Name: Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Lernen Sie die Optimierung der Zellanheftung von humanen mesenchymalen Stammzellen auf elektrogesponnene PCL-Garnscaffolds unter statischen und dynamischen Bedingungen. Diese Methode maximiert die initiale Zelladhäsion für Gewebeengineering-Anwendungen.

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Die Autoren bedanken sich für die Finanzierung dieser Forschung Dank und Anerkennung des Medical Research Council - MRC-FAP Zuschuss Code G1000788-98812.

1.Scaffold Herstellung und Sterilisation <ol><li> Löse PCL in 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol, um eine 10% w / v-Konzentration zu ergeben. Dar. Wie in Bosworth et al, 9 elektrospinnen Polymerlösung (Parameter: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm) beschrieben und sammeln ausgerichteten Fasern auf dem Rand einer rotierenden Dorn (600 rpm). Mit einem Skalpell entfernen Sie das Farbband der gesammelten Fasern und dann schneiden Sie in kürzeren Längen - 3 cm (für Mulden und Rundgefäße) und 4 cm (für die Zellkultur-Einsätze) Längen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette tauchen einzelnen Streifen in destilliertem Wasser, und entfernen. </li><li> Halten Sie beide Enden zwischen Daumen und Zeigefinger; manuell drehen Sie den Streifen bis es ähnelt Faden. </li><li> Kurz tauchen diese fadenförmigen Gerüst in destilliertem Wasser und setzen auf saubere, nicht-faserförmigen Karte, um zu trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen statt einzeln in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml 50% v / v Ethanol in destilliertem Wasser. Schließen Sie den Deckel und lassen für 24 Std. Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter Laminar Flow: </li><li> Zeigen Mikrozentrifugenröhrchen in einer Sterilbank und saugen Sie den 50% v / v Lösung. Ersetzen mit 1 ml 70% v / v Ethanol in destilliertem Wasser, in der Nähe Deckel und lassen für 24 Stunden. </li><li> Wiederholung für 90% und 100% v / v Ethanol in destilliertem Wasser (1 ml Volumen). </li><li> Waschwarten zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 24 Stunden pro Waschung (2 × 1 ml). </li><li> PBS entfernen und ersetzen mit 1 ml Zellkulturmedien. Hinweis: Gerüste sind gebrauchsfertig nach dem 24-Stunden. </li></ol> 2. Bestimmen Gerüst Fläche und Anzahl der Zellen <ol><li> Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, den Durchmesser der elektrogesponnenen Garns entlang seiner Länge, um einen Mittelwert zu bestimmen. </li><li> Nehmen wir den Faden, um eine zylindrische Stange und den Oberflächen-Bereich mit: </li><li> A = Fläche, r = Radius und h = Länge Anmerkung: Die Oberfläche wurde berechnet, um 18.902 sein, 800 &amp; mgr; m 2. Ferner sei darauf hingewiesen, dass die tatsächliche Oberfläche größer sein wird als dieser Berechnung, wenn das Garn von Hunderten von feinen Fasern, die den Oberflächenbereich zu vergrößern wird zusammengesetzt sein. Folglich ist eine größere Anzahl von Zellen in der Lage, um das Gerüst zu befestigen. Allerdings bedeutet dies keine Auswirkungen auf einen direkten Vergleich zwischen den Testgruppen gemacht. </li><li> Bestimmung der maximalen Anzahl von Zellen, die an der freiliegenden Gerüstoberfläche anbringen könnte: Hinweis: Die Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, wurde der Durchmesser der humanen mesenchymalen Stammzellen bestimmt zu sein, 20 um (vorausgesetzt Zellen rund sind), also in diesem Fall, die Anzahl der Zellen = 60.200. </li></ol> 3. Gerüst Set-up - Zellkultureinsätze (1A) <ol><li> Unter laminaren Strömung, öffnen Sie die sterile 6-Well-Zellkultur-Einsätzen und trennen Sie die kürzeren Ringe mit Zähnen aus den breiteren beringten Körper. </li><li> Nehmen Sie den Ring mit den Zähnen nach oben. Hängen Sie einder 4 cm Gerüste über die Mitte des Rings sicherstellen, dass es Überschneidungen auf beiden Seiten. Nehmen Sie den beringten Körper und Position über dem Zahnkranz und Gerüst und nach unten drücken um sicherzustellen, das Gerüst bleibt in Position und liegt in der Mitte des Zellkultureinsatzes. </li><li> Setzen Sie den Zellkultureinsatz mit Gerüst in die Vertiefung einer 6-Well, niedrige Bindungsplatte. </li><li> 10 ml Kulturmedien zum Schafott. </li></ol> 4. Gerüst Aufbau - Trough (1B) <ol><li> Unter laminaren Strömung statt Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Tröge in einzelne Petrischalen und 10 ml Kulturmedien, um den Trog. </li><li> Mit einer Pinzette drapieren eine der 3 cm Gerüsten in den Trog, um sicherzustellen, ihre Länge liegt parallel zur längeren Kante der Mulde ist. </li></ol> 5. Gerüst Aufbau - Bioreaktor Fahrzeug (1C) <ol><li> Unter laminaren Strömung, verzichten 10 ml sterilem PBS durch den Bioreaktor SchiffesHaupthafen und lassen für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die PBS und ersetzen mit 8 ml Kulturmedien. