Entwicklung eines In vitro Modellsystem für die Untersuchung der Wechselwirkung von Equus Caballus IgE mit seinen hochaffinen Rezeptors FcsRI

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Menge der IgE-abhängigen Mediatorfreisetzung aus RAD Basophilen Leukämiezellen zu messen. Die Allergiesymptome werden durch die Freisetzung von Mediatoren wie Histamin verursacht. Nun ist Histamin nicht der einzige Vermittler, der von Basophilen freigesetzt wird, sondern Mastzellen.

Die Summe aller Mediatoren, die von diesen Zellen freigesetzt werden, führt zu den Anzeichen und Symptomen einer sofortigen und verzögerten Überempfindlichkeit. Nun ist der Mensch nicht der einzige Organismus, der an Allergien leidet, auch Hunde und Pferde leiden. Um die Forschung weiterzuentwickeln und Behandlungen gegen Allergien wie Impfstoffe zu finden, ist ein Freisetzungsassay erforderlich, um die Menge der gegebenenfalls aus der Forschungsbehandlung freigesetzten Mediatoren zu quantifizieren.

Dies ist der Grund für diesen Freigabe-Assay. Der RBL-Mediator-freigegebene Assay für das menschliche System wurde erstmals 1986 von Ian und Hook entwickelt und veröffentlicht. Es wurde später für das DOC-System und nun für das Pferdesystem entwickelt.

Die Modifikationen sind so einfach wie das Ändern der Proteine, die von Interesse sind. Die Zelllinien-Neuigkeit war die Ratten-Baso-Leukämie oder RBL zwei H 3.1-Zelllinie, die die Alpha-Kette der Pferde-High-FNT-ffc-Serin-R-Eins-Rezeptoren auf eine Zelldichte von 500.000 Zellen pro Milliliter exprimiert. Geben Sie den interessierenden IgE-Antikörper bis zu einer Endkonzentration von einem Nanogramm pro Milliliter hinzu.

Geben Sie 100 Mikroliter der Mischung in eine 96er Bodenplatte und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 37 Grad. Dadurch können die Zellen an der Well-Oberfläche haften und der Antikörper bindet an seine Rezeptorwaschung. Das Doppelte des Mediums, das den restlichen ungebundenen Antikörper und die toten Zellen enthält, mit 100 Mikrolitern warmem 37-Grad-Puffer zur Freisetzung.

Entsorgen Sie den Puffer von der letzten Wäsche und ersetzen Sie ihn durch 100 Mikroliter des interessierenden Antigens in der interessierenden Konzentration. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 37 Grad werden 50 Mikroliter des SUP-Natin, das die Freisetzungsmediatoren enthält, in eine neue Vertiefung überführt und der verbleibende Überstand durch 50 Mikroliter Triton X-Puffer ersetzt, um die Zellen zu verlagern und die verbleibenden Mediatoren in den Zellen freizusetzen. Bei 50 Mikrolitern von 2 Millionen molaren beta hx.

Viele Tage Substrat in Citratpuffer gelöst. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 Grad geben Sie 150 Mikroliter Tris-Puffer in jede Vertiefung und färben Sie die Vertiefung gelb. Messen Sie die Farbabsorption bei 405 Nanometern nach 16 Stunden.

Erwärmen Sie den Freisetzungs-Assay-Puffer, auch bekannt als Ian-Puffer, auf 37 Grad. Bereiten Sie auch den Konzentrationsgradienten des Antigens in Freisetzungspuffer bei Konzentrationen vor. Null 0,1, 1, 10, 100, 1000 und 10.000 Nanogramm pro Milliliter.

Dann warm bei 37 Grad. Waschen Sie die Vertiefungen, indem Sie die Schale schnell schnippen, um das Medium zu entfernen, und fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter Warmfreisetzungspuffer in Richtung der Wände der Vertiefungen hinzu. Dies dient dazu, den Stress der Zellen durch Temperaturunterschiede zu reduzieren, die dazu führen, dass sie vorzeitig Mediatoren freisetzen.

Das Geschirr sollte zweimal gespült werden. Den Puffer für die endgültige Freisetzung verwerfen, waschen und 100 Mikroliter Antigen hinzufügen, beginnend mit null Antigenkonzentration in Reihe A für die Negativkontrolle und entlang des Konzentrationsgradienten von Reihe B nach G und schließlich zu Triton X-Scheiben, Puffer in Reihe H. Das ist für die Positivkontrolle. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad.

