Name: Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Lernen Sie die Elektrofusion von Zellen in vitro mit modifizierter Adhärenzmethode und Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht effiziente Hybridzell-Erzeugung für biologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der slowenischen Research Agency (Projekt J2-9764 und das Programm P2-0249) unterstützt. Dieses Video stellt ergänzendes Material für die &quot;Elektroporation basierenden Technologien und Behandlungsmethoden&quot; wissenschaftlichen Workshop und Aufbaustudium, von der Fakultät für Elektrotechnik an der University of Ljubljana, Slowenien organisiert.

I. Das Laden der Zellen mit Cell-Tracker CMFDA und CMRA <ol><li> Die Experimente wurden auf vorher vorbereiteten Zellen der Maus-Melanom-Zelllinie (B16-F1) durchgeführt. Die Zellen werden in zwei getrennten 25 cm 2 Kulturflaschen (TPP, ZDA) auf 70-80% Konfluenz in DMEM Kulturmedium (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium) mit 10% fötalem Rinderserum, 0,15 mg / ml L-Glutamin, 16 mg ergänzt gewachsen / ml Gentamycin (alle von Sigma-Aldrich, Deutschland), 200 Einheiten / ml crystacillin (Pliva, Kroatien) und inkubiert in 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie zwei 10 mM Stammlösungen von Cell-Tracker (Invitrogen, USA) durch Zugabe von 10,76 ul und 9 ul (für Grüne CMFDA und für Orange CMRA jeweils) DMSO (Sigma-Aldrich, Deutschland) bis 50 ug des Farbstoffes in der ursprünglichen Invitrogen Durchstechflasche. Die Stammlösung kann in einem Kühlschrank bei 4 ° C für wenige Monate gelagert werden. Vor Beginn der Experimente, warm up der Lösung, bis sich die Kristalle von DMSO auflösen. </li><li> Bereiten Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer (130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mM D-Glucose, 1,3 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,4). In zwei 15 ml Eppendorf-Röhrchen getrennt Mix 2,1 ul jeder Stammlösung (10 mM CMFDA oder CMRA jeweils) in 3 ml Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer. Dies ergibt eine "loading solution" mit etwa 7 uM CMFDA (oder CMRA). </li><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit Bicarbonat-freien Krebs-Hepes-Puffer und fügen Sie dann loading Lösungen in den Kolben. Inkubieren Zellen für 30 Minuten in 5% CO 2 bei 37 ° C. Während dieser ersten Inkubation Reagenzien frei durch Zellmembranen, aber einmal im Inneren der Zelle werden die Reagenzien in Zell-impermeante fluoreszierende Reaktionsprodukte umgewandelt. </li><li> Nach der ersten Inkubation, spülen und inkubieren Zellen mit Kulturmedium für weitere zwei Stunden in 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Trypsinize Zellen in beiden Flaschen (beladen mit CMFDA und CMRA) und mischen rote und grüne Zellen in einem Verhältnis 1:1 in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (TPP, ZDA). Passen Zellkonzentration auf 5 x 10 6 Zellen / ml durch Verdünnung mit DMEM-Medium oder durch Konzentration mit Zentrifuge. Legen Sie eine 20 pl Tropfen Zellsuspension in jede Vertiefung von 24 Multiwellplatte (TPP, ZDA). Inkubieren Zellen in 5% CO 2 bei 37 ° C für 20 min, damit sie leicht auf der Oberfläche des gut befestigen und zu etablieren Zell-Kontakten. </li></ol> II. Elektrofusion <ol><li> Bereiten isoosomolar Kaliumphosphatpuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM Saccharose) und hypoosmolar Kaliumphosphatpuffer (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1 mM MgCl 2, 75 mM Saccharose) . </li><li> Legen Sie die Multiwell mit Zellen auf dem Mikroskoptisch, Position der Elektroden an der Unterseite des Brunnens und verbinden sie mit dem Impulsgenerator. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 1 ml isoosomolar Kaliumphosphatpuffer. Add 350 ul hypoosmolar Kaliumphosphatpuffer um Zellschwellung zu induzieren. Der Puffer sollte sich auf den Elektroden. </li><li> Lassen Sie Zellen in hypoosmolar Puffer für 2 Minuten vor dem Anlegen von elektrischen Impulsen. Während dieser Zeit Zustrom von Wasser-Moleküle in die Zellen durch osmotischen Ungleichgewicht zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zellen zu einem Anstieg des Zellvolumens. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn Zellen in der Nähe ihrer maximalen Volumina werden, bevor regulatorischen Volumenabnahme starten. </li><li> Um eine optimale Elektrofusion erreichen und aufrechtzuerhalten Lebensfähigkeit der Zellen, sollten die optimalen Parameter der elektrischen Impulse genutzt werden. Diese auf Zelllinie verwendet [1] ab. In diesem Experiment ein Zug von 8 Rechteckimpulse (jeweils mit einer Dauer von 100 us bei 1 Hz) ist zu jeder Probe aufgebracht, mittels Elektroporation Gerät (in unserem Fall Cliniporator, IGEA, Italien). Die Impulse werden auf zwei parallel Pt / Ir-Draht-Elektroden mit 0,8 mm Durchmesser und 5 mm Abstand zwischen ihnen ausgeliefert, der ein elektrisches Feld von etwa 1200 V / cm zwischen den Elektroden in jedem gut, außer für die Steuerung gut. </li><li> Lassen Sie die Zellen ungestört 10 Minuten nach dem Puls-Lieferung. Bestimmen Sie die Fusionsausbeute mittels Fluoreszenz-und Phasenkontrast-Mikroskopie. </li></ol> III. Bildaufnahme und die Bestimmung des Fusionsausbeute <ol><li> Die Zellen werden beobachtet mit einem Fluoreszenzmikroskop (in unserem Fall Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Deutschland) mit einem Objektiv (x20) und eine gekühlte CCD-Kamera (VisiCam 1280, Visitron, Deutschland) ausgestattet. Die Bilder werden in MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA) erworben, aber auch andere ähnliche Software zur Erfassung kann ebenfalls verwendet werden. CMFDA ist mit einem Monochromator (Polychrome IV, Visitron, Deutschland) bei 492 nm und CMRA bei 548 nm angeregt. Die Fluoreszenz der CMFDA und CMRA erworben wird mit zwei Emissionsfilter, einer bei 535 nm zentriert (HQ535/30m für CMFDA) und die andere zentriert bei 510 nm (D605/55m, für CMRA, sowohl Chroma, USA). Die Verwendung von dichroitischen Spiegel (Q515LP) verhindert den Kanal Übersprechen. </li><li> Erwerben Sie drei Bilder (Phasenkontrast, rote und grüne Fluoreszenz) für fünf zufällig ausgewählte Felder in jedem gut. Erstellen Sie drei Kanal-Bilder aus jedem Bild Triplett. In einem solchen Bild fluoreszierenden Zytoplasma kann zusammen mit den Zellmembranen gesehen werden. Fusionierten Zellen können somit einfach bestimmt werden [Abb. 1]. </li><li> Zählen Sie alle drei Arten von Zellen (rot, grün und dual fluoreszierend) in jeweils drei Kanal-Bild. Bestimmen Sie den Prozentsatz der dual fluoreszierenden Zellen, indem die Zahl der dual fluoreszierenden Zellen mit der Anzahl aller Zellen in jedem Bild. Fusion Ausbeute ist definiert als der Anteil der dual fluoreszierenden Zellen mit 2 multipliziert definiert, da die Hälfte der fusionierten Zellen nicht erkannt werden (wenn die Zellen in der gleichen Farbe Sicherung). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Drei-Kanal-Aufnahme von B16F1 Zellen nach Elektrofusion:. Phasenkontrast, CMRA Fluoreszenz (Anregung bei 548 nm) und CMFDA Fluoreszenz (Anregung bei 492 nm), Objektiv-Vergrößerung 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Die Fähigkeit der Zellmembranen zu unspezifisch, zB durch äußere elektrische Felder, Sicherung ist für die Biotechnologie, Medizin und Forschung in der Biologie wichtig. Solche unspezifischen Fusion ermöglicht die Produktion von hochwertigen Hybrid-Zellen und ihre Produkte, wie monoklonale Antikörper, und liefert Informationen über grundlegende Mechanismen der Fusion [2]. Elektrofusion ist eine potenziell sehr wirksame Methode, da kann es richtig, um verschiedene Arten von Zellen eingestellt werden. Elektrofusion wird erreicht, wenn Zellen in engen körperlichen Kontakt in ihre fusogene Zustand gebracht werden (Gefahr der Fusion) mit Hilfe von Hochspannungs-elektrischen Impulsen. Die Effizienz der Elektrofusion hängt von verschiedenen Parametern, die beiden Teile der Elektrofusion Prozess beeinflussen. Erster Teil des Heizwendel-ist das Erreichen des engen körperlichen Kontakt zwischen den Zellen, die mit verschiedenen Methoden erhalten werden [3-8]. Die Einhaltung Methode (wachsenden Zellen bis zur Konfluenz) können effizient durch spontan entstandene Zellkontakte in großen Zonen zwischen Zellen verwendet werden, jedoch bringt es sehr große fusionierten Zellen mit vielen Kernen. Wir sind mit der modifizierten Einhaltung Methode, wo kleinere Zellen (mit 