Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wanderung von Zellen in Echtzeit mittels Video-Zeitraffermikroskopie quantitativ zu messen. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Sechs-Well-Kulturplatte mit Kollagen beschichtet und dann die interessierenden Zellen spärlich auf die beschichtete Platte ausgesät werden. In einem zweiten Schritt wird mit einer Pipettenspitze eine Wunde in der Platte erzeugt, die viel Platz für die Migration bietet.

Als nächstes wird das Mikroskop aufgebaut und die Bilder werden in regelmäßigen Abständen mit einem Temperaturkontrollsystem aufgenommen, um eine kontinuierliche Überwachung der wandernden Zellen in Echtzeit zu ermöglichen. Letztendlich wird das Partikelverfolgungsprotokoll verwendet, um Unterschiede in der Durchschnittsgeschwindigkeit und der Gesamtverschiebung von Test- und Kontrollzellen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Vermeidungskammermigrationsassay besteht darin, dass sie nicht auf quantitativen Endpunktmigrationsmessungen basiert.

Stattdessen ermöglicht es die kontinuierliche Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, z. B. wie sich bestimmte Gene oder Medikamente auf die Migration von Tumorzellen auswirken. Geben Sie zwei Tage vor dem Eingriff 1,5 Milliliter Kollagen, verdünnt in Opti-Medien, in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei vier Grad Celsius einen Tag vor dem Eingriff.

Resuspendieren Sie die interessierenden Zellen in zwei Millilitern DMEM plus FBS pro Vertiefung und übertragen Sie die Zellen in jede Vertiefung der Kollagen-ENC-beschichteten Platte, wobei die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Am Tag des Eingriffs. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine Wunde in den über Nacht kultivierten Zellen zu erzeugen, und waschen Sie jede Vertiefung mit PBS, um alle Ablagerungen zu entfernen, die sich durch die Wunde gebildet haben.

Geben Sie DMEM plus FBS in die gespülten Vertiefungen und überprüfen Sie dann unter dem Mikroskop, ob ein sauberer Wundraum geschaffen wurde. Positionieren Sie nach dem Einschalten der Mikroskopkamera und des Bildgebungsgeräts für lebende Zellen die Platte über dem Mikroskoptisch. Decken Sie die Platte mit der neuen Klimakontrollkammer für lebende Zellen ab und stellen Sie den Thermostat auf 37 Grad Celsius und das Kohlendioxid auf 5 % einÖffnen Sie nun die Diabuch-Software in der Menüleiste.

Wählen Sie die Fokussteuerung aus, indem Sie auf die Schaltfläche F in einem Kreis klicken. Verwenden Sie im Zielfeld das Dropdown-Fenster, um das Ziel zu definieren. Wählen Sie im Feld Filtersatz die Einstellungen aus, um den Lichtweg auf das I-Stück zu lenken. Wählen Sie den entsprechenden Filter für Hellfeldbeleuchtung aus und klicken Sie dann auf Hell öffnen.

Um den Hellfeld-Verschluss zu öffnen. Wählen Sie nun den Hellfeldfilter am Revolver aus und betrachten Sie die Probe durch das Okular, um die entsprechenden Felder zu finden und die Probe in den Fokus zu bringen. Bewegen Sie dann den Filterrevolver, um den Lichtweg zur Kamera zu ändern. Für die Bildaufnahme in der Diabuch-Software klicken Sie auf Fokussteuerung und wählen Sie XY, um verschiedene Positionen durch das I-Stück auszuwählen, und klicken Sie dann auf Sollpunkt, um jede Position zu fixieren.

Für die Bildaufnahme passen Sie den Fokus des Kamerabildes, das auf dem Bildschirm angezeigt wird, manuell an und verwenden Sie dann die Werkzeuge im Fenster mit den Fokussteuerungen, um die Z-Position der Bühne anzupassen. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie sich auf flache Zellvorsprünge in der Nähe des Kontakts mit der Platte konzentrieren, um die Fokussierung zu erleichtern. Verwenden Sie den Schieberegler, um die Belichtungszeiten so einzustellen, dass sie in einem geeigneten Bereich für die Fokussierung liegen.

