Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie
1. Juli 2010
In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von Zellen In-vitro- Durch modifizierte Einhaltung Methode mittels Elektroporation und der anschließenden Detektion der fusionierten Zellen Visualisierung mit Fluoreszenzmikroskopie.
Beim Elektroschmelzen werden kurze elektrische Hochspannungsimpulse in engem Zusammenhang auf Zellen angewendet. In diesem Video demonstrieren wir die Elektrofusion von Zellen in vitro mit Hilfe der modifizierten Adherence.Method. Die Experimente wurden an Melanomzellen der Maus durchgeführt, BF one.
Führen Sie für das Experiment die folgenden Schritte aus. Züchten Sie Zellen in zwei separaten Kulturflaschen bis zu 80 % Konfluenz. Fügen Sie separat 2,1 Mikroliter jeder Stammlösung hinzu.
10 Millimolare C-M-F-D-A bzw. CMRA auf drei Milliliter Krebs Hess Puffer in einem Zentrifugenröhrchen. Die Zellen werden zweimal mit Krebs Hess Puffer gespült und dann die Beladungslösungen in die Kolben gegeben. Belastungslösungen enthalten etwa sieben mikromolare C-M-F-D-A bzw. CMRA.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre. Während dieser ersten Inkubation gelangen Regionen frei durch Zellmembranen in das Zytosol, wo sie in Membran-IMP-permeierte Reaktionsprodukte umgewandelt werden. Nach dieser ersten Inkubation spülen Sie die Zellen aus und inkubieren Sie sie dann weitere zwei Stunden lang mit Kulturmedium.
Die Beobachtung der Zellen erfolgt mit einem Fluoreszenzmikroskop, das in der Erfassungssoftware mit einer gekühlten CCD-Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 548 Nanometer ein und wählen Sie ein geeignetes Bandpassfilter-Bedrohungsfluoreszenzbild der mit CMRA beladenen Zellen für die mit C-M-F-D-A beladenen Zellen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 492 Nanometer ein und wählen Sie einen Bandpassfilter für grüne Fluoreszenzbild-Trypsinaugen, zählen Sie die Zellen in beiden Kolben und mischen Sie rote und grüne Zellen miteinander. Stellen Sie die Zellkonzentration in einem Verhältnis von eins zu eins auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter ein.
Geben Sie einen Tropfen Zellsuspension von 20 Mikrolitern in die Mitte jeder Vertiefung. In einer 24-Multi-Well-Platte inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre, damit sich die Zellen in einer Monoschicht leicht an der Oberfläche der Vertiefung anheften und Zellkontakte untereinander herstellen können. Platzieren Sie den Multi-Well mit den Zellen auf dem Mikroskoptisch.
Positionieren Sie die Elektroden am Boden der Vertiefung und verbinden Sie sie mit dem Impulsgenerator. Um eine optimale Elektrofusion zu erreichen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sollten geeignete Parameter für elektrische Impulse verwendet werden. Diese Parameter sind abhängig von der Zelllinie und sollten in Vorversuchen bestimmt werden. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter ISO omu Kaliumphosphatpuffer bei 350 Mikrolitern Hypos Miller Kaliumphosphatpuffer, um eine Zellschwellung zu induzieren.
Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang in hyperosmalem Puffer, bevor Sie elektrische Impulse anwenden. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn sich die Zellen ihrem maximalen Volumen nähern. Das ist, bevor sie mit dem regulatorischen Volumen beginnen.
Abnahme in unserem Experiment. Es wurde ein Zug von acht rechteckigen Pulsen mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden bei einem Hertz angelegt. Nach der Impulsabgabe.
Lassen Sie die Zellen nach 10 Minuten 10 Minuten lang ungestört. Bestimmung der Diffusionsausbeute mittels Gesichtskontrast und Fluoreszenzmikroskop. E nimmt drei Bilder auf, Gesichtskontrast, rote und grüne Fluoreszenz in fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern.
In jedem können Sie aus jedem Bild-Triplett in der Image J-Software drei Kanalbilder erstellen, um die visuelle Qualität der Bilder zu verbessern. Vorverarbeitungsschritte können auf die Originalbilder, Hintergrund-, Subtraktions- und Kontrastverbesserungen mit Standardparametersätzen angewendet werden. Schließlich werden Dreikanalbilder mit dem RGB-zu-Graubild-J-Plugin zusammengesetzt. In einem solchen Bild ist das ruhende Zytoplasma zusammen mit den Zellmembranen zu sehen.
Daher können nur wenige Zellen in der Dreikanalbildzählung aller drei Zelltypen, rot, grün und doppelt fluoreszierend, leicht bestimmt werden. Bestimmen Sie den Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen, indem Sie die Anzahl der doppelt fluoreszierenden Zellen durch die Anzahl aller Zellen in jedem Bild dividieren. Die Fusionsausbeute wird dann definiert als der Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen multipliziert mit zwei.
Da die Hälfte der Ansichtszellen nicht erkannt wird, wenn Zellen mit der gleichen Farbe angezeigt werden.
Übersicht
Dieses Video demonstriert die effiziente Elektrofusion von Zellen in vitro unter Verwendung einer modifizierten Adhäsionsmethode in Kombination mit Elektroporation. Der Prozess umfasst die Erkennung von fusionierten Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellfusionstechniken
- Elektroporationsmethoden
- Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Elektrofusion ist eine Technik, die elektrische Impulse anwendet, um die Zellfusion zu erleichtern.
- Die Methode kann die Effizienz der Erzeugung hybrider Zellen verbessern.
- Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung fusionierter Zellen.
- Das Verständnis der Zellfusion ist für verschiedene biologische Anwendungen entscheidend.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode für die Elektrofusion von Zellen zu demonstrieren.
- Die Effizienz der Zellfusion zu visualisieren und zu quantifizieren.
- Ein Protokoll bereitzustellen, das in anderen Laboratorien repliziert werden kann.
Verwendete Methoden
- Maus-Melanomzellen wurden kultiviert und für die Fusion vorbereitet.
- Fluoreszierende Farbstoffe wurden verwendet, um die Zellen vor der Fusion zu kennzeichnen.
- Elektrische Impulse wurden angewendet, um die Zellfusion zu induzieren.
- Die Fluoreszenzmikroskopie wurde eingesetzt, um die Fusionsergebnisse zu analysieren.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Fusion der Zellen wurde durch Fluoreszenz angezeigt.
- Der Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen wurde berechnet, um den Fusionsertrag zu bestimmen.
- Optimale elektrische Impulsparameter wurden für die Zelllebensfähigkeit identifiziert.
- Die visuelle Qualität der Bilder wurde durch Bildverarbeitungstechniken verbessert.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte Adhäsionsmethode ist effektiv für die elektrochemische Zellfusion.
- Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein wertvolles Instrument zur Bewertung der Fusionseffizienz.
- Dieses Protokoll kann für verschiedene Zelltypen in der Forschung angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