Dies ist der Punkt, an dem die Zellen nach der Inkubationszeit Mediatoren freisetzen. Übertragen Sie 50 Mikroliter der Flüssigkeit in jeder Vertiefung in die jeweilige Vertiefung. In den Spalten sieben bis 12 wird die verbleibende Flüssigkeit an den Positionen eins bis sechs vollständig herausgepeppt und durch 50 Mikroliter Triton X Lysepuffer ersetzt.

Geben Sie 50 Mikroliter des vorbereiteten Substrats in alle 96 Vertiefungen der Schale. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad. Das Beta H wandelt das Substrat über viele Tage in vier Nitrophenole um.

Nach der Inkubationszeit stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 150 Mikroliter Tris-Puffer hinzufügen, wodurch die vier Nitrophenole eine gelbe Farbe annehmen. Lesen Sie die Platte mit einem Plattenspektralphotometer bei 405 Nanometern ab. Nach der Messung der Absorptionsdaten wird die Gesamtmenge der Mediatoren in den Zellen in den Vertiefungen Position A eins durch Multiplikation berechnet.

Die entsprechende Vertiefung befindet sich an der Position a sieben mal zwei und addiert das Ergebnis zum Wert bei eins. Dies liegt daran, dass wir während des Experiments das Supinat, das die Freisetzungsmediatoren gegen A enthält, eins haben, als wir es in eine neue Bohrlochopposition übertragen haben. Eine Sieben.

Wiederholen Sie die Berechnungen für die restlichen Vertiefungen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Freisetzungsmediatoren in der Vertiefungsopposition A sieben aus den berechneten Gesamtmediatoren in den Zellen, indem Sie den Wert der Position A sieben mit zwei multiplizieren. Nochmals, weil wir während des Experiments das Supernat haben, das die Reese-Mediatoren enthält.

Wenn wir es in ein neues übertragen, multiplizieren wir dieses Produkt mit 100 und dividieren dieses Produkt durch den entsprechenden Gesamtwert der Mediatoren in den Zellen für diese Position. Daraus ergibt sich der prozentuale Anteil der Freisetzungsmediatoren für den Wellengang. Wiederholen Sie die Berechnungen für den Rest der Vertiefungen, da die sechs Schwellungen in jeder Reihe durch die gleiche Konzentration des Antigendurchschnitts herausgefordert werden.

Diese Werte und die Berechnung der Standardabweichung stellen Sie wie folgt in einem Diagramm dar. Die Grafik zeigt, dass mit zunehmender Antigenkonzentration mehr Mediatoren freigesetzt werden, bis sie einen Höchstwert von 100 Nanogramm pro Milliliter erreicht, wonach die Mediatorfreisetzung mit zunehmender Antigenkonzentration abnimmt. Das endgültige experimentelle Ergebnis sollte wie in diesen Diagrammen aussehen, wie in Grafik B zu sehen ist.Der Kontroll-Release-Assay in hellblau enthält keine IgE-Antikörper und zeigt daher keine Veränderung der Mediatorfreisetzung mit zunehmender Antigenkonzentration

Vergleichen Sie dies mit dem experimentellen Ergebnis in dunkelblau, das IgE-Antikörper enthalten könnte. Dies ist ein Beispiel für einen Anti-IgE-Impfstoff, der auf seine Sicherheit getestet wird. Aus dieser Grafik in Rot geht hervor, dass das Anti-IgE-Serum die Rezeptoren auf der Zelloberfläche vernetzt, was dazu führt, dass die RBL-Zellen degranulieren, genau wie bei der Positivkontrolle in Lila im Vergleich zur Negativkontrolle in Grau, was diesen Impfstoff unsicher macht.

Dieser Assay ist sehr nützlich, da er die Freisetzung von Mediatoren oder deren Verzögerung beim Testen potenzieller Antiallergika oder Impfstoffe messen kann. Kann auch für das menschliche Hunde- oder Pferdesystem angepasst werden, wie gezeigt. Der Assay kann die erfolgreiche oder erfolglose Blockierung der Mediatorfreisetzung beim Testen von Antiallergie-Antikörpern bestimmen.