Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Bei diesem Verfahren werden elektrogesponnene PCL-Gerüste auf unterschiedliche Weise aufgebaut, um ein optimales Zellsaat-Setup zu bestimmen. Zunächst werden die sterilen Gerüste in die verschiedenen zu untersuchenden Aufbauten eingesetzt, einschließlich Zellkultureinsätzen, Trögen und Bioreaktor-Rotationsgefäßen. Sobald sie an Ort und Stelle sind, wird eine bekannte Anzahl von Zellen auf das Gerüst ausgesät und dann 20 Minuten lang ungestört gelassen.

Dann werden alle Proben vorsichtig in einen Inkubator gebracht, mit 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius aufgestellt und vor Stunden statischen oder dynamischen Bedingungen ausgesetzt. Nach dieser Kulturzeit wird die Anzahl der Zellen, die sich an das Gerüst angeheftet haben, durch einen A-DNA-Assay bestimmt, um die Anzahl der Zellen in den Gerüstmedien und Well-Fraktionen zu quantifizieren. Letztendlich wird dies durch die Quantifizierung der auf dem Gerüst, der Vertiefung und in den umgebenden Medien vorhandenen DNA erreicht, um die Anheftung von Zellen an Gerüste mittels Rasterelektronenmikroskopie oder REM zu betrachten.

Wir hatten die Idee zu dieser Untersuchung, als wir wussten, dass unsere Gerüste nicht den gesamten Boden der Well-Platte abdecken, was bedeutete, dass die Möglichkeit bestand, dass nicht alle Zellen mit dem Gerüst in Kontakt kommen und sich daher anheften können. Richten Sie zunächst die Zellkultureinsätze unter Laminafluss ein, indem Sie die sterilen Zellkultureinsätze mit sechs Vertiefungen öffnen und die kürzeren Ringe mit Zähnen von den breiteren Ringkörpern trennen. Nehmen Sie dann den Ring mit den Zähnen nach oben und drapieren Sie eines der vier Zentimeter großen Gerüste über die Mitte des Rings, wobei Sie darauf achten, dass es sich auf beiden Seiten überlappt.

Nehmen Sie den Ringkörper und positionieren Sie ihn über dem Zahnring und dem Gerüst. Drücken Sie dann nach unten und achten Sie darauf, dass das Gerüst in Position bleibt und durch die Mitte der Zellkultur liegt. Einfügen. Setzen Sie den Zellkultureinsatz mit dem Gerüst in die Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und geben Sie 10 Milliliter Nährmedium in das Gerüst

Als nächstes werden Polytetrafluorethylen-Tröge in einzelne Petrischalen gegeben und 10 Milliliter Nährmedien in den Trog gegeben. Drapieren Sie eines der drei Zentimeter großen Gerüste mit einer Pinzette in den Trog und achten Sie darauf, dass seine Länge parallel zum längeren Rand des Trogs verläuft. Um den Bioreaktorbehälter unter Laminaströmung aufzustellen, geben Sie 10 Milliliter sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS durch den Hauptanschluss des Bioreaktorbehälters ab.

Entfernen Sie nach 10 Minuten das PBS und ersetzen Sie es mit einer Pinzette durch acht Milliliter Nährmedium. Setzen Sie eines der drei Zentimeter großen Gerüste über den Hauptport in das Gefäß ein. Posieren Sie dann vor dem Hauptanschluss.

Nach Durchführung der Zählung menschlicher mesenchymaler Stammzellen, wie im Textprotokoll beschrieben, aspirieren Sie das Medium aus dem Zentrifugenröhrchen, verlassen das Zellpellet und ersetzen es durch das berechnete Medienvolumen. Die Resus suspendiert die Zellen und das Medium für eine gleichmäßige Mischung. Geben Sie mit einer P 200 Gilson-Pipette langsam 200 Mikroliter Zellsuspension in jedes Gerüst ab, indem Sie die Spitze der Pipette entlang der Gerüstlänge und unter die Flüssigkeitsoberfläche des Mediums führen.

Lassen Sie es 20 Minuten lang ungestört, oder die Bioreaktorgefäße gaben 200 Mikroliter der Zellsuspension durch den Hauptanschluss ab. Füllen Sie die restlichen zwei Milliliter Nährmedium an den Spritzenöffnungen auf, um ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern zu erhalten. Übertragen Sie als Nächstes die Bioreaktorbehälter in den Rotationsgefäß-Bioreaktor und stellen Sie sie auf Rotation ein.

Übertragen Sie die Well-Platten mit Zellkultureinsätzen und -trögen bei neun U/min auf die Schüttelplatte und stellen Sie sie so ein, dass sie sich mit 30 U/min in einem 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator oder der statischen Kultur drehen. Übertragen Sie die Well-Platten mit den Zellkultureinsätzen und -trögen in die Ablage eines Zellkultur-Inkubators. Eingestellt auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach vier Stunden werden die Proben aus dem Inkubator entnommen und unter Laminaströmung gestellt. Entfernen Sie anschließend die Medienfraktionen von allen Proben und geben Sie sie in separat beschriftete Zentrifugenröhrchen. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 241 mal G entfernen Sie das Supinat, bevor Sie drei Milliliter Lysepufferwirbel hinzufügen, die Lösung zum Aufbrechen des Zellpellets, das die Gerüste in den Zellkultureinsätzen halten. Befreien Sie zuerst das Gerüst, indem Sie das Gerüst mit einem Gerüst nahe der Einsatzkante schneiden.

Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Gerüste und legen Sie sie in Zentrifugenröhrchen mit drei Millilitern Lysepuffer. Geben Sie dann drei Milliliter Lysepuffer in jedes Gerüstgefäß und kratzen Sie die Oberfläche ab. Entfernen Sie den Lysepuffer und geben Sie ihn in separat beschriftete Zentrifugenröhrchen.

Jedes Zentrifugenröhrchen etwa eine Minute lang wirbeln, um eine ausreichende Bewegung zu gewährleisten und die Lyse der Zellmembran zu fördern. Geben Sie in eine schwarze 96-Well-Platte 100 Mikroliter Lysepuffer für jedes Gerüstmedium der Probenfraktion, und geben Sie dann im Dunkeln 100 Mikroliter Zell-DNA-Lösung in alle Wells, die den Lysepuffer enthalten, und mischen Sie sie. Schonende Aufnahme von Wells mit Lysepuffer, der keine DNA und Zell-DNA-Lösung enthält, um eine Negativ- und Positivkontrolle für die Well-Platte zu ermöglichen.

Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Absorption der Wells bei 485 Nanometer Anregung und 520 Nanometer Emission. Vergleichen Sie die Daten mit der Standardkurve, die aus den DNA-Standards gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Durchführung der REM-Fixierung generiert wurde. Nach vierstündiger Inkubation nehmen Sie alle Gerüste aus ihren Behältern und platzieren Sie sie in getrennten Vertiefungen mit einer neuen Platte mit sechs Vertiefungen und einer Laminaströmung.

Waschen Sie dann die Gerüste jeweils zweimal mit PBS. Nun, fügen Sie zwei Milliliter 1,5 % Glutaraldehyd in PBS hinzu, um eine vollständige Abdeckung auf dem Gerüst zu gewährleisten. Lassen Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius stehen, um die Cel zu fixieren.

Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Gerüste zweimal mit PBS. Übertragen Sie dann die Gerüste in eine neue Bohrlochplatte, um sie mit steigenden Ethanolkonzentrationen in destilliertem Wasser zu dehydrieren, beginnend mit 50 % Ethanol, gefolgt von 70 % und dann 90 % für jede Konzentration. Tauchen Sie die Gerüste vollständig in die Lösung und lassen Sie sie drei Minuten einwirken, bevor Sie die Lösung verwerfen und den Vorgang wiederholen.

Sobald Sie die Gerüste in 100%igem Ethanol dehydriert haben, indem Sie die Gerüste vollständig in Lösung tauchen und fünf Minuten lang stehen lassen, entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Gerüste chemisch erneut. Verwendung von HMDS in einem Abzug. Tauchen Sie die Gerüste in HMDS und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen, bevor Sie das HMDS nach einmaligem Wiederholen entfernen.

Entfernen Sie das HMDS und lassen Sie die Gerüste trocknen. Montieren Sie dann die Gerüste auf handelsübliche REM-Stummel, um die Betrachtung innerhalb der REM-Schicht zu erleichtern, und versehen Sie die Proben zwei Minuten lang mit einem Gold-Tucker-Coat, um eine dünne und gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten. Platzieren Sie abschließend die Proben im REM und visualisieren Sie die zellsitzenden Gerüste mit einem fünf Kilo großen Elektronengewölbe-Elektronenstrahl.

Die Ergebnisse zeigen die Position der Zellen vier Stunden nach der Aussaat für jeden untersuchten Versuchsaufbau. Diese Abbildung zeigt den Prozentsatz der Zellen, die sich während dieser Zeit, in der alle untersuchten Seeding-Setups an der Gerüstoberfläche festgesetzt haben. Der Prozentsatz der Zelladhäsion ist relativ gering, aber die größte Zelladhärenz für Gerüste, die in Zellkultureinsätzen gehalten und bei 30 U/min geschüttelt werden.

Die geringste Adhärenz war bei Gerüsten zu verzeichnen, die in den Zellkultureinsätzen gehalten und unter statischen Bedingungen aufbewahrt wurden. Eine große Anzahl von Zellen war in der Medienfraktion vorhanden, vor allem für die Zellkultur. Einsätze, die bei 50 % in niedrigen Bindungsplatten gehalten wurden, und rotierende Gefäße bei 51 %, Gerüste, die in den Trögen gehalten wurden, zeigten eine erhöhte Anzahl von Zellen, die im Halter selbst vorhanden waren.

48% für Trogschüttler und 50% für statisches Trocknen. Die Elektromikroskopie ermöglichte eine visuelle Beurteilung der mit Zellen bestückten Gerüste. Repräsentative Bilder zeigten ein begrenztes Vorhandensein von Zellen auf der faserigen Oberfläche, unabhängig von der Aussaat.

Eine größere Anzahl von Zellen und Zellagglomeraten war jedoch auf den Gerüsten vorhanden, die in Zellkultureinsätzen gehalten und bei 30 RP M geschüttelt wurden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, dass die Aussaat einer bekannten Anzahl von Zellen nicht unbedingt mit so vielen Zellen gleichzusetzen ist, die sich tatsächlich an das Gerüst anheften, insbesondere bei Gerüsten, die nicht die gesamte Basis der Wildplatten bedecken. Für Gerüste wie diese empfiehlt es sich, zunächst verschiedene Cell-Seeding-Setups zu optimieren, um die anfängliche Zellanheftung an das Scaffold zu maximieren.