Name: Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie AAV-Partikel zur Untersuchung der Blut-Retina-Schranke und der inneren Grenzmembran in Netzhautkrankheiten eingesetzt werden. Diese Methode nutzt GFP-Transgene und Konfokalmikroskopie für präzise Analysen.

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Wir danken der Bildgebungsplattform des Institut de la Vision. Wir danken der French Muscular Dystrophy Association (AFM) für ein PhD-Stipendium für O.V. und Allergan INC. Diese Arbeit, die im Rahmen des LABEX LIFESENSES [Referenz ANR-10-LABX-65] durchgeführt wurde, wurde von französischen Staatsfonds unterstützt, die von der ANR verwaltet werden. Wir danken Peggy Barbe und Mélissa Desrosiers für die technische Unterstützung bei den AAV-Vorbereitungen. Wir danken Stéphane Fouquet für die hervorragende technische Unterstützung in der konfokalen Mikroskopie und seinen fachkundigen Input bei der Interpretation der Ergebnisse.

Alle Tiere in dieser Studie verwendet wurden entsprechend der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research betreut und behandelt. 1. Herstellung der rekombinanten AAV (rAAV) durch transiente Transfektion von HEK-293-Zellen 17,18 HINWEIS: Siehe McClure C, JoVE (2011) 19. <ol><li> Reinigung einer großen Plasmidpräparation (mindestens 1 mg / ml) der AAV-Vektor-Plasmide. Verwenden Sie 3-Plasmiden. Die AAV-Helferplasmid trägt, die Replikation und Capsidgene ohne AAV invertierte terminale Wiederholungen ITRs, die Transgen-Expressionskassette trägt die AAV ITR bezeichnet als die Transfer-Plasmid, und das Plasmid Zuführen der Adenovirus-Helfergene E2, E4 und VA RNA-Gene genannten als pHELPER. </li><li> Transfektion von 293-Zellen mit diesen Plasmiden 3 mit Polyethylenimin (oder andere Transfektionsreagenz). Über 80% der Transfektionseffizienz für gute vi erforderlichral Erträge. </li><li> Reinige rekombinanten AAV von 293 Zelllysate auf eine Iodixanol Gradienten. 15%, 25%, 40% und 60% Iodixanol wird verwendet, um den Gradienten zu erhalten. Sammle 40% Iodixanol Fraktion AAV-Partikel enthält, konzentrieren die Fraktion nach Ultrazentrifugation bei 500.000 · g für 1 Stunde und Pufferwechsel gegen PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) mit 0,001% Pluronic. </li><li> Um festzustellen, virale genomische Titer 20, führen Sie eine DNAse ProteinaseK Digest gefolgt von QPCR. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer verstärken die 62 bp-Region im AAV2 ITR entfernt. Für die Plasmid-Standard wird die Sonde mit FAM bezeichnet und hat ein schwarzes Loch Löscher (BHQ). </li><li> Durchführung qPCR (quantitative Polymerase-Kettenreaktion) in einem Endvolumen von 25 ul mit 340 nM Rückwärtsprimer ITR, 100 nM Vorwärtsprimer ITR, 100 nM AAV2 ITR Sonde, 0,4 mM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq-Puffer, 1HE Platinum Taq und 5 ul Template (Standard, Probe und Leerwert-Kontrolle). </li><li> Fürder Standard, mit dem Plasmid für die Transfektion in 7 x 10-fachen seriellen Verdünnungen (5 &amp; mgr; l jeweils von 2 · 10 &amp; sup9 bis 2 × 10 3 Genome / ml, was zu einer Endkonzentration von Oktober 10.-Oktober 4. Genome / ml). </li><li> Beginnt das Programm mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 15 min, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 1 min und Annealing / Extension bei 60 ° C für 1 min. Lagerung bei 4 ° C für eine kurzzeitige Lagerung oder bei -20 ° C für lange Lagerzeiten. </li></ol> 2. Die intravitreale Injektion von AAV- <ol><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) und überprüfen Sie die Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung. Erweitern sich die Schüler von der Hornhaut Anwendung Neosynephrin 5% und mydriaticum 0,5% Augentropfen. Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Übergeben Sie eine ultrafeine 30 G disposable Nadel durch den Äquator und neben dem Limbus in die Glaskörperhöhle (siehe Chiu K, JoVE (2007) 21). Injizieren 1 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 vp ShH10-GFP oder AAV5-GFP mit der direkten Beobachtung der Nadel in der Mitte der Glaskörperhöhle (Abbildung 1). Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für ILM-Experimente. Spritzen Sie beide Augen für BRB Experimente. