Name: Ein Ex-vivo- Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Erfahren Sie ein ex vivo-Modell zur Untersuchung der Hormonwirkung in der menschlichen Brust. Diese Methode erhält Gewebearchitektur und interzelluläre Interaktionen für endokrinologische Forschung.

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Die Autoren danken M. Fiche von Universitätsspital Lausanne für die Bereitstellung der mammoplasty Foto, M. Wirth und A. Ayyanan der Schweizerischen Institut für Experimentelle Krebsforschung, National Center of Competence in Research Molekulare Onkologie, School of Life Sciences, Eidgenössischen Technischen Hochschule Lausanne für die technische Unterstützung und R. Clarke der Universität Manchester für Kritik. Die Forschung, die diese Ergebnisse Unterstützung SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, und die Initiative Innovative Arzneimittel gemeinsames Unternehmen gemäß Finanzhilfevereinbarung erhalten hat, nicht. 115.188, Ressourcen, von denen der Finanzbeitrag aus dem Siebten Rahmenprogramm der EU (FP7 / 2007-2013) und European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations Unternehmen in Sachleistungen bestehen. Die Web-Adresse der Initiative Innovative Arzneimittel ist <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Allgemeine Überlegungen: Der Zeit voraus, bis eine Ethik-Protokoll eingestellt, bereiten Fragebögen für Patienten, und sehen auf die Ausbildung der Klinikpersonal. Bevor Sie Material aus Brustverkleinerung Chirurgie, beschaffen Genehmigungen und sorgen Zustimmung des Patienten. Gewebe können infektiös sein und muss entsprechend behandelt werden. Schweizerisches Institut für experimentelle Krebsforschung - Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der ISREC zugelassen. 1. Die Gewebewiederherstellung, Herstellung und Bio-Banking Um eine optimale Probenqualität für bio-Banking zu gewährleisten, sind eine Reihe von Schritten, die im Krankenhaus vor dem Labor transportiert geführt. Im Krankenhaus: <ol><li> Erhalten menschlichen Brustgewebe unter sterilen Bedingungen aus Brustverkleinerung Chirurgie und Blutproben, falls erforderlich. Tissue muss von Pathologen, probieren wird, um die Anwesenheit von malignen Läsionen auszuschließen untersucht werden. </li><li> Setzen Sie den Brust tAusgabe unter der Haube auf einem sterilen Bord und bereiten Schere, chirurgische Skalpell und Pinzette, die bereits mit Dampf sterilisiert werden. Stellen tiefen Schnitt an verschiedenen Standorten des Brustgewebe mit einem Skalpell zu öffnen. In menschlichem Brustgewebe Ihre weißen Litzen aus Leitungen und Läppchen, die in gelben Fettgewebe eingebettet sind. ANMERKUNG: Das Verhältnis der weißen parenchymalen zum gelben Fettgewebe unterscheidet bei Frauen; Regel jüngere Frauen haben mehr Epithelgewebe. </li><li> Wählen Stücke aus weißem Material und halten Sie sie mit einer Pinzette, dann trennen Sie diese vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Schere. Vermeiden Sie, die Blutgefäße. </li><li> Rinse Gewebestücke in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,2, um Blut zu entfernen. Übertragen des Gewebes zu 250 ml Kunststoffflaschen mit F12-Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium F12) ohne Phenolrot mit 2% Penicillin / Streptomycin (einschließlich 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 g / ml Streptomycin) und 1% eintibiotic / Amphotericin B (einschließlich 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin und 25 ug / ml Amphotericin B). Speicher Gewebe in dem Medium für den Transport zum Labor. </li><li> Bereiten Stücke 3-5 mm Durchmesser für RNA- und Protein-Extraktion und Flash frieren sie in Kryoröhrchen mit kaltem (Trockeneis) Isopentan. Übertragen Sie sie auf Trockeneis-Box für den Transport zum Labor. </li><li> Setzen Stücke 3-5 mm in die Form und decken Sie es mit einer Schicht von optimalen Schnitttemperatur (OAT) und dann die Form auf dem flachen Boden der Box mit kaltem Isopentan