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine der 3 cm Gerüste in den Behälter über den wichtigsten Hafen. </li><li> Schließen Sie den Haupthafen. </li></ol> 6. Zellzählung <ol><li> Kultur menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus dem Knochenmark nach Herstellerprotokoll bis zu Durchgang 4 vor der Ernte ab. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einer 75 cm 2 Kolben mit hMSCs aus dem Knochenmark (Durchgang 4, 80% Konfluenz) abgeleitet. </li><li> Mit 10 ml sterilem PBS und saugen Waschen Sie die Zellen. </li><li> 3 ml Trypsin und der Kolben wird bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen aus dem Kolben Oberfläche verdrängt. </li><li> 7 ml Kulturmedium, um das Enzym zu inaktivieren, und übertragen diese Gesamtvolumen (10 ml) in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Resuspendieren diese Zellsuspension durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um homogen zu dispergieren Zellen innerhalb derMedien und Grenze Zellagglomerate (10 ml Pipette). </li><li> Entfernen 20 ul der Zellsuspension und in ein Hämozytometer. </li><li> Stellen Sie das Hämocytometer unter einem Lichtmikroskop und Bild an x10 Ziel. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Rasterlinien und die Anzahl der Zellen in den 4 x 4 Plätze in jeder Ecke des Rasters und die innerhalb des Platzes fallen und die, die den rechten oder unteren Grenzlinie überqueren. Count für jeden Satz von 4 x 4 Plätze (4 Zählungen pro Netz). </li><li> Wiederholen Sie die Aufwirbelung und Zellzahl dreimal (Schritte von 6,6 bis 6,9). </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellzahl und bestimmen die Lautstärke für die Zell Aufwirbelung (Zellkonzentration 60.200 in 200 ul) erforderlichen Medien. Beispielsweise bestimmen die durchschnittliche Zellenanzahl aus dem Hämocytometer und dann bestimmen die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen aus den drei getrennten Zählungen. Multipliziert mit 1 x 10 4 bis Anzahl der Zellen pro ml und dann multiplizieren mit dem Gesamtvolumen der Zellsuspension zu geben, geben,tal Anzahl der Zellen. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um Volumen für Aufwirbelung erforderlichen Medien zu bestimmen: </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 241 xg für 5 min. </li></ol> 7. Zellaussaat <ol><li> Saugen Sie das Medium aus dem zentrifugierten Rohr Verlassen des Zellpellet und ersetzen mit dem berechneten Mediavolumen. </li><li> Die Zellen und Medien für eine ausgeglichene Mischung. </li><li> Mit einem P200 Gilson Pipette langsam verzichten 200 ul der Zellsuspension auf jedem Gerüst, indem Sie die Spitze der Pipette entlang der Gerüstfeldlänge und unterhalb des Medienflüssigkeitsoberfläche. Lassen Sie ungestört für 20 Minuten. </li><li> Für Bioreaktorgefäße, verzichten 200 ul der Zellsuspension durch den Haupthafen. Top-up die restlichen 2 ml Kulturmedium über die Spritze Ports, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben. </li></ol> 8. Experimentelle starten <ol><li> Übertragen Sie die Bioreaktorgefäße zum RCCS-4DQ Bioreaktor und soll bei 9 min drehen. </li><li> TranSFER die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf die Rüttelplatte und soll bei 30 Umdrehungen pro Minute drehen. </li><li> Übertragen Sie die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf dem Regal eines Zellbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 (statische Kultur) eingestellt. </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Bereiten Lösungen - Lyse-Puffer, 1x TE-Puffer, DNA-Standards und Zell-DNA Arbeitslösung - nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach 4 Stunden, entfernen Sie die Proben aus dem Inkubator und legen unter Laminar Flow. </li><li> Entfernen Sie die Medien-Fraktionen aus allen Proben und legen in getrennt bezeichneten Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 241 x g. Entfernen Sie den Überstand und 3 ml Lyse-Puffer. Resuspendieren die Lösung für das Aufbrechen des Zellpellets. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Gerüste und in Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Lyse-Puffer (für die Gerüste in den Bioreaktor Gefäße, entfernen Sie das Gerüst vor dem Ansaugen der michdia). Für Gerüste im Zellkultureinsätze statt, zunächst das Gerüst frei, indem das Gerüst in der Nähe des Einsatzes Rand mit einem Skalpell. </li><li> 3 ml Lyse-Puffer zu jedem Gerüstbehälter und kratzen die Oberfläche (heftig bewegen für die Bioreaktorgefäße). Entfernen Sie den Lysepuffer und legen in gesondert gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex jedem Zentrifugenröhrchen ca. 1 min auf eine ausreichende Bewegung der Zellen sicherzustellen und den Puffer und zur Lyse der Zellmembran zu fördern. </li><li> In einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen, fügen Sie 100 ul Lysepuffer für jede Probe Bruch - Gerüst, Medien und auch (duplizieren). </li><li> In der Dunkelheit, fügen Sie 100 ul der Zell-DNA-Lösung in jede Vertiefung Lysepuffer und vorsichtig mischen. </li><li> Umfassen Vertiefungen mit Lysepuffer, keine DNA und Zell-DNA-Lösung, um eine negative und positive Kontrolle für die Well-Platte bereitzustellen. </li><li> Mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenleser, die Absorption des guts mit 485 nm Anregungs- und 520 nm Emissions. </li><li> Vergleichen Sie die Daten mit der Standardkurve aus den DNA-Standards nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. </li></ol> 10. Rasterelektronenmikroskop (SEM) Fixation <ol><li> Führen Sie folgende Schritte unter Laminar Flow: Nach 4 Stunden, entfernen Sie alle Gerüste aus ihren Aufnahmen und innerhalb eines neuen 6-Well-Platte (getrennte Wells). </li><li> Zweimal mit PBS waschen Gerüste. </li><li> Führen Sie folgende Schritte auf dem offenen Bank: Zu jeder Vertiefung 2 ml 1,5% v / v Glutaraldehyd in PBS, um eine vollständige Abdeckung des Gerüstes zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 4 ° C für die Zellfixierung. </li><li> Entfernen Sie die Fixierungslösung und waschen Sie die Gerüste zweimal mit PBS. </li><li> Dehydratisieren die Gerüste mit steigenden Konzentrationen von Ethanol in destilliertem Wasser mit 50% v / v, gefolgt von 70% v / v und 90% v / v. Für jede Konzentration, die Gerüste in solutio voll eintauchenn (2 ml) und lassen Sie für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Entwässern in 100% Ethanol durch die vollständige Eintauchen in die Gerüste Lösung (2 ml) und lassen für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Chemisch trocknen die Gerüste mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in einem Abzug. Tauchen Sie die Gerüste in HMDS (2 ml) und lassen Sie für 5 min. Entfernen Sie die HMDS und wiederholen. </li><li> Entfernen Sie die HMDS und lassen Sie die Gerüste zum Trocknen. Montieren Sie die Gerüste auf handelsüblichen SEM Stubs (in diesem Fall Edelstahlstutzen mit Klebstoff Kohlenstoff Tabs). </li><li> Zur Erleichterung der Anzeige innerhalb des SEM, Mantel werden die Proben mit einem Gold Sputteranlage für 2 Minuten, um eine dünne und gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. </li><li> Prüfmuster im SEM und visualisieren die Zellaussaat Gerüste mit einem 5 keV Elektronenstrahl. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Elektro Fasermatrizen aus Biopolymeren hergestellt werden regelmäßig verwendet, um die Zellhaftung und Proliferation zu Biomaterial und / oder Tissue-Engineering-Anwendungen 11,12 unterstützt. In diesen Fällen sind die Matrizen oft dünne Blätter aus Fasern, die leicht bedecken die gesamte Basis einer Zellkultur-Well-Platte und sind somit in vollständigen Kontakt mit ausgesäten Zellen, welche die Zellhaftung verbessert. Wenn jedoch die von Biomaterialien, nicht vollständig die Basis der Platte mit Vertiefungen zu bedecken, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein Großteil der angesiedelten Zellen werden nicht in Kontakt mit dem Gerüst zu bleiben und letztendlich nicht in der Lage zu befestigen. Diese Studie untersuchte verschiedene Vorgehens Impfen von Zellen auf Gerüsten, die nicht decken die Basis der Platte mit Vertiefungen, um ein optimiertes Verfahren, das für zukünftige zellbasierten Experimenten empfohlen werden könnte bestimmen. Fünf verschiedene Set-ups untersucht (Abbildung 1): scaffolds (elektro Garn) statt mit Zellkultur-Einsätzen in geringen Bindungs ​​Well-Platten und entweder unter statischen Bedingungen gehalten oder bei 30 Upm geschüttelt; Gerüste in engen PTFE Wannen und hielt statisch oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt; und Gerüsten innerhalb Bioreaktorgefäße 9 UpM untergebracht. Bestimmen der Anzahl von Zellen, die an die elektro Garne durch DNA Assay halten hatten gezeigt, ein geringer Prozentsatz der Befestigung für alle Impfen Aufbauten (Abbildung 2); und dies wurde weiter aus rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (SEM) (Abbildung 3) bestätigt. Greatest