Phänotypisierung Maus Lungenfunktion In-vivo- Mit der Lungendiffusionskapazität

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu lernen, wie man die Diffusionskapazität der Lunge einer Maus mit einem kalibrierten Gaschromatographen messen kann. Dies wird erreicht, indem die Lungen einer betäubten Maus mit Neon- und Kohlenmonoxid enthaltenem Gas aufgeblasen, das Gas neun Sekunden lang in der Lunge gehalten und das Gas aufgefangen wird. Das aus der Lunge entnommene Gas wird dann auf zwei Milliliter verdünnt und in den Gaschromatographen injiziert.

Die differentielle Aufnahme von Neon und Kohlenmonoxid in der Lunge wird zur Berechnung der Diffusionskapazität verwendet. Diese Messung kann verwendet werden, um den Verlust der Lungenfunktion in einem breiten Spektrum von Lungenkrankheitsmodellen zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber allen anderen bestehenden Methoden zur Messung der Lungenfunktion bei der Maus besteht darin, dass es sich um eine sehr einfache, reproduzierbare Messung handelt, die direkt mit ähnlichen Messungen beim Menschen verglichen werden kann.

Diese Methode kann verwendet werden, um die Veränderungen in der Lungenstruktur zu verfolgen, die bei einer Vielzahl von Lungenpathologien auftreten. Dieses Protokoll beginnt mit der Einrichtung des mit dem Gerät gelieferten Gaschromatographenmoduls zur Messung von Peaks für Stickstoff, Sauerstoff, Neon und Kohlenmonoxid. Für diese Anwendung werden nur die Neon- und Kohlenmonoxiddaten benötigt.

Das Instrument verwendet eine Molekularsiebsäule mit Helium als Trägergas. Dieser spezielle Gaschromatograph verfügt über eine 0,8-Milliliter-Säule und eine Zwei-Milliliter-Probe wird verwendet, um eine ausreichende Reinigung dieser Säule vor dem Start zu gewährleisten. Eine Reihe von Messungen kalibriert das Gerät immer mit zwei Millilitern Gas direkt aus dem Gasprobenbeutel.

Der erste Peak, der erscheint, ist das Neon, dann Sauerstoff und Stickstoff, die wir für dieses Verfahren nicht messen. Schließlich erscheint der Kohlenmonoxid-Peak als die Zeit für den Gaschromatographen. Um all diese Spitzen zu messen, dauert es weniger als eine Minute.

Betäuben Sie die Mäuse zunächst mit Ketamin und Xylazin. Bestätigen Sie die Anästhesie durch das Fehlen einer Reflexbewegung als Reaktion auf ein Zehenklemmen. Um die Augen zu schützen, tragen Sie dann eine Veterinärsalbe auf und tracheostomien Sie die Mäuse mit einer Studenkanüle.

Verwenden Sie eine 18-Gauge-Kanüle für Erwachsene oder eine 20-Gauge-Kanüle für sehr junge Mäuse. Starten Sie als Nächstes das Metronom mit hörbarem Klicken im Sekundentakt. Bei Mäusen, die älter als sechs Wochen sind, verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Spritze, um 0,8 Milliliter Gas aus dem Gasgemischbeutel zu ziehen.

Wenn die Maus weniger als vier Wochen alt ist, verwenden Sie 0,4 Milliliter Gas, verbinden Sie dann die Spritze mit der Trachealkanüle und blasen Sie die Lunge schnell auf. Beginnen Sie, mental von eins bis 10 synchron mit den Metronomklicks zu zählen. Wenn die Zählung 10 erreicht, ziehen Sie schnell das Volumen von 0,8 Millilitern heraus.

Verdünnen Sie dieses ausgeatmete Gas auf zwei Milliliter, indem Sie mindestens 15 Sekunden lang Raum, Luft und Gewicht hinzufügen. Es ist sehr wichtig, die Lunge so schnell wie möglich aufzublasen und zu entleeren. Ein schnelles Aufblasen ist sehr einfach, aber es braucht ein wenig Übung, um die 0,8 mls schnell präzise zu entnehmen, dann die gesamte Probe in den Gaschromatographen zu injizieren.

Für die Analyse ist es wichtig, eine Kontamination der Probe beim Transfer zum und vom Tier und zum Gaschromatographen zu vermeiden. Dies kann vorsichtig erfolgen, indem das Schild mit einem Finger verschlossen wird, während der GC die Probe misst. Blasen Sie die Mauslunge mit weiteren 0,8 Millilitern Gasgemisch aus dem Beutel auf und verarbeiten Sie diese Probe dann identisch wie die erste.

Berechnen Sie anhand der Durchschnittswerte aus den beiden Messungen den DFCO. Der Index C bezieht sich auf die Kalibriergase und der Index neun auf die Proben, die vom Tier entnommen wurden. Nach dem neunsekündigen Atemanhalten.

Ein nominaler Kontroll-DFCO-Wert, der von C 57 schwarzen sechs Mäusen entnommen wurde, beträgt etwa 0,77. In einer Studie mit einem PR-8-Influenzamodell wurde an Tag sechs und acht in einem Emphysemmodell 21 Tage nach der Installation der Elastasen ein fortschreitender Funktionsverlust beobachtet. Die DFCO war moderat erniedrigt, aber es gab viel größere Veränderungen im Modell der Fibrose, die durch die Installation von Blio Mycin induziert wurde.

Der durch Bleomycin verursachte fibrotische Signalweg führte zu der größten Veränderung des DFCO, die in allen pathologischen Modellen beobachtet wurde. Dies ist wichtig, da die Diffusionskapazität auch beim Menschen ein zuverlässiger Marker für Fibrose ist. Das CFTR-Gen spielt eine entscheidende Rolle bei Mukoviszidose und in einer Studie an Mäusen, denen dieses Gen fehlte, gab es eine signifikante Abnahme der DFCO.

Die DFCO war bei diesen Knockout-Mäusen durch Pilzinfektionen weiter verringert. Ein häufig verwendetes Modell für Lungenverletzungen ist LPS. Bei Mäusen, die LPS ausgesetzt waren, kam es vom ersten bis zum vierten Tag zu einem fortschreitenden zeitabhängigen Verlust der Lungenfunktion, wie durch DFCO-Messungen beurteilt wurde. Die Messung von DFCO kann bei Mäusen im Alter von nur zwei Wochen erfolgreich durchgeführt werden.

Die kleinere Größe der Lunge erfordert ein kleineres Aufblasvolumen von 0,4 Millilitern. Der mit diesem kleineren Volumen gemessene DFCO ist in der Lage, die erwartete Zunahme mit zunehmender Reife der Lunge zu zeigen, sobald sie beherrscht ist. Diese Technik kann in nur wenigen Minuten pro Maus durchgeführt werden, bevor andere Messungen oder Bewertungen der Lungenfunktion durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Aufblas- und Entleerungsschritt schnell durchgeführt wird und dass Sie beim Übertragen der Probe vorsichtig sind, damit eine Kontamination verhindert wird.