2 bis 5 Kerne), die eher zu überleben und sich vermehren, gewonnen werden (Abbildung 1). Kontakt zwischen den Zellen auch aus osmotischen Schwellung der Zellen profitieren durch osmotische Behandlung im Experiment [9] verwendet. Zweiter Teil der Elektrofusion Prozess ist das Erreichen der fusogene Zustand der Zellmembranen. Fusogene Zustand korreliert gut mit electropermeabilized Zustand der Membran (Zellen sind unspezifisch permeabilisiert, um Moleküle, die normalerweise nicht durch die intakte Membran passieren können) und wird von den gleichen Parametern der elektrischen Impulse (Amplitude, Länge, Anzahl und Häufigkeit) geregelt [10] . Die Werte der elektrischen Parameter für die optimale Elektroporation benötigt [1] und Elektrofusion zwischen verschiedenen Zellen unterschiedlich und hängen von Zellen Größe und ihrer biologischen Eigenschaften. Elektrische Parameter müssen daher für verschiedene Zelllinien, die als Fusionspartner verwendet werden, die Fusion zu erhalten optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Im Zytosol fluoreszierender Farbstoff</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Im Zytosol fluoreszierender Farbstoff</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Crystacillin</td><td>Reagenz</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagenz</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagenz</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagenz</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Elektrischer Impulsgeber</td><td>Werkzeug</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Mehrfach-Platte</td><td>Werkzeug</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Werkzeug</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;-Kulturgefäß</td><td>Werkzeug</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Elektroden</td><td>Werkzeug</td><td>Individuell angefertigt</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

zell elektroschweißmuffe visualisierte mit fluoreszenz-mikroskopie

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Zell Elektrofusion ist eine sichere, nicht-virale und nicht-chemischen Methode, die für die Vorbereitung Hybridzellen für die menschliche Therapie eingesetzt werden können. Elektrofusion umfasst die Anwendung von kurzen Hochspannungs-elektrische Impulse auf Zellen, die in engem Kontakt sind. Anwendung von kurz-, Hochspannungs-elektrische Impulse bewirkt eine Destabilisierung der Zell-Plasmamembranen. Destabilisierte Membranen sind durchlässig für verschiedene Moleküle und auch anfällig für Fusion mit einer benachbarten destabilisiert Membranen. Elektrofusion ist somit eine bequeme Methode, um eine unspezifische Verschmelzung von sehr verschiedenen Zellen zu erreichen<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Um fusion, Zellmembranen, durch elektrisches Feld destabilisiert zu erhalten, muss in einem engen Kontakt sein, damit Zusammenlegung ihrer Lipid-Doppelschichten und damit ihrem Zytoplasma. In diesem Video zeigen wir, effiziente Elektrofusion von Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Durch modifizierte Einhaltung Methode. Bei dieser Methode, Zellen dürfen nur leicht anzubringen, um die Oberfläche des gut, so dass mittelfristig ausgetauscht werden können und Zellen noch behalten ihre Kugelform. Fusion Visualisierung wird durch pre-Kennzeichnung von dem Zytoplasma von Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Zellen tracker Farbstoffe untersucht, die Hälfte der Zellen sind mit orangen CMRA und die andere Hälfte mit grünen CMFDA gekennzeichnet. Fusion Ausbeute ist definiert als die Anzahl der dual fluoreszierenden Zellen mit der Anzahl aller Zellen durch zwei dividiert bestimmt.

In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von Zellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Durch modifizierte Einhaltung Methode mittels Elektroporation und der anschließenden Detektion der fusionierten Zellen Visualisierung mit Fluoreszenzmikroskopie.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Zell-Elektrofusion ist eine sichere, nicht-virale und nicht-chemische Methode, die zur Herstellung von Hybridzellen für die humane Therapie eingesetzt werden kann. Die Elektrofusion beinhaltet ...