Zellhaftung - 30% bzw. ~ 18.060 Zellen -wurde für Garne, die in Zellkultur-Einsätzen gehalten und zu einer kontinuierlichen Bewegung unterzogen wurden nicht beobachtet. Interessanterweise wurde niedrigsten Zellanheftung (15%) für Garne von Zellkultureinsätzen gehalten, sondern unter statischen Bedingungen gehalten wird, die darauf schließen ließen, dass die Aufnahme von Radialbewegung hat einen positiven Effekt auf halten Zellen in Kontakt mit dem Gerüst erreicht. Jedochist darauf hinzuweisen, dass eine kontinuierliche kreisFluss der Medien kann für die aus den REM-Aufnahmen beobachtet Zellagglomerate verantwortlich sein werden. Die Rüttelplatte auf die niedrigste Einstellung gesetzt - 30 Umdrehungen pro Minute - das ist eine Einschränkung zu diesem Set-up sein könnte. Mit einem langsameren radiale Bewegung kann helfen, zu verhindern oder zu reduzieren Zell Agglomeration und könnte auch zu verbessern Zellhaftung als Zellen weniger Kraft zu erleben. Zukünftige Experimente sollten sich auf die Optimierung der ideal-Geschwindigkeit für eine verbesserte Zellhaftung zu konzentrieren. Die Einbeziehung Bewegung für Garne innerhalb der Rinnen gehalten nicht in einem ähnlichen Trend ergeben, wobei beide Szenarien ergeben 18% Befestigung (~ 10.836 Zellen); wenn dies aufgrund der teilweisen Flotation der Gerüste innerhalb der Rinnen sein, da sie nicht an der Basis verankert ist (bei Mulden auf der Rüttelplatte platziert beobachtet). Teil Floating des Gerüsts werden alle Zellen, die zu dem Boden des Troges aus in Kontakt mit dem Material und anhaftende versenkt verhindern. Für tseinen besonderen Aufbau, der Trog in eine Petrischale untergebracht ist und insgesamt 10 ml Mediumvolumen aufgenommen. Die kleinen Abmessungen der Mulde so dass die Mehrzahl der Medien innerhalb der Petrischale vorhanden ist, und wenn es irgendeine Bewegung, können Zellen von der Rinne in die Petrischale Drift und bleiben vollständig unzugänglich des Gerüsts. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sollten weitere Experimente einen zusätzlichen Schritt in dem Protokoll ist, wobei die Enden der Gerüste sind an der Basis der Mulden mit sterilen feinen Nadeln fixierten umfassen, da dies ihre Flotation und Bewegung (insbesondere bei Gerüsten ausgesetzt wird Radialbewegung), die letztlich zu einer erhöhten Anzahl von Zellen, die Befestigung am Gerüst führen. 16% der Zellen, die innerhalb der Drehgefäßen vorhanden Garne beigefügt hatte. Obwohl es eine gut etablierte Technik für 3D-Kultur, hat Probleme mit dem Abbau von Gerüsten vom Haupthafen der Schiffe, die in lose attac geführt hat ergebenhed Zellen verloren gehen. Die Schiffe, die vollständig geöffnet werden würde, dieses Problem zu beseitigen; diese sind erhältlich, sind jedoch erheblich teurer als die Einweggefäße in dieser Studie verwendet. Diese Studie zeigt die aktuellen Probleme mit der Aussaat Gerüste, die nicht die gesamte Basis von Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. Impfen eines bekannten Zellzahl ergab weniger als ein Drittel Befestigung an dem Gerüst, trotz der Gerüstoberfläche, die auf allen Zellen anhaften. Dies kann nachteilige Auswirkungen auf andere zellbasierten Assays, die die Biokompatibilität und Zellmaterial / Zell-Zell-Verhalten und Wechselwirkungen mit dem Gerüst als mögliche zukünftige medizinische Vorrichtung beurteilen kann. Weitere Einschränkungen der Studie kann die 4 Stunden Zeitpunkt sind - obwohl sie lange genug, um anfängliche Zellaussaat zu gewährleisten (Zellen wurde gezeigt, fest an Substraten anzubringen innerhalb 30 Minuten 13,14,15), kann es sinnvoll sein, investigate späteren Zeitpunkten Bereitstellung von Zellen nicht über einen längeren Zeitrahmen vermehren, da dies sonst neigen die Anfangszellzahl. Reduzieren des Volumens der Medien, in diesem Fall 10 ml, könnte auch der Kontakt zwischen den Zellen und Gerüst zu verbessern und letztlich zu erhöhen Zellanheftung. Zukünftige Studien sollten auch die Lebensfähigkeit der Zellen betrachten, da der Prozess der Zellaussaat können Zellschäden und / oder Zelltod 16 verursachen. Zell-DNA-Assays nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen zu differenzieren, die als solche eine lebend / tot-Assay, beispielsweise das Niveau der Lebensfähigkeit markieren würde. Diese Untersuchung schärft das Bewusstsein der tatsächlichen Anzahl von Zellen, die zum Schafott legen trotz der Aussaat eine bekannte Menge. Für Studien, die in der Start Anzahl der Zellen zu verlassen, ist es sehr wichtig, dass die Forscher genau, wie viele dieser Figur in der Tat auf dem Substrat haften von Interesse zu tun.

