Name: Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Lernen Sie die konfokale Zeitraffer-Mikroskopie zur Bewertung der Biokompatibilität dentaler Komposite mit menschlichen Gingivafibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung von Zellverhalten ohne Fixierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Saremco Dental Switzerland und Olympus Microsystems France Companies sind dankbar für ihre finanzielle Unterstützung. Saremco Dental wird auch für die großzügige Spende des Dentalkomposits ELS extra low shrinkage gedankt. Die Autoren möchten auch Dr. Simon Banks vom Department of Chemistry (University College London) für seine Unterstützung bei der Überarbeitung des Englischen danken.

Das Protokoll besteht aus drei Hauptschritten: Der erste Schritt umfasst die Herstellung von Composite-Extrakt in Kulturmedien; Der zweite betrifft die primären humanen Gingivafibroblasten (HGF) Zellkultur, der Kontakt der Zellen mit den Verbundextrakten und Zellfärbung; der dritte Schritt besteht in der konfokalen Abbildung und der Fluoreszenzsignalanalyse. Für Zahnfleischgewebe nehmen, wurde das Protokoll in Übereinstimmung mit Französisch Rechtsvorschriften, informierte Zustimmung und lokalen Ethikkommission genehmigt. 1. Composite Auszüge Vorbereitung Verwenden Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) als Elutionsmittel. Sicherzustellen, dass das Verhältnis zwischen der Oberfläche der Proben und dem Volumen des Extraktionsmediums ist auf der untersten Ebene der Anforderungen der ISO 10993/12. Die Vorgehensweise ist kürzlich beschriebenen 11 und skizziert im Folgenden kurz: <ol><li> Bilden kugelförmige Proben des ungehärteten Dentalkomposit mit einem maßgeschneiderten holdäh. Der Halter Größe 2 mm Radius, die in Übereinstimmung mit den allgemein empfohlen Härtungstiefe in der Mund klinischen Behandlung. </li><li> Vorbereitung Plattenvertiefungen, die jeweils 1 ml Kulturmedium (DMEM) mit 5% Mischung von Penicillin / Streptomycin und 1% Amphotericin aber ohne fötales Rinderserum (FBS). </li><li> Cure Proben innerhalb der Vertiefung mit DMEM-Medium mit einem LED-Lichtlampe mit 1070 mW cm -2 Intensität (λ = 465-475 nm) für 40 sec. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen der Spitze und Aushärtung der Proben in dem Bereich von 0,5 mm. Verwenden Sie diesen Modus, um die Härtung temporären Kontakt zwischen Zahn und dem nicht ausgehärteten Zahnverbund simulieren. In klinischen Situation tritt der Kontakt, wenn der Füllungsverbundstoff in der Mundhöhle platziert. </li><li> Proben (Proben Komposite in DMEM-Medium) bei 37 ° C unter befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO 2 in Luft. Inkubieren DMEM-Medium (ohne Mischproben) für Kontrollzellen bei den gleichen Bedingungen. </li></ol> 2. HGF Cell Culture, Composite Auszüge Prüf- und Zellen Färbung <ol><li> Wachstum und die Erhaltung von Zellkulturen Isolieren menschlichen Zahnfleisch Fibroblasten von gesunden Zahnfleischgewebebiopsien von Patienten während der Routinekieferorthopädische Extraktionen gemacht. <ol><li> Kultivieren menschlicher gingivalen Fibroblasten in DMEM in Gegenwart von 10% FBS, 5% Penicillin / Streptomycin und 1% Amphotericin B. Pflegen Zellen bei 37 ° C im Brutschrank unter einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. </li><li> Geänderte Medium alle 3 Tage, und Passage-Zellen alle 5 Tage. Nach Erreichen der Konfluenz, Ernte Zellen durch Trypsinierung. </li><li> Zentrifugenzellen bei 90 × g für 5 min und resuspendieren sie in dem Kulturmedium. Graf Zelle mit einem Zepter Hand automatisierten Zellzählers. </li><li> Samenzellsuspension mit einer Zelldichte von 2,5 x 10 4 Zellen / ml in einer Kammer Schiebersystem. Ermöglichen die Inkubation der Zellen über Nacht bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5%. </li></ol></li><li> Zugabe von Verbund Extrakte zu den Zellen in Kultur <ol><li> Ersetzen Sie die Medien aus zwei Vertiefungen der Kammer Rutsche von 1 ml der getesteten Verbund Extrakte (nach 24 h Inkubation). </li><li> Pflegen Sie die restlichen beiden Brunnen (Kontrollzellen) in den gleichen Bedingungen. </li><li> Inkubieren der Kammer Folie mit den vier Vertiefungen bei 37 ° C im Brutschrank unter einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. </li></ol></li><li> Fluoreszenzfärbung Verwenden Sie den Live / Dead Zytotoxizität Fleck für eukaryotische Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Der Bausatz bietet eine schnelle Zweifarben-Fluoreszenz-Assays, um die Lebensfähigkeit von Zellen in einer Population basierend auf der Plasmamembranintegrität und Esterase-Aktivität zu bestimmen. Der Fleck Live unterscheiden von beschädigten