Name: CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen: Eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Lernen Sie CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen für die genetische Forschung. Diese hocheffiziente Methode ermöglicht den DNA-Fragmenttransfer zwischen Vektoren ohne PCR-Verstärkung und spart Zeit sowie Ressourcen.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar Pulver</td><td>Chembase</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Automatisiertes digitales Gel-Bildanalysesystem</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel-Extraktions-Kit</td><td>Omega</td><td>Nr. D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit I</td><td>Omega</td><td>Nr. D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>SCHNABEL</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>SCHNABEL</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Quick RNA-Synthesekit mit hoher Ausbeute</td><td>SCHNABEL</td><td>Nr. E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi-DNA-Montage-Mastermix</td><td>SCHNABEL</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler</td><td>LongGen</td><td>T20 (Englisch)</td><td></td></tr><tr><td>Platin-SuperFi-II-DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>SCHNABEL</td><td>Nr. R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Mastermix</td><td>SCHNABEL</td><td>Nr. M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Nr. Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 chemisch kompetente Zelle</td><td>TransGen</td><td>Nr. CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid</td><td>Nr. LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>SCHNABEL</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Oxoid</td><td>Nr. LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-basiertes shuttle-klonen: eine hochdurchsatz-klonierungsmethode

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Wir haben CRISPRshuttle verwendet, um eine UAS-cDNA/ORF-Plasmidsammlung zu erstellen, die 1.397 menschliche Gene abdeckt, die in Drosophila7 konserviert sind. Die Restriktionsanalyse zeigte, dass CRISPRshuttle einen Wirkungsgrad von 94,5 % für die Verwendung von CRISPRshuttle-kompatiblen Zielvektoren mit zwei sich wiederholenden Sequenzen und von 96,1 % für die Verwendung von Zielvektoren ohne sich wiederholende Sequenzen erreicht7. Unsere Daten zeigten, dass im Al...

CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen: Eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Wir beschreiben unser Protokoll für eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode, CRISPRshuttle. Dabei werden Ziel-DNA-Fragmente zwischen Vektoren übertragen, ohne dass eine PCR-Amplifikation der DNA-Fragmente erforderlich ist. Bestehende Techniken wie Gateway-Infusion und Univektor-Klonierung, PCR-Amplifikation. Dieser Ansatz erfordert fragmentspezifische Verfahren, einschließlich primärem Design und Sekretionsvalidierung. Diese Tags sind arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Das CRISPR-Shuttle eliminiert die PCR und überträgt Ziel-DNA-Fragmente zwischen den Vektoren in sequenzielle Reagenzglasreaktionen. Diese Methode geht über die Notwendigkeit einer fragmentspezifischen Handhabung hinaus und beschleunigt somit die Probenkonstruktion.[Erzähler] Bereiten Sie zunächst einen Mastermix für eine bestimmte Anzahl von Aufschlussreaktionen vor, indem Sie die auf dem Bildschirm gezeigten Reagenzien kombinieren. Ordnen Sie die ordnungsgemäß beschrifteten 0,2-Milliliter-Röhrchen in einem Aluminiumkühlblock auf Eis an. Bereiten Sie den Mastermix für N Reaktionen vor, indem Sie geeignete Mengen an CAS9 sgRNA, 10 CAS9-Puffer und DEPC-behandeltem Wasser mischen. Mischen Sie den Mastermix gründlich und schleudern Sie ihn herunter. Aliquotieren Sie 3,75 Mikroliter des Mastermixes in jedes Reaktionsröhrchen. Geben Sie 0,75 Mikroliter 0,03 mikromolare PLX 304 ORF-Plasmid in jedes gründlich gemischte Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Mastermix vor, indem Sie 0,14 Mikroliter 3,36 mikromolare linearisierte pBIDC-UASC-pLXvect und 1,8 Mikroliter Gibson Assembly Master Mix kombinieren. Mischen Sie den Mastermix gründlich und schleudern Sie ihn herunter. Aliquotieren Sie nun 1,94 Mikroliter des Mastermixes in jede Tube. Geben Sie 1,66 Mikroliter CAS9-gespaltenes Plasmid in jedes Röhrchen. Gründlich mischen und eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius inkubieren. Tauen Sie bakterielle kompetente Zellen auf Eis auf. Aliquotieren Sie 10 Mikroliter der aufgetauten Zellen in jedes vorgekühlte 1,5-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig 10 Mikroliter der kompetenten Zellen mit einem Mikroliter Gibson Montageprodukt. Legen Sie die Röhren 30 Minuten lang auf Eis. Erhitzen Sie die Röhren eine Minute lang bei 42 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten lang auf Eis. Geben Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes SOC-Medium in jedes Röhrchen und schütteln Sie es eine Stunde lang bei 250 U/min bei 37 Grad Celsius. Zum Schluss werden die Zellen auf LB-Agarplatten mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol gelegt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Ergebnisse der Restriktionsanalyse von UAS-cDNA/ORF-Plasmiden, die mit dem CRISPRshuttle-System erzeugt wurden. In dieser Analyse zeigte der Restriktionsverdau von 15 UAS-cDNA/ORF-Konstrukten mit PVU2, dass alle Proben bei etwa 1072 Basenpaaren und 1.820 Basenpaaren die erwarteten Fragmentmuster aufwiesen.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Gen-Targeting-Methoden können verwendet werden, um transgene Mäuse mit Knockout-, Knock-in- und getaggten Allelen zu erzeugen.  Hier beschreiben wir eine verbesserte Methode der Rekombination in E. coli, die wir als "Subklonierung plus Insertion" bezeichnen und die zur schnellen Generierung benutzerdefinierter Gen-Targeting-Vektoren verwendet werden kann.