Gerüste werden regelmäßig weiterentwickelt und für Biomaterialien und Tissue-Engineering-Anwendungen untersucht. Als solche sind sie allgemein mit Zellen und ihre in vitro-Verhalten über Tests, die Zellproliferation und Zellzahl zu bestimmen, beispielsweise dadurch ausgesät. Für Experimente, wie diese, ist es zwingend erforderlich, dass die anfängliche Zellzahl bekannt ist und Forscher Staat häufig die Seeding-Konzentration in Bezug auf die Anzahl der Zellen pro ml oder cm 2. Dies ist zwar eine gute Praxis, insbesondere für Scale-up-Zwecke, ist es nicht für die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an die Gerüstoberfläche (die auch abhängig von den Klebeeigenschaften der Biomaterialoberfläche 1) haften ausmachen. Dies gilt insbesondere für Gerüste, die nicht die gesamte Basis der Zellkultur-Well-Platte abdecken als Zellen vom Konstrukt fallen könnten und aufgrund der oft statische Natur des Experiments kann nie in Kontakt mit dem Material der inte zurückkommenRuhe. Elektrofasergarne sind ein gutes Beispiel für ein Gerüst, das nicht den Boden der Vertiefung (1A) umfasst. In diesem Fall sollte eine niedrige Bindungs ​​Well-Platten, die nicht oberflächenbehandelt wurden verwendet, um Zellen von der Befestigung an der Plattenoberfläche und somit die Ergebnisse verzerrt jedes gut basierten Assay zu verhindern. Well-Platten sind leicht zur Zellbesiedelung verwendet, auf Gerüsten, aber sie sind nicht die einzige Methode zur Verfügung. Rotary Zellkultursysteme, eine Art Bioreaktor durch den Lebenswissenschaften bei der NASA in den späten 1980er Jahren entwickelt wurde, können auf ähnliche Weise verwendet werden, um Gerüste in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung mit simulierten Mikrogravitation zu impfen. Diese Art der Bioreaktor bleibt eine beliebte Wahl mit Forschern weltweit und wurde in Studien zur Zellsignal 2,3 aufgenommen, Stammzellen und Tissue Engineering 4,5 6,7. Was macht den Dreh Bioreaktor vorzuziehen, Well-Platten ist die Aufrechterhaltungeiner 3D-Umgebung, was dazu beiträgt, differenzierten Zellen Entdifferenzierung vermeiden, wie es oft der Fall, wenn in herkömmlichen 2D-Bedingungen 8 kultiviert. Dieser Aufsatz untersucht verschiedene Techniken zur Aussaat humanen mesenchymalen Stammzellen auf elektro Poly (ε-caprolacton) Fasergarne wie in Bosworth et al., 9, um die anfängliche Anzahl von Zellen Befestigung an dieser Gerüste innerhalb von 4 Stunden-Zeitraum zu maximieren hergestellt. Für 2D-Kultur wurden Fäden sicher in Well-Platten oder maßgeschneiderte Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Mulden gehalten und unter statischen Bedingungen gehalten, oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Für 3D-Kultur wurden Garne und Zellen im Bioreaktor Gefäße 9 UpM gehalten.

<table><tbody><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>Inhouse-Versorgung</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Humane mesenchymale Stammzellen</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC Nährmedien</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Vor Gebrauch auf 37 oC erwärmt</td></tr><tr><td>Ergänzungsmischung</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Zu Nährmedien hinzufügen</td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimyotika-Mischung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Zu Nährmedien hinzufügen</td></tr><tr><td>Trypsin (0,05%) EDTA (0,02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Erwärmt auf 37 &#176; C vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit geringer Bindung</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 50 ml tief</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Tröge</td><td>aus eigener Produktion</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-RCCS Gefäße 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Gefäße Rotary Zellkultursystem Bioreaktor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelplatte</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Einweg C-Chip</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901 15</td><td>ml und 50 ml</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 und 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson Pipetten</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro Reagenzglas 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay-Aufbau im Dunkeln</td></tr><tr><td>Schwarz 96-Well-Platte</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzplatten-Reader</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Hergestellt mit einer Konzentration von 1,5 % v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazan (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium-Stubs (REM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Kohlenstoff-Tabs (REM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold-Sputter-Coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop (REM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der befestigung der humanen mesenchymalen stammzellen auf poly (ε-caprolacton) elektrogesponnene garne

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Erforschung von Biomaterialien und Tissue Engineering umfasst oft zellbasierten In-vitro-Untersuchungen, die ersten Kenntnisse der Ausgangszellzahl erfordern. Während die Forscher üblicherweise Referenz ihrer Einsaatdichte dies nicht notwendigerweise die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an das betreffende Material anhaften. Dies ist insbesondere für Materialien oder Gerüste, die nicht die Basis des Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. In dieser Studie wird die anfängliche Befestigung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einer bekannten Anzahl an elektrogesponnen Poly (ε-caprolacton) Garn nach 4 h in Kultur angeimpft. Elektrogesponnene Garne wurden in verschiedenen Aufbauten gehalten, einschließlich Bioreaktor Gefäße auf 9 Upm Zellkultureinsätze in geringen Bindungs ​​Well-Platten und Polytetrafluorethylen (PTFE) Gräben von Petrischalen platziert positioniert dreht. Die beiden letzteren wurden entweder statischen Bedingungen auf einer Rüttelplatte ausgesetzt oder aufgestellt (30 bei 37 ° C, 5% CO 2 wurde die Position der ausgesäten Zellen durch Zell-DNA-Assay bestimmt. Gerüste wurden aus ihren Behältern entfernt und in Lysepuffer gelegt. Die Medien-Fraktion wurde entfernt und in ähnlicher Weise zentrifugiert - der Überstand verworfen und Pellet mit Lysispuffer gebrochen. Lyse-Puffer wurden zu jedem Gefäß oder hinzugefügt, so, und abgeschabt, um alle Zellen, die vorhanden sein können, zu befreien. Das Zell-DNA-Test bestimmt den Prozentsatz an Zellen innerhalb des Stützgerüsts vorliegen, Medien und auch Fraktionen. Zellhaftung gering war für alle Versuchsanordnungen, mit größter Anlage (30%) für Garne in Zellkultur-Einsätzen gehalten und Schüttelbewegung unterzogen. Diese Studie sensibilisiert auf die tatsächliche Anzahl von Zellen verbundenen, unabhängig von der genannten Zellansiedlungsdichte Warten.