gefüllt. Nach vollständigem Einfrieren übertragen Sie die Form auf die Trockeneis-Box. </li><li> Fix 5 Stück 3 - 5 mm Durchmesser in Paraformaldehyd (PFA) 4% und noch 5 Stück in Formaldehyd (FA) 4% in PBS bei RT histologische Analyse später. Zwei verschiedene Fixiermittel werden empfohlen, da einige Antikörper besser mit dem einen oder anderen der beiden. </li></ol> Im Labor: <ol start="8"><li> Tuncument alle Informationen über die Brustverkleinerung, werden Operationsdatum und ob die Proben aus linken und rechten Brust abgeleitet. </li><li> Legen Sie die gefrorenen Proben bei -80 ° C und übertragen Sie die fixierten Gewebe in der Histologie Kassetten nach 2 h der Fixierung. Dann setzen sie entweder in PBS oder 70% Ethanol, zum O / N Lagerung bei 4 ° C. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 2. Die Gewebeaufschluss und Hormonstimulation <ol><li> Übertragen Sie die Flaschen mit den Gewebeproben auf eine Sterilbank in einer P2 Zellkulturraum. Zeigen Gewebestücke auf sterilen Schneidebrett (29 x 19 cm). Halten Sie das Material mit einer Pinzette und kratzen die restlichen Fett und Behälter weg von der Drüsenkörper (weißer Teil) mit Skalpell. Legen Sie das weiße Material in PBS in einer 10 cm Kulturschale. </li><li> Nach dem Entfernen des Fettmaterials aus allen Stücken und Entsorgen sie nach der Sicherheitsregels des Labors, legen Sie die weißen Teile mit den epithelialen Geweben zurück auf dem Schneidebrett. Mit entgegen Skalpelle schneiden das Gewebe und hacken sie in Stücke von bis zu 2 mm Durchmesser. </li><li> Legen Sie die gehackte Material in Röhren von ausreichender Größe: bis zu 1, 2.5 und 10 ml in einen 5, 15 oder 50-ml-Röhrchen auf. Regel ergibt sich eine 5-ml-Tube Erträge genug Material für Paraffineinbettung und Hormonstimulationen, und ein 15-ml-Tube Erträge genug Material für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Größere Rohre zum Einfrieren Aliquote verwendet. </li><li> Bereiten Verdauung Master-Mix, bestehend aus Medium (DMEM / F12 ohne Phenolrot) mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin B und Kollagenase A (Clostridiopeptidase A aus Clostridium histolyticum). Dosis Kollagenase nach Aufschlusszeiten. <ol><li> 12, 24 und 36 h Inkubation verwenden Endkonzentration von Kollagenase von 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml und 0,5 mg / ml. Fügen Verdauung Mastermix bis zu 4 mal derVolumen des aufgeschlossenen Material eine ausreichende Bewegung und Belüftung zu gewährleisten. HINWEIS: In Abhängigkeit von der Versuchsanordnung und der Dauer der Hormonstimulation, fügen Hormone entweder während oder nach der enzymatischen Aufschlußschritt und Mikro Erholung. </li></ol></li><li> Hinzufügen Hormon (e) bei gewünschten Konzentration Proben und das Fahrzeug zu der Kontroll testen. Für die Stimulation mit 17-β-Östradiol und Promegeston (R5020) verwenden eine Endkonzentration von 20 nM. HINWEIS: R5020 ist ein synthetisches Progesteron-Rezeptor-Agonist, der stabiler ist als natürliches Progesteron im Medium ist. <ol><li> Die Röhrchen auf dem Rollenmischer innerhalb einem Brutschrank bei 37 ° C und 40 rpm O / N. Vor dem Einsetzen der Proben auf dem Mischer resuspendieren sie sehr gut, um zu gewährleisten, dass alle wesentlichen verteilt entlang der Zentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Wie die Verdauung dauert mindestens 12 Stunden (O / N), für die Hormonstimulation Zeiten von weniger als 12 Stunden, fügen Sie die Hormone nach der Wiederherstellung der Mikrostrukturen (deunter Schritt 3 tailed). Fügen Sie die Hormone, wie Sie die Mikrostrukturen zu resuspendieren und legen Sie die Suspension auf ultra-niedrige Befestigungsplatten. Gewebemikrostrukturen auf ultra-niedrige Befestigungsplatten für bis zu 7 Tage in Wachstumsfaktor-freiem Medium zu bewahren etwa 70% Lebensfähigkeit gehalten werden. </li><li> Für RNA- und Protein-Analyse, sammeln Gewebemikrostrukturen durch Zentrifugation bei 400 xg für 5 min und Flash-Freeze in