Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Beim Elektroschmelzen werden kurze elektrische Hochspannungsimpulse in engem Zusammenhang auf Zellen angewendet. In diesem Video demonstrieren wir die Elektrofusion von Zellen in vitro mit Hilfe der modifizierten Adherence.Method. Die Experimente wurden an Melanomzellen der Maus durchgeführt, BF one.

Führen Sie für das Experiment die folgenden Schritte aus. Züchten Sie Zellen in zwei separaten Kulturflaschen bis zu 80 % Konfluenz. Fügen Sie separat 2,1 Mikroliter jeder Stammlösung hinzu.

10 Millimolare C-M-F-D-A bzw. CMRA auf drei Milliliter Krebs Hess Puffer in einem Zentrifugenröhrchen. Die Zellen werden zweimal mit Krebs Hess Puffer gespült und dann die Beladungslösungen in die Kolben gegeben. Belastungslösungen enthalten etwa sieben mikromolare C-M-F-D-A bzw. CMRA.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre. Während dieser ersten Inkubation gelangen Regionen frei durch Zellmembranen in das Zytosol, wo sie in Membran-IMP-permeierte Reaktionsprodukte umgewandelt werden. Nach dieser ersten Inkubation spülen Sie die Zellen aus und inkubieren Sie sie dann weitere zwei Stunden lang mit Kulturmedium.

Die Beobachtung der Zellen erfolgt mit einem Fluoreszenzmikroskop, das in der Erfassungssoftware mit einer gekühlten CCD-Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 548 Nanometer ein und wählen Sie ein geeignetes Bandpassfilter-Bedrohungsfluoreszenzbild der mit CMRA beladenen Zellen für die mit C-M-F-D-A beladenen Zellen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 492 Nanometer ein und wählen Sie einen Bandpassfilter für grüne Fluoreszenzbild-Trypsinaugen, zählen Sie die Zellen in beiden Kolben und mischen Sie rote und grüne Zellen miteinander. Stellen Sie die Zellkonzentration in einem Verhältnis von eins zu eins auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter ein.

Geben Sie einen Tropfen Zellsuspension von 20 Mikrolitern in die Mitte jeder Vertiefung. In einer 24-Multi-Well-Platte inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre, damit sich die Zellen in einer Monoschicht leicht an der Oberfläche der Vertiefung anheften und Zellkontakte untereinander herstellen können. Platzieren Sie den Multi-Well mit den Zellen auf dem Mikroskoptisch.

Positionieren Sie die Elektroden am Boden der Vertiefung und verbinden Sie sie mit dem Impulsgenerator. Um eine optimale Elektrofusion zu erreichen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sollten geeignete Parameter für elektrische Impulse verwendet werden. Diese Parameter sind abhängig von der Zelllinie und sollten in Vorversuchen bestimmt werden. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter ISO omu Kaliumphosphatpuffer bei 350 Mikrolitern Hypos Miller Kaliumphosphatpuffer, um eine Zellschwellung zu induzieren.

Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang in hyperosmalem Puffer, bevor Sie elektrische Impulse anwenden. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn sich die Zellen ihrem maximalen Volumen nähern. Das ist, bevor sie mit dem regulatorischen Volumen beginnen.

Abnahme in unserem Experiment. Es wurde ein Zug von acht rechteckigen Pulsen mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden bei einem Hertz angelegt. Nach der Impulsabgabe.

Lassen Sie die Zellen nach 10 Minuten 10 Minuten lang ungestört. Bestimmung der Diffusionsausbeute mittels Gesichtskontrast und Fluoreszenzmikroskop. E nimmt drei Bilder auf, Gesichtskontrast, rote und grüne Fluoreszenz in fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern.

In jedem können Sie aus jedem Bild-Triplett in der Image J-Software drei Kanalbilder erstellen, um die visuelle Qualität der Bilder zu verbessern. Vorverarbeitungsschritte können auf die Originalbilder, Hintergrund-, Subtraktions- und Kontrastverbesserungen mit Standardparametersätzen angewendet werden. Schließlich werden Dreikanalbilder mit dem RGB-zu-Graubild-J-Plugin zusammengesetzt. In einem solchen Bild ist das ruhende Zytoplasma zusammen mit den Zellmembranen zu sehen.

Daher können nur wenige Zellen in der Dreikanalbildzählung aller drei Zelltypen, rot, grün und doppelt fluoreszierend, leicht bestimmt werden. Bestimmen Sie den Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen, indem Sie die Anzahl der doppelt fluoreszierenden Zellen durch die Anzahl aller Zellen in jedem Bild dividieren. Die Fusionsausbeute wird dann definiert als der Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen multipliziert mit zwei.

Da die Hälfte der Ansichtszellen nicht erkannt wird, wenn Zellen mit der gleichen Farbe angezeigt werden.