Zellen durch gleichzeitige Markierung mit grünem fluoreszierenden Calcein-AM zu intrazellulären Esteraseaktivität und rot-fluoreszierende Ethidium Homodimer-1 (EthD-1), um anzuzeigen, Verlust von Membran zeigene Integrität. <ol><li> Vorbereiten einer Arbeitslösung der beiden Färbereagenzien, die 2 &amp; mgr; M Calcein AM und 4 uM EthD-1 (Endkonzentration berichtet für Fibroblasten Färbung zu sein). Hinzufügen der Fleck zu den kultivierten adhärenten Zellen in der Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Verbundextrakten. </li><li> Beachten Sie direkt und schnell die gefärbten Zellpopulationen an der mindestens 15 min nach Färbung und durch den Zeitraffer-Bildgebung. Nicht schleudern und nicht die gefärbten Zellen fixe. </li></ol></li></ol> 3. Konfokale Zeitraffer Bildgebung und Signalanalyse Das verwendete System ist mit vier Diodenlasereinheiten und einer Mehr gefärbten Bildes bis zu vier Fluoreszenzfarbstoffe für jede Probe ausgestattet. Das System kann eine Zuordnung Bild (10-facher Vergrößerung), die einen Überblick über die Testprobe auf dem man sich bewegen kann, um eine Region von Interesse (600X Vergrößerung) zu beobachten gibt zuführen. <ol><li> Zeitraffer-Aufnahme <ol><li> Legen Sie die specimens (enthaltend die Kammer Schieber die gefärbten Proben) auf dem dunklen Raum des konfokalen integrierten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 und feuchter Atmosphäre). </li><li> Wählen Sie die entsprechenden Laser. Verwenden Sie die beiden Laserquellen 473 nm (15 mW) und 559 nm (18 mW) auf Calcein und EthD-1 anzuregen. </li><li> Verwenden Sie ein zwei sequentiellen Modus, um Bilder durch die Leitung Sequenzen ohne Übersprechen in der Bildgebung mit den beiden verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe zu erwerben. </li><li> Verwenden Sie einen Detektor mit einer neu entwickelten Spektrum an Bedingungen in Übereinstimmung mit dem Fluoreszenzfarbstoff in der Abtasteinheit automatisch eingestellt. </li><li> Optimierung der Bandbreiten der detektierten Fluoreszenz für jeden Kanal auf das Maximum. Notieren Sie alle Akquisitionen sequentiell um mögliche Übersprechen zu vermeiden. </li><li> Wählen Sie die am besten geeigneten Bilderzeugungsbedingungen auf der Basis der Fluoreszenzfarbstoff Auswahl mit der Erfassungssoftware. </li><li> Erwerben Sie ein Kartenbild, die automatisch von der Mitte in einem Spiralmuster erzeugt wird,mit dem interessierenden Gebiet ist leicht zur genaueren Untersuchung ausgewählt. </li><li> Wählen Beobachtungsmodus. Wählen Sie bis zu fünf Arten von Beobachtungs Modi inklusive Zeitraffer, Z-Stapel, und Multi-Bereich je nach Bedarf. Verwenden Sie eine Kombination von Z-Stapel und Zeitraffer-Modi in der vorliegenden Studie und füllen schnell die Bilderfassung, </li><li> Ändern und schalten den Fluoreszenzfarbstoff. Alternativ überlagern die fluoreszierende und das Licht kontrastreiche Bilder mit einander. Live-Bild zu beobachten mit dem ausgewählten Punkt auf der linken unteren Kartenbildschirm. </li><li> Bestimmen Sie den Imaging-Bereich mit Hilfe der Gestaltung und Zoomfunktionen. Gegebenenfalls wechseln zwischen den Anzeigen für jeden Typ von Fluoreszenz-Farbstoff. HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Mikroskop hat die gleiche Funktionalität wie ein Hoch herkömmlichen konfokalen in einem kompakten Design. Das Mikroskop ist mit umgekehrten Wasserimmersionsobjektive, die sich optimal für eine stabile Zeitraffer-Bildgebung an lebenden Zellen mit einer vereinfachten integrierten Inkubator geeignet sind ausgestattet. </li&gt; </ol></li><li> Signalanalyse und Quantifizierung <ol><li> Verwenden Sie die Bildbearbeitungssoftware, um das Fluoreszenzsignal zu quantifizieren. Erhalten fünf Kartenbilder mit dem 10X-Objektiv für beide untersuchten Probe und Zellkontrolle. </li><li> Erhalten 1.024 × 1.024 Pixel normale Bilder, mit einer 0,231 &amp; mgr; m × 0,231 &amp; mgr; m Pixelgröße. Speichern von Bildern als Olympus Format des Bildes (OIF) zur Signalanalyse. Dieses Format ermöglicht die Speicherung verschiedener Parametereinstellungen und Bilder zusammen. Verwenden Sie verschiedene Analysewerkzeuge (Messung der Intensitätsprofil, Intensitätsverhältnis zwischen den beiden verwendeten Kanäle). </li><li> Bewahren Sie die maximale Projektionsbilder als 12 Bit / Pixel TIFF-Dateien. </li><li> Preform statistischen Analysen mit dem R Commander Software. Analysieren Unterschiede mit Einwegvarianzanalyse (ANOVA) mit einer Wiederholungsprüfung. Bericht Ergebnisse als mittlere Standardabweichung (± SD) und die statistische Signifikanz bei p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben, sie haben nichts offenzulegen.