Die Elektrofusion beinhaltet die Anwendung kurzer elektrischer Hochspannungsimpulse auf eng beieinander liegende Zellen. In diesem Video demonstrieren wir die Elektrofusion von Zellen in vitro mithilfe der modifizierten Adhärenz-Methode. Die Experimente wurden an Maus-Melanomzellen, BF eins, durchgeführt.Führen Sie für das Experiment die folgenden Schritte durch. Kultivieren Sie Zellen in zwei separaten Zellkulturkolben bis zu 80 % Konfluenz. Geben Sie separat jeweils 2,1 µL der Stammlösungen hinzu.10 Millimolar C-M-F-D-A bzw. CMRA zu drei Millilitern Krebs-Hess-Puffer in einem Zentrifugenröhrchen geben. Die Zellen zweimal mit Krebs-Hess-Puffer spülen und anschließend die Beladelösungen in die Kolben geben. Die Beladelösungen enthalten jeweils etwa sieben Mikromolar C-M-F-D-A bzw. CMRA.Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre. Während dieser ersten Inkubation gelangen die Reagenzien frei durch die Zellmembranen in das Zytoplasma, wo sie in membraneinpermeable Reaktionsprodukte umgewandelt werden. Nach dieser ersten Inkubation spülen Sie die Zellen und inkubieren sie anschließend zwei weitere Stunden mit Kulturmedium.Die Zellen werden mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer gekühlten CCD-Kamera in der Aufnahmesoftware ausgestattet ist, beobachtet. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 548 Nanometer ein und wählen Sie einen geeigneten Bandpassfilter, um das Fluoreszenzbild der mit CMRA beladenen Zellen aufzunehmen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 492 Nanometer ein und wählen Sie einen Bandpassfilter für das grüne Fluoreszenzbild, um die Trypsin-Augen zu zählen, und zählen Sie die Zellen in beiden Kolben. Mischen Sie rote und grüne Zellen im Verhältnis eins zu eins zusammen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter ein.Geben Sie einen Tropfen mit 20 µL Zellsuspension in die Mitte jedes Wells. Inkubieren Sie die Zellen in einer 24er-Mehrfachplatte unter kontrollierter Atmosphäre für 20 Minuten, damit sich die Zellen leicht in einer einfachen Schicht an der Oberfläche des Wells anheften und untereinander Zellkontakte ausbilden können. Stellen Sie die Mehrfachplatte mit den Zellen auf den Mikroskoptisch.Platzieren Sie die Elektroden am Boden der Vertiefung und verbinden Sie sie mit dem Impulsgeber. Um eine optimale Elektrofusion zu erreichen und die Zellviabilität aufrechtzuerhalten, sollten geeignete Parameter für die elektrischen Impulse verwendet werden. Diese Parameter hängen von der Zelllinie ab und müssen in Vorversuchen bestimmt werden. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter ISO omu Kaliumphosphatpuffer bei 350 Mikrolitern hypos Miller Kaliumphosphatpuffer, um eine Zellschwellung zu induzieren.Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang im hyperosmotischen Puffer, bevor elektrische Impulse appliziert werden. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn sich die Zellen nahe ihrem maximalen Volumen befinden, also bevor sie die regulierende Volumenanpassung einleiten.Abnahme in unserem Experiment. Es wurde ein Impulszug aus acht rechteckigen Impulsen mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden bei einem Hertz angelegt. Nach der Impulsabgabe.Lassen Sie die Zellen nach 10 Minuten für 10 Minuten ungestört. Bestimmen Sie die Diffusionsausbeute mittels Hellfeldkontrast und Fluoreszenzmikroskopie. Erstellen Sie drei Bilder, Hellfeldkontrast sowie rote und grüne Fluoreszenz, in fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern.In jedem Fall erstellen wir aus jedem Bildtriplett mit der Image-J-Software Dreikanalbilder, um die Bildqualität visuell zu verbessern, sodass Vorverarbeitungsschritte wie Hintergrundsubtraktion und Kontrastverbesserung mit Standard-Parametersätzen auf die ursprünglichen Bilder angewendet werden können. Abschließend werden die Dreikanalbilder mithilfe des RGB-zu-Graustufen-Plugins von Image J zusammengesetzt. In einem solchen Bild sind das ruhende Zytoplasma sowie die Zellmembranen sichtbar.Daher können in der Dreikanal-Bildzählung leicht nur wenige Zellen erfasst werden, die alle drei Zelltypen – rote, grüne und doppelt fluoreszierende Zellen – enthalten. Ermitteln Sie den Prozentsatz doppelt fluoreszierender Zellen, indem Sie die Anzahl der doppelt fluoreszierenden Zellen durch die Gesamtanzahl aller Zellen in jedem Bild dividieren. Die Fusionseffizienz wird dann als der doppelte Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen definiert.Da die Hälfte der Ansichtszellen nicht erfasst wird, wenn Zellen derselben Farbe angezeigt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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