Zentrifugenröhrchen. </li></ol> 3. Wiederherstellung von Gewebe-Mikrostrukturen <ol><li> Zentrifugieren (n) bei 400 xg für 5 min. Absaugen Fett von der Spitze des Zentrifugenröhrchens und den Überstand des verbleibenden wäßrigen Flüssigkeitsüberstand, die in Fibroblasten angereichert ist, um ein neues Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 1250 × g für 5 min. HINWEIS: Da die Brustgewebe Mikrostrukturen sind sehr klebrig, für alle folgenden Schritte das Pellet durch vorsichtiges Schütteln der Röhre. Pipettieren wird wegen der Gefahr, die Materialien empfohlen. </li&gt; <li> Resuspendieren des Pellets in Mikrostrukturen und in Fibroblasten von wäßrigen Flüssigkeitsüberstand in PBS, 2% fötales Kälberserum (FCS) angereichert ist, abgeleitet. Beide Schläuche Anschließend drehen sich mit 1250 xg für 5 min und dann verwerfen Sie die Überstände. </li><li> Resuspendieren der Pellets in 3-5 ml Erythrozytenblut Lysepuffer und sie auf Rohre reinigen. Inkubieren für 5 min bei RT. </li><li> Hinzufügen 2x Volumen PBS, 2% FCS und zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Waschen der Pellets mit PBS, 2% FCS und Zentrifugieren bei 1.250 × g für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li></ol> 4. Proben für die Durchflusszytometrie <ol><li> Fügen Sie 1-2 ml Trypsin 0,25% zu dem Pellet und mischen Sie es durch Auf- und Abpipettieren sehr schonend für 2 min mit einem 1000 ul Pipetman, um Zellen zu trennen. </li><li> Hemmt Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 9 ml PBS, 2% FCS. Zentrifuge bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Pellets in 10 ml PBS, 2% FCS. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 40 um Zellsieb auf T platziertop einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf einzelne Zellen herzustellen. Wenn ein paar Mikroliter der Zellsuspension bleiben auf der Oberseite des Filters, damit sie durch den Filter durch Absaugen sie von der anderen Seite des Sieb mit einer Pipette und fügen Sie sie zu den gefilterten Mikrostrukturen. </li><li> Separate Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen von Mikrostrukturen mit einem Cocktail von Anti-CD45, anti-FAP und Anti-CD31-Antikörper und dann sortieren sie mit FACS, basierend auf pan-epithelialen Marker EpCAM und CD10 auf luminalen und basalen Zellen bzw. trennen 10 . </li></ol> 5. Die Proben für die Histologie <ol><li> Nach dem Waschen der mechanisch und enzymatisch abgebaute Material, wie oben beschrieben, zu fixieren Pellets von 1,5 ml Ausgangsmaterial in 1 ml 4% PFA in PBS bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge bei 1.250 xg für 5 Minuten und wäscht mit 1-2 ml PBS zweimal. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min. Während dieser Zeit vorzubereiten 1% Mehrzweck-Agarose in Tris-Acetat-EDTA (TAE-Puffer) und erhitzt die Lösung in der Mikrowelle, bis die Lösung zum Sieden kommt. <ol><li> Entfernen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und die Flasche vorsichtig schwenken, um die Lösung zu mischen und resuspendieren alle verbleibenden Agarosepartikel. Kühle Agaroselösung bis 50 ° C und gießen 1 ml in einem Paraffinbasisform Größe 31 × 23 × 13,5 mm. </li></ol></li><li> Überstand verwerfen und legen Sie die Pellets auf der verfestigten Schicht (1 - 3 mm) aus Agarose mit einem Spatel mit einem flachen Ende. Decken Sie sie alle mit einer zusätzlichen Schicht aus Agarose (40 ° C). </li><li> Nachdem die Agarose erstarrt, in der Regel innerhalb von 5 Minuten, legen Sie die Agarose-Blöcke in die Histologie Kassetten für Paraffineinbettung. Zusammen mit der Agarose-Proben stellen einen weißen Büro Papier in der Kassette mit allen Informationen über die Brustverkleinerung Zahl, Versuchsbedingungen, und das Datum in kleiner Schrift mit Bleistift geschrieben; dies schriftlich wider alle weiteren Behandlungsschritte. </li><li> Setzen Sie die Kassetten inPBS O / N, oder in 70% Ethanol für die Lagerung über das Wochenende bei 4 ° C. Wir haben keinen