Die Ergebnisse unterstreichen die Position der Zellen nach 4 Stunden nach der Aussaat für die einzelnen Versuchsaufbau untersucht. 2A zeigt den Prozentsatz an Zellen, die in dieser Zeit zum Schafott Oberfläche angebracht haben. Ein Umwandlungsfaktor von 8,5 pg / Zelle wurde verwendet, um die gemessene DNA-Gehalt in der Zellzahl umzuwandeln und somit den Prozentsatz der Zellen 10. Für alle Aussaat Aufbauten untersucht, ist der Prozentsatz der Zellhaftung relativ gering, mit größten Zellhaftung (30%) für Gerüste in Zellkultur-Einsätzen gehalten und bei 30 Umdrehungen pro Minute (Insert Shaker) erschüttert. Niedrigster Halten (15%) war für Gerüste in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und unter statischen Bedingungen (Statischer Insert) gehalten. Eine große Anzahl von Zellen innerhalb des Medienfraktion (2B) vorhanden waren, vor allem für die Zellkultur-Einsätzen innerhalb niedrige Bindungsplatten (Static Insert) und rotierenden Gefäßen gehalten wobei 50% bis 51%jeweils. Gerüste innerhalb der Rinnen gehalten zeigten eine erhöhte Anzahl von Zellen in dem Halter selbst vorhanden - 48% der Zellen, die für Trough Shaker und 50% für Trough Static. Rasterelektronenmikroskopie erlaubt eine visuelle Beurteilung der Zellaussaat Gerüste (Abbildung 3). Repräsentative Bilder markiert eine begrenzte Anwesenheit von Zellen auf der Faseroberfläche, unabhängig von der Aussaat Set-up. Jedoch eine größere Anzahl von Zellen und Zell Agglomerate auf den Gerüsten in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und mit 30 UpM (Shaker Insert) geschüttelt vorhanden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg"> Abbildung 1. Versuchsanordnungen, in denen Elektrogesponnene Garne innerhalb Besitz; (A) Zellkultur-Einsätze und niedrige Bindungs ​​Well-Platte, (B) Poly (tetrafluorethylen) (PTFE) Trog und Petrischale; und (C) Bioreaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg"> Abbildung 2. Position der Zellen 4 Stunden nach der Aussaat auf PCL Elektrogesponnene Garne mit verschiedenen Seeding Set-ups. (A) Zeigt den Prozentsatz an Zellen, die mit dem PCL-Gerüst angebracht haben (Mittelwert ± Standardabweichung), (B) verdeutlicht die prozentuale Verbreitung des Zellenposition innerhalb der drei Fraktionen - Medien, gut und Gerüst (n = 4, Daten vorgestellt Mittelwerte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig3.jpg" files ftp_upload> Abbildung 3. Repräsentative Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen für PCL Elektrogesponnene Garne mit humanen mesenchymalen Stammzellen, 4 Stunden nach der Initial Seeding mit unterschiedlichen Versuchsanordnungen. (Alle Bilder auf 1,000x Vergrößerung, Balken = 130 &amp; mgr; m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a>

Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Setups für die Aussaat menschlicher mesenchymaler Stammzellen auf Materialien, in diesem Fall elektrogesponnene Garne, die die Basis von Standard-Kultur-Well-Platten nicht bedecken, um die Anzahl der Zellen, die sich anfänglich anheften, im Vergleich zur bekannten Seeding-Dichte zu maximieren und zu quantifizieren.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Bei diesem Verfahren werden elektrogesponnene PCL-Gerüste auf unterschiedliche Weise aufgebaut, um ein optimales Zellsaat-Setup zu bestimmen. Zunächst werden die sterilen Gerüste in die verschiedenen zu untersuchenden Aufbauten eingesetzt, einschließlich Zellkultureinsätzen, Trögen und Bioreaktor-Rotationsgefäßen. Sobald sie an Ort und Stelle sind, wird eine bekannte Anzahl von Zellen auf das Gerüst ausgesät und dann 20 Minuten lang ungestört gelassen.Dann werden alle Proben vorsichtig in einen Inkubator gebracht, mit 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius aufgestellt und vor Stunden statischen oder dynamischen Bedingungen ausgesetzt. Nach dieser Kulturzeit wird die Anzahl der Zellen, die sich an das Gerüst angeheftet haben, durch einen A-DNA-Assay bestimmt, um die Anzahl der Zellen in den Gerüstmedien und Well-Fraktionen zu quantifizieren. Letztendlich wird dies durch die Quantifizierung der auf dem Gerüst, der Vertiefung und in den umgebenden Medien vorhandenen DNA erreicht, um die Anheftung von Zellen an Gerüste mittels Rasterelektronenmikroskopie oder REM zu betrachten.Wir hatten die Idee zu dieser Untersuchung, als