Biokompatibilität Materialverhalten ist die Voraussetzung Parameter auf, bevor die medizinische Verwendung bewertet werden. Internationale Standards decken Medizin ISO 10993 33 und speziell Dentalmaterialien ISO 7405 34. Das Fehlen der toxischen Wirkungen auf die umliegenden Zellen ist der Schlüssel Norm in der Biokompatibilität Auswertung solcher Materialien. Deshalb Zytotoxizitätstests hat eine solche Bedeutung bei der Beurteilung der Dentalmaterial Biokompatibilität 35-37. Das ISO vorgeschlagenen Prüfverfahren könnte man auf die Stoffwechselaktivität oder Membranintegrität basieren. Ausgewählte Endpunkte sollten spezielle Bedingungen für das Ranking schädliche Wirkungen durch ein Testmaterial, um die Zeit und die Kosten für die Beurteilung Assays zu minimieren induzierte folgen. Die aktuelle Methode der Untersuchung (3D konfokale Zeitraffer Bildgebung) ist Membran Integrität. Die Zytotoxizität Auswertung über diesen Endpunkt scheint ein wertvoller Marker von Zell biocompa seinträglichkeit mit getesteten Materialien und es ist auch ISO zugelassen Endpunkt. In vitro-Tests wurden entwickelt, um zu bestimmen, wie eine Materialprobe einen bestimmten Zelltyp betrifft. Die kolorimetrische MTT-Assay wurde ursprünglich von Mossman (1983) als eine nützliche Methode für die Messung der in vitro-Zytotoxizität und Zellproliferation beschrieben. Der MTT-Test basiert auf der Umwandlung von Tetrazoliumsalz in Formazan-Kristallen durch aktive Zellen, die mitochondriale Aktivität bestimmt basierend. Dies kann durch Überlebensrate 38 übersetzt werden. Gupta und Mitarbeiter berichteten, dass der MTT-Test ist der am weitesten verbreitete Methode zur Messung der Zytotoxizität Verbundharze. Succinsäure-Dehydrogenase und alkalischer Phosphatase Reaktionen wurden auch für den gleichen Zweck verwendet worden 39. Doch das Schicksal Zellen kann nicht gefolgt werden, da der MTT-Test erfordert die Zellen an jedem Messzeitpunkt zu töten. Um stärker in der aktuellen Studie überwachen das Verhalten der gefärbten Zellen, direct Beobachtung von lebenden Zellen durchgeführt wurde, dank Zeitraffer CLSM Bildgebung kombiniert mit einem kurzen Protokoll Färbung, automatisierte Bildanalyse und Fluoreszenzsignal Quantifizierung. Dentalkomposite kommen in engen Kontakt mit Mundgewebe, insbesondere Zahnfleisch und Pulpa Zellen. 41 - Fibroblasten würde das Ziel der Bauteile aus diesen Verbundmaterialien Füllungs 40 freigegeben werden. Außerdem haben mehrere Studien berichtet, dass immortalisierte Zellen und primäre Zellen können unterschiedliche zelluläre Reaktionen in Kontakt mit Biomaterialien haben. Primäre Zellen erwiesen sich als besser geeignet, um Biomaterialien Effekte 42 beurteilen zu können. Dies erklärt die Verwendung von primären menschlichen gingivalen Fibroblasten als Zellmodell für die Bewertung der Cytotoxizität der getesteten Zahnverbundmaterial in der vorliegenden Studie. Die Toxizitätspotenzial der freigesetzten Stoffe aus Dentalkomposit wurde vielfach untersucht 43-44. Um zu beurteilen, ter zytotoxisches Potential von Materialien könnten zwei Kontaktmodell Zellen durchgeführt werden. Im direkten Kontakt Modellsystem das Material direkt mit den Zielzellen gebracht, während bei der indirekten Kontaktsystem, Zielzellen in Kontakt mit Eluate aus biologischen Medien. In der klinischen Anwendung und für restaurative Verfahren, sind Dentalkomposit in indirekten Kontakt mit Zahnfleischgewebe platziert. Aus diesem Grund wurde die aktuelle Versuchsprotokoll auf dem indirekten Kontaktsystem mit menschlichen gingivalen Fibroblasten (Zellen in Gegenwart der getesteten Verbundextrakte) konzentriert. Wie zuvor von Dahl und Mitarbeiter berichteten, wurden Zytotoxizität Antworten als schwere (&lt;30%), mittel (30-60%), gering (60-90%) oder nicht-zytotoxischen (&gt; 90%), bezogen auf die Aktivität in bezug auf Platz Werte für die Steuerelemente 45 erhalten. Daher wird gemäß der Rangliste und im Lichte der erzielten Ergebnisse (Tabelle 1), Composite ELS zusätzliche geringe Schrumpfung könnte als ver sortiert werdeny leicht zytotoxische und zeigten vergleichbare Verhalten an Zellen während des gesamten Zeitablauf Zeitraum steuern. Mit dem exakt gleichen Untersuchungsmethode konnten die Ergebnisse dieser Studie mit denen von einer kürzlich veröffentlichten Studie verglichen werden. Die ELS zusätzliche geringe Schrumpfung Verbund demonstriert überlegene Biokompatibilität im Vergleich zu den beiden zuvor getesteten Komposite für die gleiche klinische Anwendung, die die direkte Wiederherstellung 11 verwendet wird. Weitere Studien sind noch notwendig, um vollständigere Vergleich zu etablieren. Bei der Entscheidung, welche Zytotoxizitätstest für einen bestimmten Endpunkt Beurteilung genehmigen, ist es wichtig, um die Vorteile und Grenzen der einzelnen Assay zu verstehen. Der Hauptzweck der konfokalen Abbildung ist, um eine 3-D-Architektur von Zellen und Organen zu erreichen. Die Technik ist in der Lage, nicht nur einer Probenoberfläche, sondern auch seine Untergrund offenbaren. Das hier beschriebene Protokoll unterstreicht die Verwendung von 3D-CLSM Zeitraffer konfokale Bildgebung, als Sensitive Methode, um die in vitro Biokompatibilität Verhalten eines Dentalverbund bewerten. Um jedoch die Einschränkungen in dieser Arbeit begegnet zu vermeiden, Anti-Vibrations-Arbeitsstationen könnten, um stabiler und länger Zeitraffer Bildgebung ermöglichen verwendet werden; Die Tischplatte kann die verwendete konfokalen Systems von den nachteiligen Wirkungen zu isolieren, daß Schwingungen im Labor verursachen. Weiterhin Materialien in der Mundhöhle verwendet werden, sollten im Idealfall unschädlich für die Zahnfleischgewebe sein und sollten keine Stoffe, die systemische Toxizität verursachen könnten. In Übereinstimmung mit der Methodik und den aus dem aktuellen Studie erhaltenen Ergebnissen kann gefolgert werden, daß die getesteten Verbund (ELS extra low shrinkage) ist in den vorliegenden experimentellen Bedingungen nicht zytotoxisch sein. Da der CLSM Verfahren feinfühlig die Anfangsrate der lebensfähigen Zellen zu geben, könnten andere Möglichkeiten vorgesehen werden, um mehrere Endpunkte beurteilen. Insbesondere, wie es wurde kürzlich berichtet, dass Verbund Monomere beeinflussen Zellen through reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 46- 48, sind weitere Untersuchungen notwendig, um Zusammenhänge zu beurteilen, wenn eine zwischen Zytotoxizität Signalnetzwerke und ROS-Produktion. Die Zukunft Protokoll könnte so gestaltet werden, gleichzeitig auszuwerten ROS-Produktion (H 2 O 2 und / oder O 2 - Färbung) und Zytotoxizität Verhältnis (Live / Dead-Färbung) mit Zeitraffer CLSM Bildgebung.

