Ein Ex-vivo- Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Ex-vivo-Modell der menschlichen Brust bereitzustellen, das die Gewebearchitektur, die interzellulären Wechselwirkungen und die Hormonreaktion beibehält, um die Hormonwirkung zu untersuchen. Das Modell basiert auf menschlichen Gewebemikrostrukturen, die durch erstes Präparenchym des Brustparenchyms hergestellt werden, das aus Gängen und Läppchen des fetten Mammastromas besteht. Das Stroma enthält neben Adipozyten auch Fibroblasten, Immunzellen und Endothelzellen.

Ist das Parenchymgewebe vom Fett befreit, wird es mit Hilfe von gegenüberliegenden Skalpellen mechanisch in stecknadelkopfgroße Stücke zerlegt. Anschließend wird die Gewebemasse einer enzymatischen Verdauung unterzogen, wobei auf Wunsch eine Kollagenase-Hormonstimulation mit diesem Schritt verbunden werden kann. Die Gewebemikrostrukturen werden dann durch Zentrifugation zurückgewonnen, gefolgt von der Entfernung der verbleibenden mit Fibroblasten angereicherten Fraktion des Fettgewebes und der roten Blutkörperchen.

Nach einem Regenerationsverfahren wird die Suspension des verbleibenden verdauten Brustgewebes mit Gewebemikrostrukturen angereichert, die luminale und myoepitheliale Zellen mit der umgebenden Basallamina, Fibroblasten-Endothelzellen und Immunzellen enthalten. Letztendlich wird die Ex-vivo-Kultivierung verwendet, um die Morphologie der Mikrostruktur zu bewerten. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung wird verwendet, um die Subpopulationen der Brustzellen zu trennen, und die Protein- und Transkriptomanalyse wird für Studien zur Hormonreaktivität verwendet.

Hormone steuern die Brustentwicklung und sind wichtig für die Entstehung von Brusttumoren. Die Hormonsignalisierung wurde hauptsächlich bei Brustkrebs, Zelllinien in Gewebekulturen und plastischen Erkrankungen untersucht. Wenn jedoch primäre Brustepithelzellen in vitro kultiviert werden, verlieren sie die Expression von Hormonrezeptoren.

Jetzt bleiben die Gewebemikrostrukturen, die wir aus chirurgischem Entwurfmaterial gewinnen, hormonreaktiv, und Patientenproben spiegeln sich in der individuellen Vielfalt wider. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Gewebeverdauung und die Gewinnung von Mikrostrukturen aus heterogenen Geweben durchgeführt werden. Die menschliche Brustdrüse ist komplex.

Die Kollagenkonzentration und die Verdauungszeit sind entscheidend, um eine Teilverdauung oder eine Überverdauung zu vermeiden. Dieses ex vivo-Modell kann uns helfen zu verstehen, wie die Fortpflanzungshormone auf die menschliche Brust wirken und durch welche Mechanismen sie die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs behindern. Zu Beginn werden die Flaschen mit den Gewebeproben in einen Laminar-Flow-Schrank in einem P-Zwei-Zellen-Raum gebracht, der auf einem sterilen Schneidebrett gearbeitet wird.

Halten Sie das Material mit einer Pinzette fest und kratzen Sie das restliche Fett und die Gefäße mit einem Skalpell vom Brustparenchym ab. Legen Sie das weiße Material in phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale. Nachdem Sie das Fettgewebe von allen Stücken entfernt und gemäß den Sicherheitsregeln des Labors entsorgt haben, legen Sie die weißen Teile, die das Epithelgewebe enthalten, mit gegenüberliegenden Skalpellen wieder auf das Schneidebrett, schneiden Sie das Gewebe ab und hacken Sie es in Stücke mit einem Durchmesser von weniger als zwei Millimetern.