Unterschied zwischen den beiden Speicherlösungen bemerkt. Dann Transfer Histologie Kassetten Histologie Einrichtungen für Paraffineinbettung. </li></ol> 6. Gefriermikrostrukturen (Future Kultivierung) <ol><li> Resuspendieren Gewebemikrostrukturen in Einfriermedium bestehend aus FCS mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) und gefrier 1 ml Aliquots in Kryoröhrchen. Die Anzahl der erhaltenen Kryoröhrchen hängt von der Menge von Brustverkleinerung erhalten Vormaterial. </li><li> Einfrieren der Kryoröhrchen enthaltenden Gewebemikrostrukturen mit einer kontrollierten Geschwindigkeit Gefrierschrank mit dem folgenden Programm: 5 min Verweilen bei 4 ° C, Absenken der Temperatur auf -7 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, die Verringerung der Temperatur auf -12 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, 10 min Behausung, Absenken der Temperatur auf -40 ° C mit Geschwindigkeit von 6 ° C / min, Abnahme der Temperatur auf -80 ° C mitGeschwindigkeit von 6 ° C / min. Dann übertragen Sie die Kryoröhrchen bis -80 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Am nächsten Tag, übertragen die Kryoröhrchen von -80 ° C bis Flüssigstickstofftank für lange Lagerung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das beschriebene ex vivo Kultur vorsieht Brustgewebe Mikro enthaltende intakte Kanäle und Läppchen, zusammen mit anderen Zelltypen, die normalerweise im menschlichen weiblichen Brust gefunden. Bei der Verarbeitung des menschlichen Brustgewebe gewöhnlich durch Reduktion mammoplasties erhalten, Entfernung von Fettgewebe, mechanische und enzymatische Verdauung des Stromamatrix und Lyse roter Blutkörperchen reichert Milchkanal Fragmente und Klemmen duktalen lobulären Einheiten. Gentle enzymatische Verdauung an der ...

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Marie Shamsheddin

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Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informationen über die Mutations Landschaft in Brustkrebs ist in hohem Tempo zu. Weniger Aufmerksamkeit wurde auf systemische Faktoren, die die Entstehung von Brustkrebs beeinflussen bezahlt worden. Die Exposition gegenüber Fortpflanzungshormone hat einen großen Einfluss auf den Krankheitsverlauf 1-3. Dennoch sind die Mechanismen, durch die Fortpflanzungshormone treffen auf die menschliche Brust kaum verstanden. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mausmodellen hat ergeben, dass sie Zell intrinsische und parakrine Signal durch mehrere Effektoren 4 einzubeziehen. Die begrenzte Wissen über die Hormonwirkung in der menschlichen Brust ist vor allem auf das Fehlen angemessener Modelle. Die meisten arbeiten auf die Mechanismen der Östrogenrezeptor (ER) und Progesteron-Rezeptor (PR) Signalisierung Hormonrezeptor-positiven Brustkrebszelllinien, wie zum Beispiel MCF-7 und T47D geführt. Diese wurden aus Pleuraergüsse von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs, die alrea hatte abgeleitetdy erhielt mehrere Behandlungen 5. Die biologische Relevanz der Ergebnisse in einer solchen einfachen in vitro-Modellen der menschlichen Brust ist fragwürdig und Zielgene in diesen in vitro-Modellen identifiziert sind unterscheiden sich von Zielgenen, die in Tiermodellen 6 identifiziert. Beim primären menschlichen Brust Epithelzellen in vitro kultiviert werden sie neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression und damit Hormonantwort 7,8 verlieren. Dieses Problem kann durch anspruchsvolle 3D-Ansätze mit Matrigel circumventd werden. Auf diese Weise, C. Clarke und Mitarbeitern gelang Festlegung Brustepithelzellen die Hormon-Rezeptor-Expression erhalten und zeigte eine proliferative Reaktion auf Progesteron Stimulation 9. Noch zwei in vivo Progesteronrezeptorzielgene wichtig, Wnt-4 und RANKL, wurden nicht von Progesteron Stimulation in diesem System 9 induziert. Dieser Ansatz wurde kürzlich weiter mit in vitro genommen </em&gt; Hormonvorbehandlung und RANKL Induktion 10 