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle die topische Behandlung auf injizierten Augen. </li><li> Erweitern sich die Schüler mit Neosynephrin und mydriaticum Augentropfen für die Bildgebung. Führen Fundusuntersuchungen mit einer Augenhintergrundkamera mit GFP (Green Fluorescent Protein) Ausdruck 1 Woche, 2 Wochen, 1 Monat und 2 Monate nach der intravitrealen Injektion (Abbildung 1) zu folgen. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation 1 bis 2 Monate nach der Injektion. </li></ol> 3. Immunhistochemie <ol><li> Für Netzhautgefrierschnitten (Abbildung 1), sezieren entkernte Augen l entfernenens und der Hornhaut, und Tauch fix in 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde. <ol><li> Cryoprotect Die vorher fest Augen in 10% Sucrose für 1 h bei Raumtemperatur, 20% Saccharose für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Cryoprotect in 30% Saccharoselösung, über Nacht bei 4 ° C. Einzufrieren und in Einbettmittel wie Cryo-Matrix einbetten Augenmuscheln. Stellen Sie 10 um Gefrierschnitten und montieren Sie auf Folien speziell für Gefrierschnitte behandelt werden und dass Gewebehaftung zu verbessern während der Färbung. </li><li> Permeabilisieren Abschnitte mit 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 für 5 min. 2 x Waschen in PBS und Block für 1 h bei Raumtemperatur in PBS mit 1% BSA, 0,1% Tween 20. </li></ol></li><li> Für retinalen Flatmounts (Abbildung 1), fix entkernte Augen in 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten, um die Präparation zu erleichtern. <ol><li> In 15 bis 30 min, sezieren die Augen, um die Hornhaut und Linse zu entfernen. Trennen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel (RPE) und Lederhaut, indem auf der Ora serrata undder Sehnerv. Tauchen Sie ein in 4% Paraformaldehyd für weitere 30 Minuten, um die Netzhaut und das fluoreszierende Protein in transduzierten Zellen der Netzhaut (Fixierung muss 24 Stunden nicht überschreiten) zu beheben. Waschen 5 min in sterilem PBS, pH 7,4. </li><li> Ändere die PBS Blockierungspuffer (PBS mit 1% BSA, 2% normales Ziegenserum, Esel, 0,5% Triton X-100), und Inkubation in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder 4 ° C über Nacht. </li></ol></li><li> Gewebe mit primären Antikörpern inkubieren in Blockierungspuffer für entweder 4 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C über Nacht. Jeweils 3x mit PBS. HINWEIS: Die verwendeten Antikörper sind wie folgt: Anti-Laminin (1 / 1.000) Beschriftung der ILM, anti-Rhodopsin Klon 4D2 (1/500) Kennzeichnung Stangen, Anti-Glutamin-Synthetase-Klon GS-6 (1 / 1.500) Kennzeichnungsmüllerzellen , PNA-Lektin (1/40) Kennzeichnung Kegel. </li><li> Gewebe mit 1 inkubieren: 500 Verdünnung von Alexa Fluor konjugierte sekundäre Antikörper in Blocking-Puffer für 1 Stunde (Gefrierschnitte) bzw. 2 h (Flatmounts) bei Raumtempetur und vor Licht geschützt. Jeweils 3x mit PBS. </li><li> Machen die Linderung Schnitte an der Retina und Flatmount sie auf einen Objektträger entweder mit der Photorezeptor oder retinaler Ganglionzellen (RGCs) Seite nach oben. In wässrigen mountingmedium gelten Deckglas und bei 4 ° C. </li><li> Führen Sie die konfokale Mikroskopie auf Laserscanning konfokalen Mikroskop. Bilder nacheinander Zeile für Zeile zu erwerben, um Anregungs- und Emissionsübersprechen zu reduzieren. Definieren Schrittgröße nach dem Nyquist-Shannon-Abtasttheorem. Verwenden Sie die Belichtungseinstellungen, die übersättigt Pixel in den letzten Bildern zu minimieren. Prozess-12-Bit-Bilder mit FIJI, Projekt Z-Profile in einer Ebene mit maximaler Intensität unter Z-Projektfunktion und schließlich konvertieren 8-Bit-RGB-Farbmodus. </li></ol> 4. PCR-Analyse von Maus Blutproben <ol><li> Injizieren 100 ul Lager mit 1 bis 4 x 10 11 Partikel eines AAV-GFP in die Penisvenen betäubter C57BL6J Mäusen (5% IsofluranInduktion in einer engen Kammer und 2,5% Isofluran über einen Nasenkegel während der Operation) mit einer Insulinspritze mit einer ultrafeinen 6 mm Nadel. Das Tier wird als positive Kontrolle des zirkulierenden AAV-Partikel dienen. </li><li> Beispiel Blut von Maus Schwanz vor der Injektion und 3 Stunden, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage nachdem ShH10 intravitreale Injektion oder nach intrapeniler Injektion (Abbildung 1). Über 10 bis 20 &amp; mgr; wird in Heparin-Röhrchen gesammelt. Opfern Mäuse durch CO 2 Inhalation nach Abschluss des Verfahrens. </li><li> Extrahieren genomischer DNA aus Blutproben mit dem Extraktions-Kit Ihrer Wahl. </li><li> Führen der PCR-Amplifikation von genomischer DNA. Aus diesem Protokoll verwenden Sie die folgende