Das zerkleinerte Material wird in Röhrchen geeigneter Größe für Paraffin-, Einbettungs- und Hormonstimulationen gegeben. Verwenden Sie einen Milliliter Material in einer Fünf-Milliliter-Tube. Verwenden Sie bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung oder Fakten 2,5 Milliliter Material in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Beim Einfrieren von Aliquoten werden 10 Milliliter zerkleinertes Material in einer 50-Milliliter-Tube verwendet. Fügen Sie dann die Verdauung hinzu. Mastermix, der Kollagenase A in einem Volumen enthält, das bis zu viermal so hoch ist wie die Menge des aufgeschlossenen Materials, um eine ausreichende Bewegung und Belüftung zu gewährleisten.

Als nächstes fügen Sie Hormone in der gewünschten Konzentration zur Stimulation mit 17 Beta-Östradiol und Gestagenstein hinzu. Verwenden Sie eine Endkonzentration von 20 Nanomolaren. Fügen Sie das Fahrzeug nur zur Kontrolle hinzu, rühren oder mischen Sie die Proben sehr gut, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Material entlang der Zentrifugenröhrchen verteilt.

Legen Sie dann die Röhrchen über Nacht auf den Walzenmischer in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 40 U/min. Lassen Sie die Verdauung mindestens 12 Stunden lang stattfinden, um das Gewebe wiederherzustellen. Mikrostrukturen zentrifugieren die Röhrchen zunächst fünf Minuten lang bei 400 Gs.

Nachdem das Fett von der Oberseite des Zentrifugenröhrchens abgesaugt wurde, wird der verbleibende wässrige Überstand, der mit Fibroblasten angereichert ist, in ein neues Zentrifugenröhrchen übertragen. Dann zentrifugieren Sie den wässrigen Überstand bei 1.250 G für fünf Minuten. Da die Mikrostrukturen des Brustgewebes für alle nachfolgenden außer reus sehr klebrig sind, wird das Pellet durch sanftes Rühren durch Pipettieren aufgrund der Gefahr des Materialverlustes nicht empfohlen.

Als nächstes resuspendiert die Reanimation der Pellets, die mit Mikrostrukturen in PBS 2%FCS angereichert sind, auch die Pellets, die mit Fibroblasten angereichert sind, die aus dem wässrigen Überstand in PBS 2%FCS gewonnen wurden, nachdem beide Röhrchen zentrifugiert wurden. Entsorgen Sie wie zuvor den Überstand und die Reanimation, suspendieren Sie die Pellets in drei bis fünf Millilitern Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann PBS 2% FCS das Zweifache des Volumens der Lyse roter Blutkörperchen, Puffer und Zentrifuge nach der Zentrifugation hinzu.

Reanimation, suspendieren Sie das Pellet in P-B-S-F-C-S 2%Um Proben für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, fügen Sie dem Pellet ein bis zwei Milliliter 0,25%Trypsin hinzu und mischen Sie es, indem Sie zwei Minuten lang sehr vorsichtig mit einer 1000-Mikroliter-Pipette auf und ab pipettieren, um die Zellen nach Hemmung der Trypsinaktivität durch Zugabe von neun Millilitern PBS 2%FCS-Zentrifuge bei 450 g für fünf Minuten zu dissoziieren. Reanimation: Suspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern PBS 2%FCS und übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 40-Mikron-Zellsieb, das auf einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist, um einzelne Zellen vorzubereiten. Nach der Zentrifugation trennen Sie die Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen mit einem Cocktail aus Antikörpern von den Mikrostrukturen, bevor Sie sie mit Fakten sortieren, um die Zellen für die Histologie vorzubereiten. Waschen und verdauen Sie die Proben wie zuvor und fixieren Sie das Pellet dann 30 Minuten lang in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1.250 GS und waschen Sie sie zweimal mit ein bis zwei Millilitern PBS, nachdem Sie die Zentrifuge 10 Minuten lang bei 16.000 GS gewaschen haben. Bereiten Sie während dieser Zeit 1% Mehrzweck-Aros in Trisacetat-EDTA-Puffer vor und erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle, bis die Lösung zum Kochen kommt. Nehmen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Lösung zu mischen und alle verbleibenden Arous-Partikel zu entfernen.