erreicht. Ein Vorbehalt bleibt, dass Matrigel hat Aktivitäten, die chargenabhängig sind, ist teuer und erfordert eine Versuchsanordnung, die geeignet sind für kleine Zahlen nur Zelle ist. Basierend auf der Erkenntnis, dass in vivo ER und PR-Signalisierung werden weitgehend durch parakrine Interaktion 11 vermittelten wir argumentiert, daß die intrazellulären Wechselwirkungen beibehalten werden müssen. Ein weiterer wichtiger Faktor, der als Gewebe verloren werden, um einzelne Zellen zur in vitro Kultur dissoziiert sind die Wechselwirkungen der Epithelzellen mit der extrazellulären Matrix; doch diese sind entscheidend für die epitheliale Differenzierung und ihre Störung ist in der Tumorgenese 12 wichtig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, um Brustgewebe Mikrostrukturen aus frischen chirurgischen Ablagematerial 13 zu isolieren. Das Brustdrüsengewebe, bestehend aus einem zweischichtigen Epithel mit inneren und äußeren Lumen myoepithelial Zellen wird von Fettgewebe präpariert und in mechanische und enzymatische Dissoziation unterworfen. Nach dem Waschen und Zentrifugation werden Fragmente der Milchgänge erhalten, die auf enger Interaktion mit vielen Stromazellen behalten. Diese Gewebemikrostrukturen bleiben Hormon reagieren. Das Modell wurde in klinischen Proben 13 validiert. Als solches kann das vorliegende Verfahren dazu beitragen, die Hormonwirkung in der Brust in einem biologisch und klinisch relevanten Kontext zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Mikroliter-Zentrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Kryobox</td><td>Nalgene&nbsp; &nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank mit kontrollierter Rate EF600 Grant</td><td>Asymptote&nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Rollenmischer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histologie-Kassetten</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Strile Chirurgische Klinge&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin-Basisform</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur (OCT) Kryomatrix</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotika</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Vorwärmen (37 &Grad; C)</td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Vorwärmer (37 &deg; C)</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Kann durch fötales Kälberserum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>ersetzt werden Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen (5,0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale mit ultraniedrigem Aufsatz</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; ex-vivo-</em&gt; modell um die hormonwirkung in der menschlichen brust studieren

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Das Studium der Hormonwirkung in der menschlichen Brust durch Mangel an geeigneten Modellsystemen behindert. Bei der In-vitro-Kultur, Grund Brustepithelzellen neigen dazu, Hormon-Rezeptor-Expression zu verlieren. Weit verbreitete Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs-Zelllinien sind von begrenzter Relevanz für die in vivo-Situation. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren. Frische menschlichem Brustgewebe Proben aus chirurgischen Ablagematerial wie Reduktion mammoplasties oder mammectomies mechanisch und enzymatisch verdaut, um Gewebefragmente, die Kanäle und Läppchen und mehrere Stroma-Zelltypen zu erhalten. Diese Gewebemikrostrukturen in Basismedium ohne Wachstumsfaktoren gehalten bewahren ihre interzellulären Kontakte, die Gewebearchitektur und bleiben Hormon für einige Tage reagiert. Sie sind ohne weiteres für RNA- und Proteinextraktion, histologische Analyse bearbeitet oder in Gefriermedium gespeichert. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet, um spezifische Zellpopulationen anzureichern. Dieses Protokoll bietet eine einfache, Standardansatz für die translationale Studien mit sehr komplexen, vielfältigen menschlichen Proben.

