Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopezie ist eine häufige Form von Haarausfall, die bei vielen verschiedenen Erkrankungen auftreten kann, auch als Nebenwirkung einer Chemotherapie. Wir haben eine Methode zur Quantifizierung des Haarausfalls bei Mäusen entwickelt, indem wir einen Standard-Gel-Imager verwenden, um eine Graustufenanalyse durchzuführen und so die Untersuchung vielversprechender neuer Alopezie-Therapien zu erleichtern.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Quantifizierung der Haardichte durch Lichtabsorption zu ermöglichen. Dazu werden die Tiere zunächst mit einem Gel-Imager fotografiert. Die nächsten Schritte bestehen darin, einen interessierenden Bereich auf dem Foto zu definieren und die Lichtabsorption innerhalb des interessierenden Bereichs zu bestimmen.

Dann wird die Lichtabsorption mit einem fotografischen Standard verglichen. Letztendlich kann die Lichtabsorption zwischen ähnlich behandelten Tieren gemittelt werden, um die Auswirkungen eines Eingriffs auf das Haarwachstum zu zeigen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie unvoreingenommen, quantifizierbar und reproduzierbar ist.

Dies ist äußerst wichtig, da es Ihnen ermöglicht, Standards und statistische Techniken wie Inova zu verwenden, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. Verwenden Sie für dieses Protokoll einen Gel-Imager mit eingebauter Lichtquelle für reflektierende Fotografie. Dies gewährleistet eine gute Gleichmäßigkeit des Lichts, während die Transbeleuchtung eine für die Analyse ungeeignete Schärfe erzeugt.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Gel-Imagers, stellen Sie den Fokus und das Sichtfeld ein. Bei gedrucktem Text kann die Maus leicht unscharf sein, da dies tatsächlich funktioniert. Um Quantenfehler in kleinen interessierenden Bereichen zu reduzieren, wird die Gleichmäßigkeit der Lichtquelle im gesamten fotografierten Bereich überprüft, mit dem Ziel einer hervorragenden optischen Mittelwertbildung im interessierenden Bereich.

Bereiten Sie als nächstes das Tier vor. Wählen Sie ein Betäubungsmittel mit schnellem Wirkungseintritt und kurzer Wirkungsdauer und geben Sie gerade so viel ab, dass die Tiere für die Fotografie ruhig bleiben. Platzieren Sie nun die Tiere senkrecht und so nah wie möglich parallel auf dem Imager.

Platzieren Sie die Tiere für Rückenfotos in Bauchlage mit ausgestreckten Gliedmaßen. Für Bauchaufnahmen legen Sie die Tiere in Rückenlage. Achten Sie darauf, dass sie nicht seitlich gedreht sind.

Absorptionswerte können zwischen den Bildern gezogen werden, aber dafür ist die Maschine nicht ausgelegt. Das Hinzufügen eines Graustufenstandards ermöglicht es uns also, die Absorptionswerte bei der Zusammenstellung der Daten zu normalisieren. Platzieren Sie nun den Graustufenstandard im fotografierten Bereich.

Schließen Sie dann die Kammer und reduzieren Sie die Umgebungsbeleuchtung, die auf der Kamera in die Kammer gelangen könnte. Stellen Sie die Blende F auf eine Belichtung ein, die den interessierenden Bereich nicht übersättigt oder unterbelichtet macht. Dann machen Sie ein Foto.

Wenn die Blendenzahl so gewählt wird, dass das Bild gesättigt ist, wird der Graustufenwert auf den Wert fixiert, der für B völlig unbrauchbar ist. Ändern Sie dann die Blende um eins, wobei der Interessenbereich und der Standard in einem linearen Belichtungsbereich bleiben, und machen Sie ein zweites Foto, wenn die Fotografie abgeschlossen ist. Legen Sie die Tiere auf einen Wärmetisch und überwachen Sie sie, bis sie sich erholt haben.

Sternal-Liegerad. Bringen Sie die Tiere dann in ihre Käfige und schließlich in das Vivarium zurück, um sich vollständig zu erholen. Um die Lichtabsorption mit der Gel-Imaging-Software zu quantifizieren, markieren Sie die interessierenden Regionen auf den Bildern der Tiere für eine Rückenansicht des gesamten Tieres.

Verwenden Sie ein rechteckiges Bild, ein ovales Bild oder ein Freihandwerkzeug, um einen Raum von den oberen Gliedmaßen zu den unteren Gliedmaßen zu umreißen, der sich so weit wie möglich seitlich erstreckt. Halten Sie es innerhalb der Ränder des Rückens des Tieres, um das ganze Tier ventral zu sehen. Verwenden Sie zwei Rechtecke.

Eine zur Abdeckung der Beckenregion, die gepflegt wird, und eine zur Abdeckung des Brustbereichs, der nicht gepflegt wird. Kleinere Bereiche von Interesse, z. B. wo ein Medikament verabreicht wurde, können ebenfalls als erforderlich markiert werden. Zweitens, markieren Sie den interessierenden Bereich auf dem Graustufen-Absorptionsstandard.

Notieren Sie dann die Absorption aus jedem markierten Bereich von Interesse, um sie mit den Fotos zu vergleichen. Normalisieren Sie die Absorptionsniveaus auf den Hintergrundstandard unter Verwendung eines logarithmischen Verhältnisses von Exposition und Absorption. Zu diesem Zweck wird eine Kurve des Logarithmus der Exposition gegen den Logarithmus der Absorption aufgetragen.

Verwenden Sie die Werte, die Sie aus dem Graustufenabsorptionsstandard erhalten haben, und passen Sie ihn dann wie folgt an Schwankungen des Standards der einzelnen Fotos an. Wählen Sie zunächst die Blende zum Ablesen des ROI und die Blende für die Referenz und berechnen Sie die durchschnittliche Absorption des Standards in allen Fotos bei der Ablesung der Blende. Dieser Mittelwert ist der Referenzstandardwert oder der RSV.

Berechnen Sie als Nächstes die Differenz in der Absorption zwischen den Mess- und Referenz-Blendeneinstellungen in jedem Foto und führen Sie die gleichen Berechnungen für den Standard- und für jeden definierten ROI durch. Berechnen Sie nun mit den Daten von einer Blendenstufe die korrigierte Absorption für jeden ROI mit der gezeigten Formel. Anschließend wenden Sie statistische Standardmethoden an, um die Daten von C3 HHEJ-transplantierten Mäusen zu analysieren, die Alopezie-ADA modellieren, die mit der beschriebenen Methode bei unterschiedlichen Expositionen analysiert wurden.

Die Schwankungen des nicht überlappenden ROI waren erwartungsgemäß eng korreliert. Ähnliche Vergleiche ergaben die gleiche enge Korrelation über einen Zeitraum von drei Wochen. Die Mäuse wurden abgebildet, um ihren zu erwartenden Haarausfall zu quantifizieren.

80% der abgebildeten Mäuse zeigten in diesem Zeitraum Haarausfall. Im Vergleich dazu zeigten normale C 57 black six-Mäuse im gleichen Zeitraum keinen Haarausfall. In einer zweiten Studie wurde die Chemotherapie-induzierte Alopezie mit der beschriebenen Technik quantifiziert.

Mäuse wurden drei Wochen lang mit Cyclophosphamid behandelt und zeigten nach zwei Monaten im Vergleich zu den Kontrollen einen signifikanten Haarausfall. Einmal gemastert, kann jedes Bild in weniger als fünf Minuten analysiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Ausmaß des Haarwachstums bei Nagetieren mit einem Standard-Gel-Bildgebungssystem quantifizieren können.