Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung und Oberflächenmodifikation von Polymilchsäure, Co-Glykolsäure und elektrogesponnenen Fasern mit unterschiedlichen Mengen des antiviralen Proteins Griffithsin. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Arzneimittelverabreichung zu beantworten, z. B. wie neue Verabreichungsvehikel formuliert und charakterisiert werden können, die sexuell übertragbare Virusinfektionen wie HIV-1 verhindern können. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass die antivirale Aktivität von Griffithsin maximiert wird, indem polymer-elektrogesponnene Fasern als stationäres Gerüst für hochgradig lokalisiertes Griffithsin auf der Faseroberfläche verwendet werden.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie anderer Virus- und Bakterieninfektionen, da Griffithsin ein starkes prophylaktisches und therapeutisches Potenzial gegen eine Vielzahl von Infektionstypen hat. Obwohl diese Methode Einblicke in die Prävention von HIV-1-Infektionen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf andere virale oder bakterielle Infektionen, bei denen Griffithsin seine Wirksamkeit gezeigt hat. Um dieses Verfahren zu beginnen, wiegen Sie 720 Milligramm 50/50 PLGA in eine 10-Milliliter-Szintillationsflüssigkeit

Geben Sie mit einer serologischen Glaspipette 3,0 Milliliter HFIP hinzu. Decken Sie das Abscheuliche mit Plastikfolie ab. Messen und notieren Sie dann die abscheuliche Masse.

Inkubieren Sie die Polymersuspension über Nacht bei 37 Grad Celsius, um eine vollständige Auflösung des Polymers zu gewährleisten. Bereiten Sie danach die Elektrospinnvorrichtung vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, um die Polymerlösung abzusaugen.

Verbinden Sie als Nächstes eine stumpfe 18-Gauge-Nadelspitze mit 0,5 Zoll Länge mit der Spritze. Geben Sie die überschüssige Lösung ab, um den leeren Kopfraum in der Nadel zu entfernen. Setzen Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussrate des Instruments auf 2,0 Milliliter pro Stunde ein.

Schließen Sie die Stromquelle an die Spritzennadel an. Die Polymerlösung wird mit einer Spannung von positiven 27 Kilovolt elektrogeschleudert. Nachdem die gesamte Lösung elektrogesponnen wurde, schalten Sie die Stromquelle aus.

Lassen Sie den Dorn weitere 30 Minuten drehen, um das Lösungsmittel vollständig zu verdampfen. Schalten Sie dann den rotierenden Dordensammler aus. Mit einer Rasierklinge die Faser vorsichtig vom Dorn schälen.

Sammeln Sie die elektrogesponnene PLGA-Faser in einer beschrifteten Petrischale. Stellen Sie die Schale über Nacht in einen Exsikkator, um Lösungsmittelreste zu entfernen. Bereiten Sie zunächst die PBS- und MES-Lösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nehmen Sie als Nächstes das EDC und das NHS aus dem Gefrierschrank. Lassen Sie sie ruhen, um sich auf Raumtemperatur auszugleichen. Wiegen Sie danach vier Milligramm EDC in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wiegen Sie sechs Milligramm NHS in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie einen Milliliter MES-Puffer in jedes Röhrchen. Wirbeln Sie beide Röhrchen kräftig ein, um sicherzustellen, dass die Reagenzien vollständig aufgelöst sind.

Wiegen Sie dann 70 Milligramm Hydroxylamin in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 20 Milliliter PBS hinzu und wirbeln Sie es ein. Massieren Sie eine angemessene Menge PLGA-Faser in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie acht Milliliter MES-Puffer in die Faser. Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter der EDC- und NHS-Lösung hinzu. Verwenden Sie Kunststofffolie, um das konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu verschließen.

Stellen Sie das Röhrchen auf einen Rotator, um die Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorsichtig umzukehren. Fügen Sie danach 14 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol hinzu, um die Reaktion zu löschen. Drehen Sie das Rohr mehrmals um, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.

Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die PLGA-Faser zweimal mit 10 Millilitern PBS für jede Wäsche aus. Geben Sie eine angemessene Menge GRFT-Stammlösung in das Röhrchen, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie dann genug PBS hinzu, um das endgültige Volumen auf acht Milliliter zu bringen.

Schließen Sie das Rohr und drehen Sie es um, um ein gründliches Mischen zu gewährleisten. Verschließen Sie die Tube mit einer Plastikfolie. Legen Sie das Röhrchen auf den Rotator, um die Lösung zwei Stunden lang vorsichtig umzukehren.

Danach wird die Reaktion durch Zugabe von zwei Millilitern der vorbereiteten Hydroxylaminlösung abgebrochen und 30 Sekunden lang vortexiert. Entsorgen Sie den Überstand. Spülen Sie die oberflächenmodifizierte PLGA-Faser zweimal mit 10 Millilitern Reinstwasser ab und wirbeln Sie sie bei jeder Wäsche vortexen.