Um die Rolle von Östrogen und Progesteron zu studieren und ihre molekularen Funktionen in der menschlichen Brust, besser zu verstehen, erfassen wir frischen menschlichen Brustgewebeproben von Patienten, die eine Reduzierung mammoplasties (Abbildung 1) nach Erlangung ihrer Einwilligung nach Aufklärung. Wir erhalten auch medizinische und Fortpflanzungsgeschichte der Patienten sowie eine Blutprobe an Serumprogesteronspiegel zum Zeitpunkt der Operation zu bestimmen. Gewebe aus frischen Reduzierung mammoplas...

Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein ex vivo-Modell der menschlichen Brust bereitzustellen, das die Geweearchitektur, zellulären Wechselwirkungen und hormonelle Ansprechbarkeit erhält, um die Wirkung von Hormonen zu untersuchen. Das Modell basiert auf menschlichen Gewebemikrostrukturen, die hergestellt werden, indem zunächst das Brustparenchym, bestehend aus Gangsystemen und Läppchen, aus dem fettigen Bruststroma isoliert wird. Neben Adipozyten enthält das Stroma Fibroblasten, Immunzellen und endotheliale Zellen.Nachdem das Parenchymgewebe vom Fett befreit wurde, wird es mechanisch mit sich gegenüberliegenden Skalpellen in erbsengroße Stücke zerlegt. Anschließend wird die Gewebemasse einer enzymatischen Verdauung mit Kollagenase unterzogen; gegebenenfalls kann in diesem Schritt eine Hormonstimulation erfolgen. Die Gewebemikrostrukturen werden danach durch Zentrifugation gewonnen, gefolgt von der Entfernung des fibroblastenangereicherten Anteils des verbleibenden Fettgewebes sowie der roten Blutkörperchen.Nach einem Regenerationsverfahren wird die Suspension des verbleibenden verdauten Brustgewebes angereichert um Gewebemikrostrukturen, die luminalen und myoepithelialen Zellen samt umgebender Basallamina, Fibroblasten, endothelialen Zellen und Immunzellen enthalten. Abschließend dient die ex vivo-Kultivierung der Beurteilung der Mikrostrukturmorphologie. Die Fluoreszenz-Aktivierte Zellsortierung dient der Trennung der Brustzellsubpopulationen, und die Protein- sowie transkriptomische Analyse wird für Untersuchungen zur Hormonempfindlichkeit verwendet.Hormone steuern die Brustentwicklung und sind wichtig für die Tumorentstehung in der Brust. Hormonsignalwege wurden bisher hauptsächlich bei Brustkrebs, Zelllinien in Gewebekultur und plastischen Erkrankungen untersucht. Wenn primäre Brustepithelzellen jedoch in vitro kultiviert werden, verlieren sie die Expression von Hormonrezeptoren.Die Gewebemikrostrukturen, die wir nun aus operativem Verwerfungsmaterial erhalten, bleiben hormonempfindlich, und die Patientenproben spiegeln die individuelle Vielfalt wider. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist wichtig, da die Schritte zur Gewebeverdauung und die Gewinnung von Mikrostrukturen aus heterogenem humanem Brustdrüsengewebe komplex sind.Die kollagengehalt und die Verdauungsdauer sind entscheidend, um eine teilweise Verdauung oder Überverdauung zu vermeiden. Dieses ex vivo-Modell kann uns helfen zu verstehen, wie die Fortpflanzungshormone auf der menschlichen Brust wirken und durch welche Mechanismen sie die Krebsentstehung und -progression beeinflussen. Überführen Sie zunächst die Flaschen mit den Gewebeproben in einen laminar flow-Schrank in einem P zwei-Zell-Genannten Raum und arbeiten Sie auf einem sterilen Schneidebrett.Halten Sie das Material mit einer Pinzette fest und entfernen Sie mit einem Skalpell das restliche Fett und die Gefäße vom Brustparenchym. Legen Sie das weiße Material in phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS in eine 10 cm große Zellkulturschale. Nachdem das Fettgewebe von allen Stücken entfernt und gemäß den Sicherheitsvorschriften des Labors entsorgt wurde, legen Sie die weißen Anteile, die das epitheliale Gewebe enthalten, mit zwei gegenüberliegenden Skalpellen zurück auf das Schneidebrett, schneiden Sie das