Subklonierung Plus-Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Verfahren zur schnellen Bau der Gene Targeting Vektoren

Verwendung von DNA-Baugruppe können mehrere CRISPR Vektoren parallel in einem einzigen Reaktions Klonierung konstruiert werden, wodurch die Konstruktion einer großen Anzahl von CRISPR Vektoren eine einfache Aufgabe. Tomato Haarwurzeln sind ein ausgezeichnetes Modellsystem CRISPR Vektoren zu validieren und mutierten Materialien erzeugen.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zum Klonieren von mehreren einzelnen Leitungs-RNAs in einen Leitfaden-RNA-Concatemer-Vektor, der von besonderem Nutzen bei der Herstellung von Multi-Gen-Knockouts unter Verwendung der CRISPR / Cas9-Technologie ist. Die Erzeugung von Doppelknockouts in Darmorganoiden wird als mögliche Anwendung dieser Methode gezeigt.

Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

Hier ist eine einfache, effiziente, und kosteneffektive Methode des Klonens SgRNA skizziert.

CRISPR Guide RNA Klonen für Säugetier-Systeme

Dieses Manuskript beschreibt eine gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt (CRISPR) CRISPR-Cas9-basierte Methode für eine einfache und rasche Untersuchung der Rolle der mehrere Kandidaten-Gene in der akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellproliferation in Parallel. Diese Technik ist skalierbar und kann in anderen Krebszelllinien angewendet werden.

Untersuchung der genetischen Abhängigkeiten mit CRISPR-Cas9-Wettbewerb-Assays

Dieses Protokoll beschreibt die Durchsatz-Plasmidtransfektion von Säugetierzellen in einer 384-Well-Platte mit akustischer Tröpfchenauswurftechnologie. Die zeitaufwändige, fehleranfällige DNA-Dosierung und Multiplexing, aber auch die Transfektionsreagenz-Dosierung, sind softwaregesteuert und werden von einem Nanospenderdurchgeführt ausgeführt. Die Zellen werden dann in diesen vorgefüllten Brunnen gesät.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

CRISPR-Cas-Systeme und Anti-CRISPR-Proteine wurden in das Schema der Booleschen Gates in Saccharomyces cerevisiae integriert. Die neuen kleinen Logikschaltkreise zeigten eine gute Leistung und vertieften das Verständnis sowohl von dCas9/dCas12a-basierten Transkriptionsfaktoren als auch von den Eigenschaften von Anti-CRISPR-Proteinen.

Digitale Genschaltkreise auf Basis von CRISPR-Cas-Systemen und Anti-CRISPR-Proteinen

Wir stellen ein Protokoll für die CRISPR-basierte modulare Assemblierung (CRISPRmass) vor, eine Methode zum Hochdurchsatzaufbau von UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliotheken in Drosophila unter Verwendung öffentlich verfügbarer cDNA/ORF-Ressourcen. CRISPRmass kann zur Bearbeitung verschiedener Plasmidbibliotheken eingesetzt werden.

CRISPR-basierter modularer Aufbau für den Hochdurchsatzaufbau einer UAS-cDNA/ORF-Plasmidbibliothek

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Lernen Sie CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen für die genetische Forschung. Diese hocheffiziente Methode ermöglicht den DNA-Fragmenttransfer zwischen Vektoren ohne PCR-Verstärkung und spart Zeit sowie Ressourcen.

CRISPR-basiertes Shuttle-Klonen: Eine Hochdurchsatz-Klonierungsmethode

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