Primerpaar: GFP, spüren 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, 5&#39;-Antisense-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;. Das folgende PCR-Programm wurde durchgeführt: 95 ° C 2 min (1 Zyklus); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 sec (30 Zyklen); 72 ° C 5 Minuten (1 Zyklus);4 ° C halten. </li></ol> 5. Optional Evans Blue-Methode HINWEIS: Quantifizieren vaskulären Permeabilität durch Messung Albuminverlust von Blutgefäßen in der Netzhaut mit dem Evans-Blau-Verfahren 10. <ol><li> Bereiten Evans Blue-Farbstoff durch Lösen in einer normalen Kochsalzlösung (6 mg / ml), Ultraschallbehandlung für 5 Minuten in einem Ultraschallreiniger und Filtration durch ein 5 um-Filter. </li><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1), überprüfen Sie den Verlust des Stellreflexes, Rückzugsreflex und Schwanz Pinch-Antwort, die eine angemessene Betäubung, und injizieren Evans Blau (45 mg / kg) durch den Penis Ader (Abbildung 1). Überprüfen Sie, ob die Pfoten, Schnauze und Ohren von Mäusen werden eindeutig blau nach Evans-Blau-Injektion, bestätigt die Aufnahme und Verteilung des Farbstoffs. </li><li> Anesthetize C57BL6J Mäusen 3 h nach der Injektion des Farbstoffes mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), und überprüfen den Verlust righting Reflex, der eine angemessene Betäubung. Proben intrakardial etwa 500 ul Blut in Heparinröhrchen und perfundieren Mäusen für 2 min über den linken Ventrikel mit einem Citratpuffer (0,05 M, pH 3,5; aufzulösen 7,8 g Zitronensäure und 3,8 g Natriumcitrat in 1 l destilliertem Wasser) auf 37 ° C vorgewärmt, um Vasokonstriktion zu verhindern. Die Mäuse werden über die Perfusion geopfert. </li><li> Nach Perfusion enucleate und sorgfältig sezieren beide Augen unter einem Operationsmikroskop, um die Netzhaut zu sammeln (siehe Abschnitt 3.2). Dry Netzhaut in einem Zentrifugalverdampfer über Nacht, zu wiegen, und extrahieren Sie die Evans blauen Farbstoff durch Inkubation Netzhaut mit 100 ul Formamid für 18 Stunden bei 65 ° C unter Schütteln (100 · g). Zentrifuge Retina Proben in 30K omega Filterrohre an 20,798.5 g für 2 Stunden bei 4 ° C zentrifugieren Blutproben 20,798.5 g 15 min bei 4 ° C. </li><li> Benutzen Sie beide Überstände, um die Absorption zu messen. Bestimmen Extinktion jeder Probe durch Subtrahieren des Extinktionsmaximum for Evans Blau bei 620 nm zur Extinktion Minimum bei 740 nm. Berechnen Evans Blau-Konzentration im Plasma und der Netzhaut von einer Standardkurve von Evans-Blau in Formamid. Express BRB Lässigkeit in Mikroliter Evans Blau pro Gramm Trocken Retina pro Stunde (ul Plasma / g Netzhauttrockengewicht / Stunde). </li></ol> 6. Optional Fluoreszein-Angiographie HINWEIS: Leakage von retinalen Blutgefäßen in Mäusen durch intraperitoneale Injektion von Natrium Fluorescein visualisiert werden. <ol><li> Anesthetize C57BL6J Mäuse (Isofluran Einatmen, siehe Schritt 4.1) und erweitern die Schüler mit Augentropfen (Neosynephrin und mydriaticum). Verwenden Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Intraperitoneal injizieren 0,01-0,02 ml 10% Natriumfluorescein in 0,1 ml steriler Kochsalzlösung zur Angiographie. </li><li> Sammeln Sie Bilder beider Augen nach der Injektion mit einem Augenhintergrundkamera. Sacrifice Mäuse durch CO 2 Inhalation nach dem Pro-verfahren. Hinweis: 20 Sekunden sind nötig, dass die Netzhautgefäße auf Angiographie sichtbar werden. Bilder müssen zwischen 3-10 min Maximum nach Fluorescein Einspritzung erfasst werden. Die Leckflecken (falls vorhanden) sind nach 2,5 min zu beobachten. Zu späteren Zeitpunkten wird die Bildqualität aufgrund von Natriumfluorescein Diffundieren in den Glaskörper, also nur Bilder kurz nach für die Analyse verwendet wird, erhalten hat. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die BRB regelt den Austausch von Molekülen zwischen Blut und Netzhaut. Dessen Abbau ist mit verschiedenen Krankheiten, wie diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) zugeordnet ist. Wir haben kürzlich gezeigt, dass in einer Dystrophin-Knock-out-Maus, die durchlässig BRB zeigt, wird die Netzhaut zügiger der Genübertragung von Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) vermittelt. Trotz BRB Lässigkeit AAV-Partikel injiziert intraokular mit dem Augenraum in diesem Modell beschränkt bleiben. Unsere ...