Einer der Hauptstandards in den ISO Empfehlungen angegeben werden, um die Biokompatibilität zu definieren, ist das Fehlen des Materials Zelltoxizität. Zahnärztliches Verbundstoffe können Komponenten aus der Harzmatrix, die zunächst durch teilweise Polymerisation sein können, und / oder später aufgrund von Abbauprozessen im Laufe der Zeit frei 1-4. Diese freigesetzten Komponenten in Kontakt mit oralen Gewebe kommen und kann verschiedene Nachteile wie Urtikaria und Schleimhautreaktionen 5, Entwicklung von Allergien und Überempfindlichkeitsreaktionen bei Patienten 6, Modifikationen Gingivafibroblasten Morphologie und Reduktion auf Kollagen Typ I Protein 7, Immunsuppression oder Immunstimulation auf Mitogen haben -driven Proliferation von gereinigten T-Lymphozyten und Milzzellen 8 und DNA-Schäden in primären humanen gingivalen Fibroblasten, die deren gentoxische Potenzial 9 unterstreicht. Viele Parameter können Dentalverbund Toxizität, wie der Farbton der c auswirkenomposite der Lichthärtung, die chemische Zusammensetzung des Harzes Monomer, dem Füllstoff und der Umwandlungsgrad 10- 13. Da in vitro toxische Potential der Materialien können in vivo Situationen vorherzusagen und kann zu klinischen Situationen, die von der Untersuchung einiger relevanter Endpunkte verglichen werden. Die Zytotoxizität von dentalen Kompositen und deren Komponenten wurden weitgehend unter Verwendung von Zellkultursystemen 14- 16 ausgewertet. Diese in vitro-Systeme entwickelt worden, um Dentalkompositen Biokompatibilität in der Bezeichnung der Beurteilung: Zellwachstum und Apoptose mit THP-1monocytes wie Zellen 17, Cytotoxizität in menschlichen Gingivafibroblasten 18, Entzündungspotential in HaCaT Keratinozyten wie Zellen 2, die Zellfunktionalität odontoblast- wie MDPC-23-Zellen 19, Reduzierung der Gesamt-RNA Levels und signifikante Erhöhung der Induktion der Apoptose auf die menschliche Zahnfleisch Keratinozyten 20 undDNA-Schäden auf gingivalen und Zellstoff-Fibroblasten-Zellen 21. Verschiedene Methoden werden vorgeschlagen, um die Biokompatibilität von dentalen Kompositen zu untersuchen. Kolorimetrische Assays, die spezifische Farbstoffe und Licht Adsorption Messungen beinhalten, bleiben die am häufigsten verwendet wird, die aufgrund ihrer relativen Einfachheit und niedrige Kosten 22- 26. Mikroskopie Analyse durch Lichtkontrast verbraucht häufig mehr Zeit und verursacht höhere Kosten. Jedoch haben diese Mikroskopietechniken einige wichtige Vorteile. Die Beobachtung der Zellstruktur gibt erweiterte Informationen über erfahrene toxischen Wirkungen, wodurch relevanter und sensiblen Daten. Insbesondere wurde die Einführung von Konfokalmikroskopie 27 für die Beobachtung von biologischen Strukturen mit einer Verbesserung axiale Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldabbildungsfluoreszenzmikroskopen erlaubt. Daher hat konfokale Bildgebung zu einem mächtigen Ermittlungswerkzeug in verschiedenen Bereichen derMedizin und Wissenschaft Forschungen. Im Gegensatz zu elektronischen Mikroskopie-Techniken bietet konfokalen Rastermikroskopie in der Lage, verschiedene Komponenten der Zellen durch Einbau von speziellen Fluoreszenzmarker zu visualisieren. Die meisten dieser spezifischen Tracer in einer wäßrigen Umgebung stabil ist, sinnvoll meßbar, kostengünstig und ungiftig 28, so dass ihre Verwendung in der klinischen als auch Laborforschungsstudien. Außerdem ist nicht zu Zeitraffer konfokale Bildgebung notwendig die Probe Trocknung und Fixierung für herkömmliche Elektronenmikroskopie-Analyse erforderlich ist, ist somit zeitabhängigen Erfassungs auch an Proben. Verglichen mit dem zweidimensionalen Bilderzeugungs der konfokalen Abbildungsprinzip ermöglicht eine Probenuntergrund Visualisierung und die dreidimensionale Struktur Rekonstruktion der verschiedenen erhaltenen Tiefenbilder; das dazu führen, präziser und strukturelle Details 29, 30. Die vorliegende Videostudie ist ein Beispiel für die Verwendung von dreidimensionalen Zeitraffer-Confocal Laser Scanning Mikroskopie (3D-CLSM), kombiniert mit Live / Dead Fluoreszenzmarkierung und Signal Quantifizierung als innovative Methode. Die in diesem Papier vorgestellte Technik hat den Vorteil, dass empfindliche Auswertung und Zeitraffer-Imaging lebender Zellen ohne Änderung der veranlagten Zellstruktur. Keine Vorbereitungsschritte vor konfokale Analyse erforderlich. Zuvor wurde die gleiche Färbung zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der kultivierten Spongiosa Kerne 31 aber ohne konfokale Zeitraffer folgenden verwendet. Ebenso die gleiche Zeitraffer konfokalen Verfahren wurde verwendet, um Erythromycin Zeit-kill-Aktivität zu bewerten in Bakterien von Belebtschlamm nach ihren Gram Typ 32 mit einem spezifischen Bakterien lebend / tot-Färbung. Diese Methoden wurden kürzlich angepaßt und verwendet, um die Toxizität von Dentalverbundwerkstoffen auf Basis von Methacrylat-Monomeren, 11 zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>O2/CO2 Inkubator</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>Zellinkubation</td></tr><tr><td>Live/Dead Kit</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Beiz&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS extra geringe Schrumpfung &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Dentalkomposit</td></tr><tr><td>DMEM-Medium</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Kulturmedium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td> Kammerschiebersystem <td>für Entnahmezellen</td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td> in Kulturkammer<td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Zellzähler</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Zellzählung&nbsp;</td></tr></tbody></table>