Gewebe und zerkleinern Sie es in Stücke mit einem Durchmesser von weniger als zwei Millimetern.Geben Sie das zerkleinerte Material in Röhrchen passender Größe für Paraffineinbettung und Hormonstimulationen. Verwenden Sie ein Milliliter Material in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen. Bei der Durchführung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung oder FACS verwenden Sie 2,5 Milliliter Material in einem 15-Milliliter-Röhrchen.Wenn Aliquots eingefroren werden, verwenden Sie 10 Milliliter zerkleinertes Material in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann die Verdauungslösung hinzu. Die Master-Mix-Lösung enthält Kollagenase A in einem Volumen, das bis zu viermal die Menge des zu verdauenden Materials beträgt, um eine ausreichende Durchmischung und Belüftung sicherzustellen.Fügen Sie anschließend Hormone in der gewünschten Konzentration zur Stimulation mit 17-Beta-Estradiol und Progeston zu. Verwenden Sie eine Endkonzentration von 20 Nanomolar. Geben Sie lediglich das Lösungsmittel zur Kontrolle hinzu und schütteln oder mischen Sie die Proben gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung des Materials in den Zentrifugenröhrchen sicherzustellen.Danach die Röhrchen in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 40 U/min über Nacht auf den Rollmischer stellen. Die Verdauung mindestens 12 Stunden lang andauern lassen, um das Gewebe zu gewinnen. Mikrostrukturen: Zentrifugieren der Röhrchen zunächst fünf Minuten bei 400 × g.Nachdem das Fett von der Oberseite des Zentrifugenröhrchens abgesaugt wurde, überführen Sie das verbleibende wässrige Überstand, das angereichert an Fibroblasten ist, in ein neues Zentrifugenröhrchen. Anschließend zentrifugieren Sie den wässrigen Überstand bei 1.250 Gs für fünf Minuten. Da die Mikrostrukturen des Brustgewebes für alle nachfolgenden Schritte außer Reus sehr klebrig sind, wird das Auftrüben des Pellets durch vorsichtiges Pipettieren nicht empfohlen, da sonst Material verloren gehen könnte.Als Nächstes resuspendieren Sie die in Mikrostrukturen angereicherten Pellets in PBS mit 2 % FCS und resuspendieren auch die aus dem wässrigen Überstand stammenden, in Fibroblasten angereicherten Pellets in PBS mit 2 % FCS, nachdem beide Röhrchen zentrifugiert wurden. Wie zuvor verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren die Pellets in drei bis fünf Milliliter Erythrozyten-Lysepuffer und inkubieren sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Danach geben Sie PBS mit 2 % FCS in doppeltem Volumen im Vergleich zum Erythrozyten-Lysepuffer hinzu und zentrifugieren nach der Zugabe.Resuspendieren Sie das Pellet in PBS-FCS 2 %. Um Proben für die Durchflusszytometrie vorzubereiten, geben Sie ein bis zwei Milliliter 0,25 %iger Trypsinlösung zum Pellet und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 1000-Mikroliter-Pipette für zwei Minuten, um die Zellen zu dissoziieren. Hemmen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von neun Millilitern PBS mit 2 % FCS, und zentrifugieren Sie bei 450 ×g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS mit 2 % FCS, und überführen Sie die Zellsuspension in einen 40-Mikrometer-Zellsieb, der auf einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist, um Einzelzellen zu erhalten. Nach der Zentrifugation trennen Sie Immunzellen, Fibroblasten und endotheliale Zellen mithilfe eines Antikörpercocktails von den Mikrostrukturen, bevor Sie sie mittels FACS sortieren, um Zellen für die Histologie vorzubereiten. Waschen und verdauen Sie die Proben wie zuvor beschrieben, und fixieren Sie anschließend das Pellet in einem Milliliter 4 %iger Paraformaldehydlösung in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Zentrifugieren bei 1.250 ×g für fünf Minuten und waschen Sie zwei Mal mit ein bis zwei Milliliter PBS. Nach dem Waschen zentrifugieren