100 auf 93,9 % abnahm. Es wurden signifikante Unterschiede in der Zellviabilität zwischen den getesteten Komposit-ELS, der besonders geringen Schrumpfung und den Negativkontrollzellkulturen trotz der Nicht-Zytotoxizität des Komposits beobachtet.

Die vorliegenden Daten unterstreichen die Verwendung der konfokalen Zeitraffer-Bildgebung als genaue und empfindliche Methode zur Beurteilung des Verhaltens von Gen-Fibroblasten in Kontakt mit Zahnkompositen nach ihrer Entwicklung. Diese Methode ist für Forscher auf dem Gebiet der Toxikologie eine private Möglichkeit, die Zytotoxizität und die Risikobewertung von Dentalmaterialien, Arzneimitteln, chemischen Substanzen und anderen Medizinprodukten zu erforschen.