Kühlen Sie die aro-Lösung auf 50 Grad Celsius ab, bevor Sie einen Milliliter in eine Paraffinform gießen. Entsorgen Sie dann den Überstand und legen Sie die Pellets mit einem flachen Löffelende des Spatels auf die erstarrte Aros-Schicht. Bedecken Sie sie alle zusammen mit den aro-Proben mit einer zusätzlichen Schicht Agros.

Legen Sie ein Blatt weißes Büropapier in die Kassette mit Angaben über die Reduktionszahl, den Versuchszustand und das Datum, das mit Bleistift geschrieben ist, um allen nachfolgenden Behandlungsschritten standzuhalten. Nachdem sich der Agarro verfestigt hat, legen Sie die Aros-Blöcke in die Histologiekassetten für die Paraffineinbettung. Legen Sie die Kassetten über Nacht in PBS oder in 70%iges Ethanol für die Lagerung über das Wochenende bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Histologiekassetten zur Paraffineinbettung in Histologieeinrichtungen zur Vorbereitung der Proben für die Gefrierresanimation überführen, suspendieren Sie Mikrostrukturen in Gefriermedium bestehend aus FCS mit 10% Dimethylsulfoxid und frieren Sie ein Milliliter Aliquote ein.

Bei Kryo-Fläschchen hängt die Anzahl der Kryo-Fläschchen von der Menge des durch Reduktion gewonnenen Primärmaterials ab. Mammoplastik-Gewebe aus frischer Reduktion. Die Mammoplastik ist mechanisch und enzymatisch dissoziiert.

Die resultierenden Gewebemikrostrukturen weisen Gänge und Läppchen auf, die für das Ursprungsgewebe der Brust charakteristisch sind. Die immunhistochemische Analyse von in Aros und Paraffin eingebetteten Gewebemikrostrukturen, die für den myoepithelialen Marker delta NP 63 gefärbt wurden, zeigt, dass Mikrostrukturen nicht nur die morphologischen Eigenschaften des normalen Brustgewebes, sondern auch das molekulare Profil der Zellpopulationen beibehalten, um die Hormonantwort auf das Gewebe zu beurteilen. Mikrostrukturen wurden entweder mit einem synthetischen Progesteronrezeptor-Agonisten, Promega-Stein oder Ethanol-Kontrolle behandelt, um für den Hormonrezeptor positive luminale Zellen anzureichern.

Die Durchflusszytometrie wurde auf der Grundlage von epithelialen und myoepithelialen Markern nach Depletion für endotheliale Fibroblasten und Immunzellen mit einem Cocktail aus anti CD 31 anti FAP und anti CD 45 Antikörpern durchgeführt. Die Q-R-T-P-C-R-Analyse von EPAM-positiven CD 10-negativen Zellen zeigte eine Hochregulation des Progesteron-Zielgens Wind vier in der mit Luminalzellen angereicherten Population aus den Mikrostrukturen des Promega-Stein-exponierten Gewebes. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wichtig ist, dass die Kollagenkonzentration, der Verdau, die Temperatur, die Dauer und die Rotationsgeschwindigkeit während der Gewebeverdauung wichtige Details sind, die im Protokoll angegeben sind.

Diese Methode kann auf pharmakologische Studien ausgeweitet werden, insbesondere auf eine bessere Charakterisierung von selektiven Östrogenrezeptormodulatoren oder Gestagenen. Tatsächlich werden Gestagene häufig im Zusammenhang mit hormonellen Verhütungsmitteln verwendet. Über seine Wirkung auf die menschliche Brust nach seiner Entwicklung ist jedoch wenig bekannt.

Dieses x-vivo-Gewebemikrostrukturmodell ebnete dem Forscher auf dem Gebiet der Brustentwicklung und Karzinogenese den Weg, um den hormonellen Beitrag und die Wirkung in der menschlichen Brust zu erforschen.