konfokale zeitraffer imaging als eine effiziente methode für die bewertung der cytocompatibility dental composites

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Es ist allgemein anerkannt, dass in vitro Zellmaterial Wechselwirkung ein nützliches Kriterium bei der Bewertung der Biokompatibilität Dentalmaterial ist. Das Ziel dieser Studie war es, 3D CLSM Zeitraffer konfokale Bildgebung verwenden, um die in vitro Biokompatibilität von dentalen Kompositen beurteilen. Dieses Verfahren liefert eine genaue und empfindliche Anzeige der Lebendzellrate in Kontakt mit Zahnverbundextrakten. Die ELS zusätzliche geringe Schrumpfung, ein Dentalverbund für direkte Restauration verwendet, wurde als Beispiel genommen worden. In vitro Beurteilung am kultivierten primären humanen gingivalen Fibroblasten mit Live / Dead-Färbung durchgeführt. Die Bilder wurden mit dem konfokalen FV10i biologischen invertierten Systems erhalten und mit der FV10-ASW 3.1 Software analysiert. Die Bildanalyse zeigte eine sehr geringe Zytotoxizität in Gegenwart der getesteten Verbund nach 5 Stunden im Zeitraffer. Eine leichte Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Kontakt mit der getesteten Verbund Extrakte Vergleichbarkeit gezeigtened zu Kontrollzellen. Die Ergebnisse unterstrich die Verwendung von 3D-CLSM Zeitraffer Bildgebung als empfindliche Methode, um die Biokompatibilität Verhalten Dentalkomposite qualitativ und quantitativ zu bewerten.

