Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die gleichzeitigen dreidimensionalen Verteilungen von drei zellulären und extrazellulären Biofilmkomponenten nach der Behandlung mit antibakteriellen Wirkstoffen zu quantifizieren und zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Harzkompositproben hergestellt und dann poliert werden. Im zweiten Schritt werden die interessierenden Biofilme auf den Proben gezüchtet und anschließend mit antibakteriellen Wirkstoffen behandelt.

Anschließend werden die Biofilme mit Fluorochromen für extrazelluläre polymere Substanzen, Nukleinsäuren und Proteine gefärbt und anschließend durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie abgebildet. Im letzten Schritt werden dreidimensionale Bilder der überlagerten Fluorochrome rekonstruiert, um die gleichzeitige Visualisierung der Biofilmkomponenten zu erleichtern und Strukturparameter aus den Biofilmbildern zu berechnen. Letztendlich kann eine statistische Analyse der strukturellen Parameter des Biofilms wie Biovolumen und mittlere Biofilmdicke durchgeführt werden, um die Unterschiede zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe zu vergleichen.

Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass es unterschiedliche, aber miteinander verbundene Techniken verwendet, um die Verteilung mehrerer Komponenten innerhalb der Struktur von Biofilmen zu charakterisieren, die unter bestimmten Bedingungen gezüchtet wurden. Dr. Fernando Flores, ein Postdoktorand, und Frau Kristen Smart, eine Forschungsassistentin aus meinem Labor, demonstrieren das Verfahren Um die Proben zu erstellen, beginnen Sie mit dem Platzieren eines Inkrements von 0,4 oder TPH drei Zahnharzkomposit in benutzerdefinierte hergestellte Edelstahlformen. Polymerisieren Sie anschließend das erste Inkrement mit einer LED-Lichthärtungseinheit für 40 Sekunden. Nachdem Sie den Vorgang für das zweite Inkrement wiederholt haben, verwenden Sie eine halbautomatische Schleifmaschine, um die ausgehärteten Proben auf ein akzeptables endgültiges Oberflächenfinish zu polieren.

Zum Schluss sterilisieren Sie die Proben, um den Biofilm wachsen zu lassen. Zuerst wird eine einzelne Kolonie von S-Mutanen in vier Milliliter Übernacht-Kulturmedium inokuliert und dann die Kultur 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, um eine optische Dichte von mindestens 0,9 zu erreichen. Als nächstes verdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins zu 100 in 10 Millilitern Biofilmwachstum.

Übertragen Sie die sterilen Harzkompositproben aseptisch auf sterile 12-Well-Platten und geben Sie dann 2,5 Milliliter der verdünnten Kultur in jede der Vertiefungen. Für Mundwasserbehandlungs- und Kontrollgruppen werden 2,5 Milliliter steriles, ungeimpftes Biofilmwachstum in die Sterilitätskontrollvertiefungen gegeben und dann die Biofilme bei 37 Grad Celsius unter mikroparaphilen Bedingungen auf einem Shaker bei 100 U/min gezüchtet. Nach 24 Stunden saugen Sie das Medium aseptisch aus allen Vertiefungen an und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 2,5 Millilitern sterilem PBS, wobei die Kochsalzlösung nach jedem Waschen angesaugt wird, füllen Sie dann jede Vertiefung mit 2,5 Millilitern frischem Biofilm-Wachstumsmedium auf und inkubieren Sie die Platte für weitere 24 Stunden, wie gerade gezeigt, für ein vollständiges Biofilmwachstum. Dauer von 48 Stunden nach Abschluss des Biofilmwachstums. Aspirieren Sie das Wachstumsmedium und geben Sie dann 2,5 Milliliter Mundwasser in jede Vertiefung der Behandlungsgruppe und 2,5 Milliliter steriles Reinstwasser in die Kontrollgruppe.

Rühren Sie die Platten auf einem Orbitalschüttler bei 150 U/min und saugen Sie dann nach 60 Sekunden sowohl das Mundwasser als auch das Reinstwasser aus den Vertiefungen an, um die Exopolysaccharidkomponente der Biofilme zu färben. Inkubieren Sie jeden Biofilm mit 50 Mikrolitern LOR-Konjugat für 30 Minuten bei Lichtschutz bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Proben zweimal mit 2,5 Millilitern TC-Puffer, saugen Sie nach jedem Waschen ab und färben Sie die Nukleinsäuren in jedem Biofilm mit einem 50-Mikroliter-Tropfen Cyto Nine für 30 Minuten bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.