Müller-Zellen sind die Haupt glial Komponente der Netzhaut. Morphologisch pannen sie die Netzhaut und ihre radial Endfüßen, in Kontakt mit dem Glaskörper vor der ILM und geheime Komponenten des letzteren. Die ILM ist eine Basalmembran von etwa zehn unterschiedlichen extrazellulären Matrixproteinen (Laminin, Agrin, Perlecan, Nidogen, Kollagen und mehrere Heparinsulfatproteoglykanen) zusammen. Während der Entwicklung ist die Präsenz für die Netzhaut Histogenese, Navigations optischer Axone, und das Überleben von Ganglienzellen 1-3 unverzichtbar. Allerdings ist ILM unwesentlich bei erwachsenen Netzhaut und kann chirurgisch in bestimmten Krankheitsbildern entfernt werden, ohne dass Netzhautschäden 4. Bei der Gentherapie wird diese Membran eine physikalische Barriere für eine effiziente Transduktion der Retina mit AAVs durch intravitreale Injektion 5. Durch die umfangreiche Verzweigung ihrer Prozesse, Müllerzellen bieten Ernährungs- und regulatorischen support, um sowohl retinale Neuronen und vaskulären Zellen. Müller-Zellen werden auch in die Regulation der retinalen Homöostase beteiligt sind, bei der Bildung und Aufrechterhaltung der BRB 6. Tight Junctions zwischen retinalen Endothelzellen, Müllerzellen, Astrozyten und Perizyten bilden die BRB. BRB verhindert bestimmte Substanzen aus der Eingabe der retina.In vielen Krankheiten wie diabetische Retinopathie, Netzhautvenenverschluss und respiratorischen Erkrankungen, Hypoxie der Retina führt zu Leckagen durch die BRB 7-9. Dieser Bruch wird mit einer Erhöhung der vaskulären Permeabilität, die zu vasogenes Ödem, Netzhautablösung und retinale Schädigung verbunden. Müller-Zellen sind dicht mit Blutgefäßen und der Basalmembran zugeordnet und spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der BRB und ILM Integrität. Folglich Beschriftung Müller Gliazellen ist besonders relevant für die Untersuchung der physikalischen Zustand dieser Netzhautbarrieren. KlassikerAlliierten wird BRB Lässigkeit unter Verwendung des Evans-Blau-Assays, die aus der systemischen Injektion von Evans-Blau-Farbstoff, der nicht-kovalent an Plasmaalbumin bindet gemessen. Dieser Test misst die Albuminverlusts (Protein mittlerer Größe, ~ 66 kDa) von Blutgefäßen in der Netzhaut (siehe Protokolle Abschnitt 5) 10. Alternativ kann die Gefäßdurchlässigkeit durch Fluoreszenz retinalen Angiographie Bescheinigung für Leckage von Fluorescein visualisiert werden (kleines Molekül, ~ 359 Da; siehe Protocols Abschnitt 6) 11. Dennoch sind beide Verfahren ermöglichen die Bewertung der BRB Lässigkeit für kleine Moleküle und Proteine, aber sie bieten keine Informationen über das ILM Integrität. Daher, um BRB Lässigkeit zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basierte Methode, die Informationen über die BRB Permeabilität zu größeren Molekülen (zB AAV-Partikel, 25 nm Durchmesser) einbringt. In der Tat kann unsere Methode Vorhandensein von AAV Transgen im Blut zu erkennen, was vermuten lässt, dass ~ Partikel 25 nm Durchmesser würdein der Lage, in den Blutstrom einzudringen. Dieses Verfahren liefert auch Informationen über die Struktur des ILM und extrazellulären Matrixproteinen in pathologischen Zuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. Subretinal injiziert hat AAV5 einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren und retinale Pigmentepithel 12, aber es kann, wenn es in den Glaskörper in Wildtyp-Retina mit intakten ILM 5,13 verabreichten nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 ist ein AAV-Variante, die konstruiert wurde, um gezielt Gliazellen über Neuronen 14,15. ShH10 selektiv Etiketten Müller-Zellen sowohl in gesunden und erkrankten Netzhaut mit erhöhter Effizienz in der Netzhaut mit eingeschränkter Barrieren 16. Diese viralen Tools gepaart mit immuhistochemistry und Blut-DNA-Analysen geben Auskunft über den Zustand der Netzhaut-Barrieren und ihre Beteiligung an Krankheit (Bild 1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J Mäusestamm</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>Mäuse</td></tr><tr><td>Ketamin 500</td><td>Virbac Frankreich</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Xylazin Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Neosynephrin 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>Dilatant</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0,5%</td><td>Thea</td><td></td><td>Dilatant</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>entzündungshemmendes</td></tr><tr><td>Kryomatrix-Einbettungsharz</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhäsionsfolien</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Anti-Laminin</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin-Klon 