Wenn mehrere XY-Positionen ausgewählt wurden, passen Sie den Fokus für jede einzelne Position an, indem Sie die Fokussteuerung auswählen. Dann xy, dann Besuchspunkt. Wählen Sie in der Diasammlung in der Menüleiste die Kameragrafik aus, wählen Sie Aufnahmetyp und dann Zeitraffer aus, um die Dauer des Experiments auszuwählen.

Geben Sie im Dropdown-Menü die gewünschte Verzögerung zwischen dem Beginn eines Zeitpunkts und dem Beginn des nächsten Zeitpunkts ein. In den Intervallfeldern wird das dritte Feld automatisch aus den manuell eingegebenen Werten berechnet. Wählen Sie unter Mehrfach-XY-Erfassung die Option Mehrpunktliste für Experimente mit mehr als einer XY-Position aus.

Benennen Sie abschließend die Datei, um die Datei zu speichern, gehen Sie zur Erfassungssteuerung, wählen Sie Erweitert und dann Spool aus. Erfassen Sie dann den Speicher und speichern Sie ihn nach jedem Zeitpunkt in einer Spool-Datei. Beginnen Sie mit einem Klick auf das Bild.

Wählen Sie in der Menüleiste der Diabuchreihe im Dropdown-Menü die Option Importieren aus und klicken Sie dann auf Diabuch-Spool. Wählen Sie die gewünschten Diamappendateien aus, die aus dem Migrationsexperiment für verschiedene Felder und Zeitpunkte generiert wurden. Öffnen Sie die erste Datei, wählen Sie dann in der Menüleiste "Maske" und dann "Partikelverfolgungsprotokoll" aus dem Dropdown-Menü aus.

Wählen Sie im Menü "Partikelverfolgung" die Option "Manuelles Partikelverfolgungsprotokoll" aus. Es wird ein Fenster mit Start- und Endzeitpunkten angezeigt. Um die zufällige Migration zu analysieren, wählen Sie Maske und dann Partikelverfolgungsprotokoll aus. Um die Koordinaten für den Mittelpunkt des Objekts zu bestimmen, wählen Sie erneut Mittelpunkt des Bereichs aus.

Klicken Sie dann auf "Verfolgen" und fortfahren. Wählen Sie nun für jeden Pfad die gewünschten Statistiken aus, z. B. Verschiebung und Durchschnittsgeschwindigkeit. Klicken Sie, wie hier gezeigt, auf Berechnen, um die Statistiken anzuzeigen.

Ein Beispiel für eine zufällige Migrationsanalyse, wie sie in Bezug auf die Geschwindigkeit quantifiziert wird, ist in diesem Kasten dargestellt. In der Whiskers-Grafik gab es in diesem Experiment einen Anstieg der durchschnittlichen Geschwindigkeit in M-D-A-M-B 2 31 Zellen mit einem ausgeschalteten Tumorsuppressorgen. Im Vergleich zu den Kontrollzellen M-D-A-M-B 2 wurden hier 31 Zellen die zufällige Wanderung der Zellen aus der ersten Abbildung hinsichtlich der Zellverdrängung analysiert.

Auch hier wies die Gesamttumorsuppressor-Gen-Knockdown-Gruppe eine erhöhte Zellverdrängung im Vergleich zur Kontrollgruppe M-D-A-M-B auf 31. Die Zellen in diesem Zeitraffer-Videomikroskopie-Film-Kontrollgerät MDA MB 2 31 Zellen wurden über Nacht auf Kollagen gesetzt. Die Bilder wurden dann im Abstand von einer Stunde für insgesamt 18 Stunden während der zufälligen Migration aufgenommen.

Beachten Sie, wie sich die Zellen im Laufe der Zeit von ihrer ursprünglichen Position entfernen. In diesem Film wurde die Migration von Test M-D-A-M-B 2 31 Zellen nach Übernachtaussaat auf Kollagen aufgezeichnet und analysiert. Beachten Sie, dass die Testzellen im Vergleich zu den Kontrollzellen im vorherigen Film migrativer sind.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Zellinvasion und Dynas durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. welche Rolle spielen Zellen bei der Metastasierung von Krebs nach seiner Entwicklung? Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Zellbiologie den Weg, die Zellmigration anhand isolierter Krebszelllinien zu erforschen.