Nach zweimaligem Waschen der Proben färben Sie die Proteinkomponenten in jedem Biofilm 30 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt mit 50 Mikrolitern Cipro rot. Nachdem Sie die Proben dreimal gewaschen haben, übertragen Sie sie in einzelne Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen, die sechs Milliliter steriles Reinstwasser pro Vertiefung enthalten, um ihre Visualisierung durch konfokale Mikroskopie zu erleichtern und Bilder jeder der Komponentenfärbungen in den Biofilmen der Behandlungs- und Kontrollgruppe zu erhalten. Stellen Sie die Laser eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops auf die folgenden Einstellungen für die Detektion von Exo-Polysacchariden durch Exor-Konjugatfärbung ein, verwenden Sie einen 633-Nanometer-Laser und eine 659- bis 749-Nanometer-Emissionsbande für die Detektion von Nukleinsäuren durch Cyto-Neun-Färbung.

Verwenden Sie einen 488-Nanometer-Laser und eine Emissionsbande von 495 bis 500 Nanometern, und verwenden Sie für den Nachweis von Proteinen durch Cipro-Rotfärbung einen 543-Nanometer-Laser und eine Emissionsbande von 615 bis 651 Nanometern. Dann mit einer 63-fach-Tauchlinse mit einer numerischen Apertur von 0,9 und einem Arbeitsabstand von 2,2 Millimetern. Erfassen Sie konfokale Laserscanning-Mikroskopiebilder bei 400 Hertz mit sequentiellem Scannen im Zwischenstapelmodus, um die Aufnahme von Bildern mehrerer Färbungen innerhalb desselben Biofilms zu optimieren.

Verwenden Sie nach der Analyse der konfokalen Laserscanning-Mikroskopiebilder die Menüoption 3D-Renderer in der Geschwindigkeitsbildanalysesoftware, um ein rekonstruiertes 3D-Bild der überlagerten Komponentenflecken in jedem Biofilm zu erstellen. Drehen Sie anschließend das 3D-Bild, um eine optimale Ansicht des Biofilms zu erhalten. Nehmen Sie dann einen Schnappschuss der Biofilmrekonstruktion auf und exportieren Sie den Schnappschuss in ein geeignetes Bilddateiformat.

Führen Sie abschließend eine visuelle Analyse der gleichzeitigen Verteilung der Nukleinsäure- und Proteinkomponenten des Exopolysaccharids innerhalb der Biofilme durch. In den rekonstruierten Bildern berechnen Sie Biofilm-Strukturparameter wie Biovolumen und mittlere Biofilmdicke mit der ISA 3D-Software. In dieser Tabelle werden die Mittel- und Standardabweichungswerte der Biofilm-Strukturparameter angezeigt, die mit der statistischen Analysesoftware berechnet wurden. Die Mittel- und Standardabweichungswerte für die strukturellen Parameter der mit Mundwasser behandelten Biofilme, die sich signifikant von denen der Biofilme in der Kontrollgruppe unterschieden, sind in roten Mischmodellen hervorgehoben.

Statistische Analysen zeigten, dass die Biotene PBF-Mundspülung Biofilmstrukturen erzeugte, die sich bei beiden Harzkompositen signifikant von denen der Kontrollgruppe unterschieden, während die Listerine Total Care Mundspülung bei keinem der beiden Harzkomposit signifikante Unterschiede hervorrief, was eindeutig auf Unterschiede in den zellulären und extrazellulären Biofilmkomponenten hinweist, die nach den beiden Mundspülbehandlungen übrig blieben. Die gleichzeitige Verteilung von Exo-Polysacchariden, Nukleinsäuren und Proteinen innerhalb der Biofilme kann durch 3D-Rekonstruktionen, die mit Hilfe von Velocity-Software erstellt wurden, visualisiert werden. In dieser Abbildung ist eine repräsentative Rekonstruktion von Biofilmen der Kontrollgruppe zu sehen, die auf 0,4 gewachsen sind, wobei die blaue Farbe dem Exo-Polysaccharid zugeordnet wurde.

Innerhalb der S-mutans-Biofilme wurde die grüne Farbe den Nukleinsäuren und die rote Farbe den Proteinen zugeordnet. Der dazwischen liegende Raum kann von Wasser oder anderen Biofilmkomponenten eingenommen werden, die nicht fluoreszenzmarkiert wurden. In dieser Abbildung ist eine repräsentative Rekonstruktion von Biofilmen der Kontrollgruppe dargestellt, die auf TPH-Drei-Harz-Kompositen gewachsen sind, wobei die Farben die gleichen Komponenten wie in der vorherigen Abbildung darstellen.

Dieses Verfahren hat Anwendung in einer Vielzahl von Disziplinen wie den Medizin-, Zahn-, Geologie- und Meereswissenschaften gebracht. Denn viele Substrate und Biofilme können die hier verwendeten substituiert werden.