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Live / Dead gefärbten Zellen erhaltenen Mapping Bilder (10X-Objektiv) sowohl für Steuerungs- und Zellen auf die getesteten Verbund Extrakte (ELS Klein Schrumpfung) ausgesetzt. Die dreidimensionale Struktur der Zellen konnte bei der Vergrößerung 600X visualisiert werden. Visualisierung der Zellen, die in der Steuerkammer und der Zellen in der Kammer in Gegenwart der getesteten Verbund Extrakte gesammelt gesammelt, in Abbildung 2 dargestellt. Die maximale Vorsprung (Ziel 60X) zeigt das Schicksal von ausgewählten Zellpopulationen zu Beginn der Zeitablauf (bei 15 min) und am Ende des Zeitablaufperiode (5 h). Fünfzig sieben Stapel von Bildern (xyzt mod-Scan, 39 Bilder pro Stapel, Voxel-Tiefe 1,00 um) wurden in dieser Zeit erhalten. Ein leichter Rückgang im grünen Fluoreszenzsignal und sehr leichte Variation in der rot fluoreszierenden wurden in exponierten Zellen erhalten. Keine signifikante Veränderung wurde zur Kontrolle beobachtetZellen. Verbund Extrakte exponierten Zellen angenommen ähnliche Spindelmorphologie zu Kontrollzellen; Morphologie wurde bei diesen Versuchsbedingungen verändert (obwohl die grüne Signalabnahme und die rote Signalzunahme in Gegenwart der getesteten Verbund). Die Bildanalyse wurde an fünf ausgewählten verschiedenen Bildstapeln entsprechend unterschiedlichen Zellpopulationen aus den erhaltenen Bildern für die getestete Verbundgeführt, verglichen mit negativen Kontrollzellen sowohl für grüne und rote Signal. Das Intensitätsprofil der gefärbten Zellen ist in 3 dargestellt; Die grünen und roten Signal Entwicklung der Zellen in Kontakt mit der getesteten Verbund war vergleichbar mit denjenigen von Kontrollzellen. Calcein und EthD-1 Fluoreszenzemissionsintensitäten wurden auf Kontrollzellen und Verbund exponierten Zellen gemessen. Die Messung wurde in einstündigen Intervallen für bis zu fünf Stunden durchgeführt. Das grün / rote Fluoreszenz-Verhältnis (basierend auf integrierten Intensitäten des grünen 495-515 nm und Rot 620-650 nm Signale) Wurde während der Zeitraffer-Zeitraum berechnet. Die Lebensfähigkeit Verhältnissen für die Kontroll und exponierten Zellen ELS extra low shrinkage Extrakte werden in der T 1 in der Lage dargestellt ist. In der Gegenwart der getesteten Verbund wurde der Prozentsatz an lebenden Zellen gefunden, daß etwas von 100% auf 93,9% nach 1 h zu verringern Kontakt. Signifikanter Unterschied zwischen dem getesteten Composite und der Negativkontrolle (Zellen ohne Verbundextrakte) nach 5 h der angegebenen Zeitraffer Zeitraum beobachtet. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Abbildung 1: Übersicht Bild Kartierung zeigte in Gegenwart von Verbund Extrakte (ELS Klein Schrumpfung) zu Beginn des Zeitrafferperiode (t = 15 min) gefärbten Zellen bei Objektiv 10x, (A) Kontrollzellen und (B-Zellen). Grünflächen sind lebende Zellen und roten Bereiche sind beschädigte Zellen. HierinVersuchsbedingungen, keine Veränderung (sowohl für grüne und rote Fluoreszenz) wurde für Composites exponierten Zellen beobachtet, verglichen mit negativen Kontrollzellen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Abbildung 2: CLSM-Bilder am Ziel 60X einer Zellpopulation aus (A) Steuerkammer und (B) zusammengesetzte Extrakte Kammer in dem Anfang und dem Ende der Belichtung Zeitrafferperiode (I: 15 min und II: 5 h zuge ). Grünflächen sind lebende Zellen und roten Bereiche sind beschädigte Zellen. Das Panel der Bilder zeigte geringfügige Änderung der Intensitätssignal (leichte Abnahme der Grün-Signal und sehr leichten Anstieg der Rote). In Gegenwart von Verbund Extrakte wurden keine Veränderungen der Zellmorphologie beobachtet; aussetzen Zellen behielten ihre spindelförmige und fibroblastische Morphologie als Kontrollzellen. Abbildung 3: Linienprofil im Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet Zellen (A) Kontrollzellen (B) Composite-Extrakte exponierten Zellen, (I) bei 15 min und (II) bei 5 Std.. Keine sichtbare Veränderung der Grün-Signal evolution in Gegenwart der getesteten Verbund ungeachtet der Zeitkontakt. Allerdings wurde eine leichte Zunahme des roten Signals in der Gegenwart von Verbund nach 5 h von Kontakt beobachtet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Kontaktzeit (Stunde) </td><td colspan="5"> Die Lebensfähigkeit der Zellen (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Kontrollzellen </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS zusätzliche geringe Schrumpfung ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Rate lebender Zellen HGF evolution nach 1, 2, 3, 4 und 5 Stunden der Berührung mit der Verbund Extrakte Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Anfärben mit der Live / Dead Zytotoxizität Kit getestet. Die Daten zeigen Mittelwerte ± SD von fünf Bildern stapelt Analyse. Werte sind signifikant verschieden von den Kontrollzellen bei p &lt;0,05.

Die am besten untersuchten Aspekt der Biokompatibilität von dentalen Kompositen ist ihre Zytotoxizität 3D CLSM Zeitraffer Bildgebung in Kombination mit Fluoreszenzsignal Quantifizierung ermöglicht sensible Auswertung des Zellschicksals im Laufe der Zeit. Unter Verwendung dieser Methode könnte ein effizientes Werkzeug, um den cytocompatibility von dentalen Kompositen beurteilen.

Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die konfokale 3D-Laserscanning-Mikroskopie für die Zeitrafferbildgebung zu nutzen, um die in vitro Biokompatibilität von Zahnkompositen qualitativ und quantitativ zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem im zweiten Schritt zunächst sphärische Proben von nicht ausgehärtetem Zahnkomposit entnommen werden. Humane gingivale Fibroblasten werden in Gegenwart oder Abwesenheit dieser Kompositextrakte kultiviert, und dann werden die Zellen mit Lebendtotfärbung markiert.Anschließend werden Kartenbilder der Zellkulturen erstellt und Overlay-Bilder für die interessierenden Bereiche erstellt. Letztendlich können die Echtzeit-Unterschiede im Zellverhalten, die in Gegenwart oder Abwesenheit der getesteten Komposite auftreten, anhand der in den Bildern beobachteten Veränderungen der grünen oder roten Fluoreszenzsignale überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie die Echtzeitüberwachung lebender Zellen ermöglicht, ohne Veränderungen in der Zellstruktur hervorzurufen.Nach der Zellfärbung oder vor der Zeitrafferbetrachtung sind keine Fixierungs- oder Trocknungsschritte erforderlich. Um den Kompositextrakt herzustellen, verwenden Sie zunächst einen maßgeschneiderten Halter mit einem Radius von zwei Millimetern, um kugelförmige Proben des nicht ausgehärteten Zahnkomposits zu bilden. Übertragen Sie die Proben in einzelne Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte, die einen Milliliter Kulturmedium enthält, wobei darauf zu achten ist, dass einige Vertiefungen mit dem Medium für Kontrollzellkulturen in Ruhe bleiben, und ordnen Sie dann eine LED-Lampe mit einer Intensität von 1070 Milliwatt Quadratzentimeter innerhalb von 0,5 Millimetern um die Proben an.härteten die Proben 40 Sekunden lang aus, um den vorübergehenden Kontakt zwischen den Zähnen und dem unversorgten Zahnkomposit zu simulieren, und inkubierten die Kompositproben dann 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage und die Passagezellen alle fünf Tage. Nachdem die Kultur die Kofluenz erreicht hat, ernten Sie die Zellen und schleudern Sie sie fünf Minuten lang bei 90 mal G und bei 37 Grad Celsius.Resuspendieren Sie das Pellet in Kulturmedium und säen Sie die Zellsuspension nach dem Zählen der Zellen bei einer Zelldichte von 2,5 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter in einem Kammer-Objektträgersystem über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid aus. Am nächsten Morgen wird das Medium in zwei Vertiefungen des Kammerobjektträgers durch einen Milliliter der getesteten Kompositextrakte ersetzt und der Objektträger wieder in den Inkubator gelegt, um die Zellen konfokal abzubilden. Zeitraffer-Bildgebung.Markieren Sie zunächst die kokultivierten Komposit- und Kontrollzellen mit lebender toter Zytotoxizitätsfärbung für eukaryotische Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. 15 Minuten nach der Färbung legen Sie den Objektträger im Dunkeln in die konfokale integrierte Kammer unter Zellkulturbedingungen und erwärmen Sie die 473-Nanometer- und 559-Nanometer-Laser. Als nächstes stellen Sie mit einem Detektor mit einem neu entwickelten Spektrum automatisch die Abbildungsbedingungen für den 473-Nanometer-Laser ein.Verwenden Sie die Bildausschnitt- und Zoomfunktionen, um den Interessenbereich auszuwählen, und wählen Sie dann den Beobachtungsmodus aus. Wählen Sie je nach Bedarf bis zu fünf Arten von Beobachtungsmodi, einschließlich Zeitraffer-Zack und Multi-Area, und erfassen Sie dann schnell fünf Kartenbilder mit einem 473-Nanometer-Laser unter dem 10-fach-Objektiv sowohl für die Testprobe als auch für die Kontrollzellen, wenn die gewünschten Bilder aufgenommen wurden. Schalten Sie auf den 559-Nanometer-Laser um und nehmen Sie Bilder der Zelle bei der zweiten Fluoreszenz auf, wie gerade gezeigt.Alternativ können Sie die Fluoreszenz- und Lichtkontrastbilder mit dem ausgewählten Punkt auf dem X 60-Live-Bildschirm überlagern, um den Live-Bildspeicher zu beobachten. Die Kartenbilder im Olympus-Bildformat für die Signalanalyse und die maximalen Projektionsbilder betragen 24 Bit pro Pixel. TIFF-Dateien verwenden dann die verschiedenen Analysewerkzeuge, um das Intensitätsprofil des Signals und das Intensitätsverhältnis zwischen den beiden Fluoreszenzkanälen zu messen.Analysieren Sie schließlich die Unterschiede in der Signalübertragung der Fluoreszenzzellen zwischen den beiden Gruppen mit der entsprechenden Software. In diesen Kartenbildern von lebenden TED-Färbezellen in Medien allein oder mit Kompositextrakt exponiert, wurden keine Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen 15 Minuten nach dem Zeitraffer beobachtet. Hier zeigen maximale Projektionsbilder der Kontrollzellen das vergrößerte Schicksal der Zellen innerhalb der ersten 15 Minuten und fünf Stunden später, am Ende der Zeitrafferperiode, wie beobachtet, gab es keine signifikante Variation in der Fluoreszenz innerhalb der Kontrollzellen über die Inkubationszeit.Die ELS-exponierten Zellen mit extra geringer Schrumpfung nahmen eine ähnliche Spindelmorphologie wie die Kontrollzellen an, zeigten jedoch eine leichte Abnahme des grünen Fluoreszenzsignals und eine sehr geringe Zunahme der roten Fluoreszenz am Ende der Zeitrafferperiode. Das Intensitätsprofil der gefärbten Zellen ist in diesen Diagrammen dargestellt, wobei die Fluoreszenzemissionsintensitäten des Calcium-Endothel-Homodimers an Kontroll- und Komposit-exponierten Zellen in einstündigen Intervallen für bis zu fünf Stunden gemessen wurden. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Signalübertragung zwischen den beiden Kulturen beobachtet.Die Viabilitätsverhältnisse für die Kontrollzellen und die exponierten zusammengesetzten Zellen sind in der Tabelle aufgeführt. In Gegenwart des getesteten Komposits wurde festgestellt, dass der Anteil lebender Zellen nach einer Stunde Kontakt nach fünf Stunden leicht von 100 auf 93,9 % abnahm. Es wurden signifikante Unterschiede in der Zellviabilität zwischen den getesteten Komposit-ELS, der besonders geringen Schrumpfung und den Negativkontrollzellkulturen trotz der Nicht-Zytotoxizität des Komposits beobachtet.Die vorliegenden Daten unterstreichen die Verwendung der konfokalen Zeitraffer-Bildgebung als genaue und empfindliche Methode zur Beurteilung des Verhaltens von Gen-Fibroblasten in Kontakt mit Zahnkompositen nach ihrer Entwicklung. Diese Methode ist für Forscher auf dem Gebiet der Toxikologie eine private Möglichkeit, die Zytotoxizität und die Risikobewertung von Dentalmaterialien, Arzneimitteln, chemischen Substanzen und anderen Medizinprodukten zu erforschen.

