Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Granulozytenfunktion als Zwei-Parameter-Ansatz zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst Granulozyten aus Blutproben von Patienten mit Biopartikeln und Reagenzien inkubiert werden, um den oxidativen Ausbruch sichtbar zu machen. Im zweiten Schritt wird die Phagozytose nach der Inkubation blockiert und dann werden die interessierenden Zelloberflächenrezeptoren markiert, um eine positive Identifizierung der Granulozyten zu ermöglichen.

Letztendlich können die aktivierten Granulozyten-Untergruppen durch bildbasierte Durchflusszytometrie identifiziert und isoliert werden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Ernährungsimmunologie oder der klinischen Immunologie zu beantworten, z. B. wie Ernährungsgewohnheiten und Ernährungspraktiken zu Veränderungen und der Granulozytenfunktion beitragen. Dieses Verfahren wird von Eric Prado, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Nach der Entnahme der peripheren Blutprobe tauen die SIU-Biopartikel und DHE bei Raumtemperatur auf und werden in einem 37 Grad Celsius B-Bad mit Ethylmalamen behandelt, wenn die Reagenzien aufgetaut sind, 20 Mikroliter der SSUS-Biopartikel in vier einzelne 1,2-Milliliter-Röhrchen in einer sterilen Haube gegeben. Geben Sie dann 40 Mikroliter des aufgetauten DHE in jedes Röhrchen mit den Biopartikeln und klopfen Sie vorsichtig auf die Röhrchen auf der Bank, um das Reagenz am Boden der Röhrchen zu sammeln. Nachdem Sie 100 Mikroliter gemischtes Vollblut in jedes Röhrchen gegeben haben, entfernen Sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze jegliches kontaminierende Blut entlang des Innenrandes der Röhrchen und mischen Sie das Blut und die Reagenzien mit einem elektronischen Pipettenset für drei Zyklen.

Legen Sie nach dem dritten Zyklus alle Schläuche in einen lichtgeschützten Eiskübel. Inkubieren Sie die Röhrchen dann 10, 20 oder 40 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Bad, beginnend mit der 40-Minuten-Röhrchen, um sicherzustellen, dass alle Inkubationen gleichzeitig abgeschlossen sind. Geben Sie am Ende der Inkubationen 15 Mikroliter Ethylmalamed in jedes der Röhrchen.

Nach 30 Minuten inkubieren Sie die Zellen mit je 10 Mikrolitern der entsprechenden Antikörper. Nach einer Stunde inkubieren Sie die Zellen weiter in 750 Mikrolitern weißer Blutkörperchen fixiert rote Blutkörperchenläuselösung. Nach einer weiteren Stunde zentrifugieren Sie die Zellen in der Inkubation und saugen den Überstand im Vakuum an, wobei ein Restflüssigkeitsvolumen von 100 Mikrolitern über dem Zellpellet verbleibt.

Geben Sie nun 10 Mikroliter frisch verdünnte sieben A bis D, 50 Mikroliter PBS und 25 Mikroliter Kalibrierkügelchen zu jeder Probe. Verschließen Sie dann die Röhrchen, wickeln Sie sie in Folie ein und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Wenn das bildbasierte Durchflusszytometer fertig ist, führen Sie jedes Probenröhrchen aus und erfassen Sie mindestens 3000 ULU-Standortereignisse mit vordefinierten Parametern, um die Proben zu analysieren.

Verwenden Sie den automatisierten Software-Kompensationsassistenten der IDEA-Software, um eine Kompensationsmatrix auf die Rohbilddateien anzuwenden und kompensierte Bilddateien zu erstellen. Laden Sie dann die einzelnen CIF-Dateien in die IDEA-Software und generieren Sie die folgenden Diagramme, um die Granulozyten-Untergruppen für jede Patientenprobe zu identifizieren. Verwenden Sie zunächst die unstimulierte Kontrolle als Referenzstandard und verwenden Sie das Histogramm des Hellfeldgradienten-Root-Mean-Quadrats, um die anfänglichen Gates festzulegen und die Zellen zu identifizieren, die als fokussiert angesehen wurden.

Um dann die Singulettzellen von den Trümmern und den Dubletten zu trennen, erstellen Sie ein Punktdiagramm des Hellfeld-Seitenverhältnisses im Vergleich zum Hellfeldbereich. Sobald eine saubere Zellpopulation identifiziert wurde, erstellen Sie ein Punktdiagramm von CD 45 gegenüber CD 66 B.To identifizieren Sie die CD 45-positiven CD 66 B-positiven Granulozyten positiv. Erstellen Sie abschließend ein Punktdiagramm der hellen Detailintensität für den Aureus im Vergleich zur hellen Detailintensität für den oxidativen Ausbruch.

Um die Teilmengen der aktivierten Granulozyten zu identifizieren, die die Hellfeldbilder in den Kanälen eins und neun, die Biopartikel in Kanal drei, das DHE in Kanal vier, die sieben a a d in Kanal fünf, die CD 66 B in Kanal 11 und die CD 45 in Kanal 12 sammeln, kann auch ein zweifarbiges Overlay erzeugt werden, das kombinierte DHE- und Biopartikelereignisse darstellt. Mit Hilfe der bildbasierten Durchflusszytometrie kann eine homogene Population aktivierter Granulozyten in drei verschiedene Aktivierungsuntergruppen unterteilt werden. Bei dieser Methode ist der effektivste Weg, die drei Teilmengen aufzulösen, die Darstellung der hellen Detailintensität für die Phagozytose im Vergleich zum oxidativen Ausbruch.

Die weitere Verwendung des Kolokalisationsassistenten in der IDEAS-Software ermöglicht die Quantifizierung des Vorhandenseins der gleichzeitigen Phagozytose und des oxidativen Ausbruchs der Granulozyten, ein Kennzeichen einer hohen Aktivierung. Darüber hinaus zeigte in diesem Experiment die 40-minütige Inkubationszeit den größten Prozentsatz an hochaktiven Granulozyten. Die Aufnahme von mindestens drei Inkubationsperioden in das Protokoll erleichtert somit die Bestimmung, wie eine bestimmte klinische Behandlung den zeitlichen Aktivierungsstatus der Granulozyten verändern kann.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Bead-basierte Multiplex-Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Wie verändert sich zum Beispiel die Chemokinproduktion von GRANULOZYTEN im Supinat nach der Exposition gegenüber Biopartikeln?