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Glutamin-Synthetase-Klon GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Sauric Protein</td><td>Dako</td><td>334</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>Sonde</td></tr><tr><td>Alexa Fluor konjugierte Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Fluorsave Reagenz</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA-Polymerase</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Farbstoff</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>Farbstoff</td></tr><tr><td>5 & Mikro; m Filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C1909-2,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamid spektrophotometrisch</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>Farbstoff</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>Das Mikroskopiesystem basiert auf einer 3-CCD-Farbkamera, einem Framegrabber und handelsüblicher Software und ermöglicht es Forschern, die Netzhaut von Mäusen abzubilden.</td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 10 & Mikro; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Nadel RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Intravitreale Injektion</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Vielseitiger Injektor verwendet Mikrospritzen zur Abgabe von Pikolitervolumina</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (eins) mit SYS-Micro4 Controller</td><td>UMP3-1</td><td>Digitaler Controller</td><td></td></tr><tr><td>Binokularlupe SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0,66 x 5 x LEDs mit Stativ Epi und Dia / Netzhautdissektion</td></tr><tr><td>Federschere gerade - 8,5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Netzhautdissektion</td></tr><tr><td>gebogene Vanna-Schere</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life Technologien</td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Laborbedarf</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k Omega Röhren</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometer</td><td>TECAN</td><td>unendlich M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung adeno-assoziierte virus als werkzeug retinal barrieren in disease study

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Müller-Zellen sind die Haupt gliale Zellen der Retina. Ende ihrer Füße bilden die Grenzen der Netzhaut auf der äußeren und inneren Begrenzungsmembranen (ILM) und in Verbindung mit Astrozyten Perizyten und Endothelzellen sie die Blut-Retina-Schranke (BRB) herzustellen. BRB begrenzt Materialtransport zwischen dem Blutstrom und der Netzhaut, während das ILM wirkt als Basalmembran histologisch die Grenze zwischen der Netzhaut und des Glas Hohlraum definiert. Beschriftung Müller-Zellen ist besonders relevant für den physikalischen Zustand der Netzhautbarrieren zu studieren, da diese Zellen sind ein integraler Bestandteil des BRB und ILM. Sowohl BRB und ILM werden häufig in Netzhauterkrankungen verändert und sind für die Krankheitssymptome verantwortlich. Es gibt mehrere gut etablierte Verfahren, um die Integrität des BRB studieren, wie die Evans Blau-Assay oder Angiographie. Allerdings sind diese Verfahren nicht auf das Ausmaß der BRB Lässigkeit t informiereno größere Moleküle, im Nanometerbereich. Außerdem liefern sie keine Informationen über den Zustand anderer retinaler Barrieren wie die ILM. Um BRB Permeabilität neben retinalen ILM zu untersuchen, verwendeten wir ein AAV basiertes Verfahren, das Informationen über Permeabilität BRB zu größeren Molekülen während sie den Zustand der ILM und extrazellulären Matrixproteinen in Krankheitszuständen. Zwei AAV-Varianten eignen sich für eine solche Studie: AAV5 und ShH10. AAV5 hat einen natürlichen Tropismus für Photorezeptoren, aber es kann, wenn es in den Glaskörper verabreicht wird, wenn das ILM intakt ist (dh, in Wildtyp-Retina) nicht quer zu der äußeren Netzhaut zu erhalten. ShH10 hat eine starke Tropismus hin Gliazellen und selektive Markierung Müller Glia in gesunden und erkrankten Netzhaut. ShH10 bietet effizientere Genübertragung in Netzhaut, wo ILM gefährdet ist. Diese viralen Tools gepaart mit Immunhistochemie und Blut-DNA-Analyse Aufschluss auf den Zustand der Netzhautbarrieren in Krankheit.