confocal-time-lapse-imaging-as-an-efficient-method-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Parker, J. J., et al. Ein organotypisches Schnittkulturmodell des humanen Glioblastoms zur Untersuchung der Migration von Tumorzellen und der patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Medikamenten. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Bildgebung von Glioblastom-Gewebeschnitten, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie. Hochauflösende Bilder werden in gleichbleibenden Abständen aufgenommen, um die Bewegung und Richtung der...

Bildgebung der Migration von Tumorzellen im Glioblastomgewebe mittels konfokaler Zeitraffer-Scanning-Mikroskopie

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

In dieser Studie wird die Verwendung eines in situ-Ladevorrichtung in Verbindung mit Mikro-Röntgenstrahl-Computertomographie zur gemeinsamen Faser Biomechanik diskutiert. Experimentelle Anzeigen erkennbar mit einer Gesamtänderung der Gelenkbiomechanik gehören: 1) reaktionäre Kraft-Verschiebung, dh Zahnbewegung innerhalb der Alveole und ihre reaktionäre Antwort auf Laden, 2) drei-dimensionale (3D) räumliche Konfiguration und Morphometrie, dh geometrische Verhältnis der Zahn mit der Alveole und...

In-situ-Druckbelastung und Correlative Nichtinvasive Bildgebung des Knochen parodontalen Ligament-Zahn-Faser-Joint

Um die räumliche Entwicklung der Polymerisation Schrumpfspannung in der Zahn Harz-Komposit-Restaurationen zu verstehen, wurde Bildkorrelation zur Vollfeld-Verschiebung / Dehnungsmessung von restaurierten Modell Glas Hohlräume durch Korrelation Bilder der Restauration vor und nach der Polymerisation genommen werden.

Schwindung von Dental-Komposits in Simulierte Cavity mit digitalen Bildkorrelation Mess

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur mündlichen Biofilmbildung auf Titan und Zirkonoxid Materialien für Zahnersatz Aufbauten, einschließlich der Analyse von Bakterienzellen Lebensfähigkeit und morphologische Eigenschaften zu bewerten. Der oralen Biofilm-Analyse dient eine in Situ -Modell mit mächtigen mikroskopiertechniken verbunden.

Mündliche Biofilmbildung auf unterschiedlichen Materialien für Zahnimplantate

Wir stellen ein Protokoll für den Einsatz der faseroptischen konfokalen Lasermikroendoskopie (CLM) vor, um die räumlich-zeitliche Verteilung von Liposomen im Auge nach subkonjunktivaler Injektion nicht-invasiv zu untersuchen.

Räumlich-zeitliche In-vivo-Bildgebung von okulären Wirkstoffabgabesystemen mittels faseroptischer konfokaler Lasermikroendoskopie

Die Fluoreszenz-gestützte Identifikationstechnik ist ein praktikabler, schneller und zuverlässiger Ansatz zur Unterscheidung von Kompositharzrestaurationen von Zahnsubstanz und erleichtert die minimalinvasive und vollständige Entfernung von Kompositharzrestaurationen und Verbund-Traumaschienen.

Detektion und Entfernung von zahnfarbenem Kompositharz mittels fluoreszenzgestützter Identifikationstechnik

Diese Methode ermöglicht es, eine zahnärztliche Apparatur auf jede Probe in jedem Winkel mit standardisierter Kraft und Stabilität aufzutragen. Dieser Ansatz könnte in den Gesundheitswissenschaften ausgiebig eingesetzt werden, um die Auswirkungen von zahnärztlichen Geräten mit Handhalteelementen wie Mikromotoren, Turbinen und Ultraschall-Scalern auf unterschiedlichen Oberflächen zu standardisieren.

Einfluss des piezoelektrischen Dentalscalers auf die Rauheit von zwei unterschiedlichen fließfähigen Komposit-Füllungsmaterialien

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um das Verhalten von primären präneoplastischen Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen Brustkrebsrisiko abgeleitet, um zu bestimmen, ob es Korrelationen zwischen spezifischen Verhaltensparametern und unterschiedlichen genetischen Läsionen sind beurteilen.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Lernen Sie die konfokale Zeitraffer-Mikroskopie zur Bewertung der Biokompatibilität dentaler Komposite mit menschlichen Gingivafibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitüberwachung von Zellverhalten ohne Fixierung.

Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

Weitere Videos entdecken