wir wussten, dass unsere Gerüste nicht den gesamten Boden der Well-Platte abdecken, was bedeutete, dass die Möglichkeit bestand, dass nicht alle Zellen mit dem Gerüst in Kontakt kommen und sich daher anheften können. Richten Sie zunächst die Zellkultureinsätze unter Laminafluss ein, indem Sie die sterilen Zellkultureinsätze mit sechs Vertiefungen öffnen und die kürzeren Ringe mit Zähnen von den breiteren Ringkörpern trennen. Nehmen Sie dann den Ring mit den Zähnen nach oben und drapieren Sie eines der vier Zentimeter großen Gerüste über die Mitte des Rings, wobei Sie darauf achten, dass es sich auf beiden Seiten überlappt.Nehmen Sie den Ringkörper und positionieren Sie ihn über dem Zahnring und dem Gerüst. Drücken Sie dann nach unten und achten Sie darauf, dass das Gerüst in Position bleibt und durch die Mitte der Zellkultur liegt. Einfügen. Setzen Sie den Zellkultureinsatz mit dem Gerüst in die Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und geben Sie 10 Milliliter Nährmedium in das Gerüst.Als nächstes werden Polytetrafluorethylen-Tröge in einzelne Petrischalen gegeben und 10 Milliliter Nährmedien in den Trog gegeben. Drapieren Sie eines der drei Zentimeter großen Gerüste mit einer Pinzette in den Trog und achten Sie darauf, dass seine Länge parallel zum längeren Rand des Trogs verläuft. Um den Bioreaktorbehälter unter Laminaströmung aufzustellen, geben Sie 10 Milliliter sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS durch den Hauptanschluss des Bioreaktorbehälters ab.Entfernen Sie nach 10 Minuten das PBS und ersetzen Sie es mit einer Pinzette durch acht Milliliter Nährmedium. Setzen Sie eines der drei Zentimeter großen Gerüste über den Hauptport in das Gefäß ein. Posieren Sie dann vor dem Hauptanschluss.Nach Durchführung der Zählung menschlicher mesenchymaler Stammzellen, wie im Textprotokoll beschrieben, aspirieren Sie das Medium aus dem Zentrifugenröhrchen, verlassen das Zellpellet und ersetzen es durch das berechnete Medienvolumen. Die Resus suspendiert die Zellen und das Medium für eine gleichmäßige Mischung. Geben Sie mit einer P 200 Gilson-Pipette langsam 200 Mikroliter Zellsuspension in jedes Gerüst ab, indem Sie die Spitze der Pipette entlang der Gerüstlänge und unter die Flüssigkeitsoberfläche des Mediums führen.Lassen Sie es 20 Minuten lang ungestört, oder die Bioreaktorgefäße gaben 200 Mikroliter der Zellsuspension durch den Hauptanschluss ab. Füllen Sie die restlichen zwei Milliliter Nährmedium an den Spritzenöffnungen auf, um ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern zu erhalten. Übertragen Sie als Nächstes die Bioreaktorbehälter in den Rotationsgefäß-Bioreaktor und stellen Sie sie auf Rotation ein.Übertragen Sie die Well-Platten mit Zellkultureinsätzen und -trögen bei neun U/min auf die Schüttelplatte und stellen Sie sie so ein, dass sie sich mit 30 U/min in einem 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator oder der statischen Kultur drehen. Übertragen Sie die Well-Platten mit den Zellkultureinsätzen und -trögen in die Ablage eines Zellkultur-Inkubators. Eingestellt auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Nach vier Stunden werden die Proben aus dem Inkubator entnommen und unter Laminaströmung gestellt. Entfernen Sie anschließend die Medienfraktionen von allen Proben und geben Sie sie in separat beschriftete Zentrifugenröhrchen. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 241 mal G entfernen Sie das Supinat, bevor Sie drei Milliliter Lysepufferwirbel hinzufügen, die Lösung zum Aufbrechen des Zellpellets, das die Gerüste in den Zellkultureinsätzen halten. Befreien Sie zuerst das Gerüst, indem Sie das Gerüst mit einem Gerüst nahe der Einsatzkante schneiden.Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Gerüste und legen Sie sie in Zentrifugenröhrchen mit drei Millilitern Lysepuffer. Geben Sie dann drei Milliliter Lysepuffer in jedes Gerüstgefäß und kratzen Sie die Oberfläche ab. Entfernen Sie den Lysepuffer und geben Sie ihn in separat beschriftete Zentrifugenröhrchen.Jedes Zentrifugenröhrchen etwa eine Minute lang wirbeln, um eine ausreichende Bewegung zu gewährleisten und die Lyse der Zellmembran zu fördern. Geben Sie in eine schwarze 96-Well-Platte 100 Mikroliter Lysepuffer für jedes Gerüstmedium der Probenfraktion, und geben Sie dann im Dunkeln 100 Mikroliter Zell-DNA-Lösung in alle Wells, die den Lysepuffer enthalten, und mischen Sie sie. Schonende Aufnahme von Wells mit Lysepuffer, der keine DNA und Zell-DNA-Lösung enthält, um eine Negativ- und Positivkontrolle für die Well-Platte zu ermöglichen.Messen Sie mit einem Fluoreszenzplatten-Reader die Absorption der Wells bei 485 Nanometer Anregung und 520 Nanometer Emission. Vergleichen Sie die Daten mit der Standardkurve, die aus den DNA-Standards gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Durchführung der REM-Fixierung generiert wurde. Nach vierstündiger Inkubation nehmen Sie alle Gerüste aus ihren Behältern und platzieren Sie sie in getrennten Vertiefungen mit einer neuen Platte mit sechs Vertiefungen und einer Laminaströmung.Waschen Sie dann die Gerüste jeweils zweimal mit PBS. Nun, fügen Sie zwei Milliliter 1,5 % Glutaraldehyd in PBS hinzu, um eine vollständige Abdeckung auf dem Gerüst zu gewährleisten. Lassen Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius stehen, um die Cel zu fixieren.Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Gerüste zweimal mit PBS. Übertragen Sie dann die Gerüste in eine neue Bohrlochplatte, um sie mit steigenden Ethanolkonzentrationen in destilliertem Wasser zu dehydrieren, beginnend mit 50 % Ethanol, gefolgt von 70 % und dann 90 % für jede Konzentration. Tauchen Sie die Gerüste vollständig in die Lösung und lassen Sie sie drei Minuten einwirken, bevor Sie die Lösung verwerfen und den Vorgang wiederholen.Sobald Sie die Gerüste in 100%igem Ethanol dehydriert haben, indem Sie die Gerüste vollständig in Lösung tauchen und fünf Minuten lang stehen lassen, entsorgen Sie die Lösung und trocknen Sie die Gerüste chemisch erneut. Verwendung von HMDS in einem Abzug. Tauchen Sie die Gerüste in HMDS und lassen Sie sie fünf Minuten lang stehen, bevor Sie das HMDS nach einmaligem Wiederholen entfernen.Entfernen Sie das HMDS und lassen Sie die Gerüste trocknen. Montieren Sie dann die Gerüste auf handelsübliche REM-Stummel, um die Betrachtung innerhalb der REM-Schicht zu erleichtern, und versehen Sie die Proben zwei Minuten lang mit einem Gold-Tucker-Coat, um eine dünne und gleichmäßige Abdeckung zu gewährleisten. Platzieren Sie abschließend die Proben im REM und visualisieren Sie die zellsitzenden Gerüste mit einem fünf Kilo großen Elektronengewölbe-Elektronenstrahl.Die Ergebnisse zeigen die Position der Zellen vier Stunden nach der Aussaat für jeden untersuchten Versuchsaufbau. Diese Abbildung zeigt den Prozentsatz der Zellen, die sich während dieser Zeit, in der alle untersuchten Seeding-Setups an der Gerüstoberfläche festgesetzt haben. Der Prozentsatz der Zelladhäsion ist relativ gering, aber die größte Zelladhärenz für Gerüste, die in Zellkultureinsätzen gehalten und bei 30 U/min geschüttelt werden.Die geringste Adhärenz war bei Gerüsten zu verzeichnen, die in den Zellkultureinsätzen gehalten und unter statischen Bedingungen aufbewahrt wurden. Eine große Anzahl von Zellen war in der Medienfraktion vorhanden, vor allem für die Zellkultur. Einsätze, die bei 50 % in niedrigen Bindungsplatten gehalten wurden, und rotierende Gefäße bei 51 %, Gerüste, die in den Trögen gehalten wurden, zeigten eine erhöhte Anzahl von Zellen, die im Halter selbst vorhanden waren.48% für Trogschüttler und 50% für statisches Trocknen. Die Elektromikroskopie ermöglichte eine visuelle Beurteilung der mit Zellen bestückten Gerüste. Repräsentative Bilder zeigten ein begrenztes Vorhandensein von Zellen auf der faserigen Oberfläche, unabhängig von der Aussaat.Eine größere Anzahl von Zellen und Zellagglomeraten war jedoch auf den Gerüsten vorhanden, die in Zellkultureinsätzen gehalten und bei 30 RP M geschüttelt wurden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, dass die Aussaat einer bekannten Anzahl von Zellen nicht unbedingt mit so vielen Zellen gleichzusetzen ist, die sich tatsächlich an das Gerüst anheften, insbesondere bei Gerüsten, die nicht die gesamte Basis der Wildplatten bedecken. Für Gerüste wie diese empfiehlt es sich, zunächst verschiedene Cell-Seeding-Setups zu optimieren, um die anfängliche Zellanheftung an das Scaffold zu maximieren.

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Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

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