Sie bei 16.000 ×g für 10 Minuten. Bereiten Sie in der Zwischenzeit 1 % Multipurpose-Aros in Tris-Acetat-EDTA-Puffer vor und erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle, bis sie kocht. Nehmen Sie die Lösung aus der Mikrowelle und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Lösung zu mischen und verbleibende Aros-Partikel erneut in Suspension zu bringen.Kühlen Sie die Aro-Lösung auf 50 Grad Celsius ab, bevor Sie ein Milliliter in eine Paraffin-Grundform gießen. Danach entsorgen Sie den Überstand und platzieren die Pellets mit dem flachen Löffelende des Spatels auf der Oberseite der erstarrten Aros-Schicht. Bedecken Sie sie samtlich mit einer zusätzlichen Agros-Schicht zusammen mit den Aro-Proben. Legen Sie ein Stück weißes Kopierpapier in die Kassette, auf das mit Bleistift die Informationen über die Reduktionsnummer, die experimentelle Bedingung und das Datum geschrieben wurden, um allen nachfolgenden Behandlungsschritten standzuhalten. Nachdem sich das Agarose verfestigt hat, geben Sie die Gewebeproben in die Histologie-Kassetten zur Einbettung in Paraffin. Stellen Sie die Kassetten über Nacht in PBS oder für die Aufbewahrung am Wochenende bei vier Grad Celsius in 70 % Ethanol, bevor Sie die Histologie-Kassetten zur Paraffineinbettung in die Histologieabteilung überführen, um die Proben für das Einfrieren vorzubereiten. Suspendieren Sie die Mikrostrukturen in einem Gefriermittel, das aus FCS mit 10 % Dimethylsulfoxid besteht, und frieren Sie Aliquots von je einem Milliliter ein.In Kryoröhrchen variiert die Anzahl der Kryoröhrchen je nach der Menge an Primärmaterial, das aus der Reduktion gewonnen wurde. Mammoplastiegewebe aus frischer Reduktion. Das Mammoplastiegewebe wird mechanisch und enzymatisch dissoziiert.Die resultierenden Gewebemikrostrukturen weisen Kanäle und Läppchen auf, die charakteristisch für das ursprüngliche Brustgewebe sind. Die immunhistochemische Analyse von Aros und in Paraffin eingebetteten Gewebemikrostrukturen, die für den myoepithelialen Marker Delta NP 63 gefärbt wurden, zeigt, dass die Mikrostrukturen nicht nur die morphologischen Merkmale des normalen Brustgewebes beibehalten, sondern auch das molekulare Profil der Zellpopulationen zur Beurteilung der Hormonantwort des Gewebes. Die Mikrostrukturen wurden entweder mit einem synthetischen Progesteronrezeptor-Agonisten, Promega Stone, oder einer Ethanol-Kontrolle behandelt, um die hormonrezeptorpositiven luminale Zellen anzureichern.Die Durchflusszytometrie wurde basierend auf epithelialen und myoepithelialen Markern nach Ausschaltung von endothelialen Fibroblasten und Immunzellen mit einem Cocktail aus Anti-CD-31-, Anti-FAP- und Anti-CD-45-Antikörpern durchgeführt. Die Q-R-T-P-C-R-Analyse von EPAM-positiven, CD-10-negativen Zellen zeigte eine Hochregulation des Progesteron-Zielgens Wind-Vier in der luminalen Zell-angereicherten Population aus den Mikrostrukturen von Gewebe, die Promega-Stein ausgesetzt waren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Wichtig ist, dass die kollagene Konzentration, Verdauung, Temperatur, Dauer und Rotationsgeschwindigkeit während der Gewebeverdauung alle wesentlichen Details sind, die im Protokoll genau festgelegt werden.Diese Methode kann auf pharmakologische Studien ausgedehnt werden, insbesondere auf eine genauere Charakterisierung selektiver Östrogenrezeptormodulatoren oder Gestagene. Tatsächlich werden Gestagene im Bereich der hormonellen Empfängnisverhütung weit verbreitet eingesetzt. Allerdings ist wenig über ihre Wirkung auf die menschliche Brust nach ihrer Entwicklung bekannt.Dieses x vivo-Gewebe-Mikrostrukturmodell ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Brustentwicklung und Karzinogenese, um den hormonellen Beitrag und die Wirkung in der menschlichen Brust zu untersuchen.

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