Übertragen Sie anschließend die gewaschene Faser in eine Petrischale. Lege die Petrischale in einen Exsikkator, bis die Faser vollständig getrocknet ist. Lagern Sie die Petrischale dann bei vier Grad Celsius.

Legen Sie zunächst drei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bereit. Massetiere jeweils zwei Milligramm Ballaststoffe hinein. Geben Sie dann einen Milliliter DMSO in jedes Röhrchen.

Eine Minute lang bei Raumtemperatur vortexen, um die Faser vollständig aufzulösen. Danach wird ein 10-Mikroliter-Aliquot mindestens 100-fach in TE-Puffer verdünnt. Bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis die Beladung mit Eliza erfolgt.

Wiegen Sie zwischen 5 und 10 Milligramm oberflächenmodifizierte Fasern ab und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Notieren Sie die Fasermasse, die in jedem Rohr platziert ist. Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter einer Lösung hinzu, die die physiologische Umgebung jeder Probe nachahmt.

Inkubieren Sie die Proben auf einem rotierenden Schüttler bei 200 U/min und 37 Grad Celsius für eine Stunde. Danach wird etwa ein Milliliter der Lösung, die die desorbierte GRFT enthält, entfernt und in Clusterröhrchen aliquotiert. Bei minus 20 Grad Celsius lagern, bis die Proteinquantifizierung möglich ist.

Anschließend wird die Probe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt. Fügen Sie einen Milliliter frische Pufferlösung hinzu und inkubieren Sie bis zum nächsten Zeitpunkt, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie werden die Bedingungen für die Herstellung von elektrogesponnenen PLGA-Fasern untersucht.

Die REM-Analyse von Roh-, 0,05-Nanomol-, 0,5-Nanomol- und 5-Nanomol-GRFT-Fasern zeigt, dass die GRFT-Modifikation keinen Einfluss auf die Fasermorphologie hat. Alle Formationen weisen ähnliche durchschnittliche Durchmesser von etwa 1,9 Mikrometern auf, was die Konsistenz des modifizierten Herstellungsprozesses über die Chargen hinweg zeigt. Anschließend wird die Menge an GRFT bestimmt, die in den elektrogesponnenen Fasern konjugiert ist.

Die 5-Nanomol-Modifikation enthält 373 Nanogramm GRFT, während die 0,5- und 0,05-Modifikationen 165 bzw. 42 enthalten. Dies zeigt, dass Fasern, die mit einer höheren theoretischen Oberflächenmodifikationsdichte konjugiert sind, zu mehr GRFT führen, die an die Faser konjugiert sind. Eine inverse Korrelation zeigt sich jedoch in der resultierenden Konjugationseffizienz.

Als nächstes wird die Menge an GRFT bewertet, die kovalent an die Faser konjugiert ist. Innerhalb der ersten vier Stunden werden 113 Nanogramm, 25 Nanogramm und 10 Nanogramm GRFT pro Milligramm elektrogesponnener Faser in den theoretischen Modifikationskonzentrationen von 5 Nanomol, 0,5 Nanomol bzw. 0,05 Nanomol nachgewiesen. Nach vier Stunden wird für alle drei Formulierungen eine vernachlässigbare GRFT in der Freisetzungseluierung nachgewiesen.

Diese Daten deuten darauf hin, dass der Großteil des GRFT kovalent an die elektrogesponnenen Fasern gebunden ist und dass das an der Oberfläche absorbierte GRFT innerhalb der ersten vier Stunden freigesetzt wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa vier Tagen durchgeführt werden. Das Elektrospinnen des Polymerfasergerüsts erfordert zwei Tage, um die Polymerlösung vorzubereiten und zu elektrospinnen.

Die Oberflächenmodifikation, die anschließende Trocknung und die Fasercharakterisierung hingegen erforderten mindestens zwei zusätzliche Tage. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die richtigen Verhältnisse der Reagenzien beizubehalten, um eine optimale Modifikation zu gewährleisten. Darüber hinaus ist es auch wichtig zu überprüfen, ob die Parameter des Elektrospinnens korrekt sind, um eine angemessene Fasermorphologie zu gewährleisten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Wirkstoffverabreichung zur Herstellung von elektrogesponnenen Fasern, die nicht nur antivirale Wirkstoffe in der Faser einkapseln, sondern auch die Fähigkeit haben, Wirkstoffe durch die Faseroberfläche zu konjugieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Polymerfasern elektrospinnt, die Oberflächenmodifikation der Faser mit dem antiviralen Protein Griffithsin und qualitatives Griffithsin durchführt, das an die Faser konjugiert ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien wie HFIP, Beta-Mercaptoethanol, EDC und NHS äußerst gefährlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen wie das ordnungsgemäße Anlegen von PSA und die Verwendung chemischer Abzüge sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.