Wir erwarten mehr retinalen Transduktion Müller Gliazellen mit ShH10 wenn das Tiermodell zeigt Störungen in der Struktur des ILM (2A - B). Zum Beispiel haben wir in Abwesenheit von DP71 gezeigt, ShH10 Targets spezifisch aber effizienter Müller Gliazellen durch intravitreale Injektion, was auf eine erhöhte Durchlässigkeit der ILM in diesem Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 16 (2C - F). AAV5 kann auch als Ind...

Um die Permeabilität der Blut-Netzhaut-Schranke und die innere Grenzmembranintegrität in Tiermodellen für Netzhauterkrankungen zu untersuchen, haben wir mehrere Adeno-assoziierte Virus (AAV) Varianten als Werkzeuge zur Markierung von retinalen Neuronen und Gliazellen verwendet. Die virusvermittelte Reportergenexpression wird dann als Indikator für die Permeabilität der Netzhautbarriere verwendet.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke und die Integrität der inneren Begrenzungsmembran in Tiermodellen retinaler Erkrankungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst AAV-Partikel, die ein GFP-Transgen enthalten, in das Glaskörpergel oder in die Blutbahn injiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Injektionen Blutproben zu entnehmen.Die Blutentnahme wird durch wöchentliche in vivo Fundus-Aufnahmen ergänzt. Der letzte Schritt besteht darin, Immunhistochemie an retinalen Flachpräparaten und retinalen Kryoschnitten durchzuführen. Abschließend werden konfokale Mikroskopie und PCR verwendet, um das Transduktionsmuster als Indikator für die Integrität der ILM zu zeigen und AAV-Partikel im Blutkreislauf nachzuweisen, wodurch die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke demonstriert wird.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden besteht darin, dass die AAV-Paste-Methode Informationen über die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke liefert, die von anderen Zellen nicht bereitgestellt werden. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die AAV-vermittelte Gentherapie, da sie dazu beiträgt, die Durchlässigkeit der Blut-Retina-Schranke für AAV-Partikel sicherzustellen und somit unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden. Diese Methode kann Aufschluss über die Integrität der inneren Begrenzungsmembran in Tiermodellen anderer Netzhauterkrankungen, wie beispielsweise diabetischer Ratten, geben.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir beobachteten, dass die Retina unseres DP 71-Null-Mausmodells, die einen Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke zeigte, effizienter transduziert wurde als die Retina des Wildtyps.Beginnen Sie mit der Anästhesierung von C-57 Black-Six-J-Mäusen. Überprüfen Sie den Verlust von drei Reflexen: des Stellreflexes, des Withdrawal-Reflexes und der Schwanzquetschreaktion.Der Verlust dieser Reflexe bestätigt die Anästhesie. Danach weiten Sie die Pupillen, indem Sie 5 % Neosynephrin und 0,5 % Mydriaticum mittels Tropfflasche auf die Hornhaut auftragen. Anschließend befeuchten Sie die Augen mit einer tierärztlichen Salbe, um übermäßiges Austrocknen zu verhindern. Laden Sie nun eine ultrafeine Einwegnadel der Stärke 30 Gauge mit einer Stammlösung auf, die eine bis vier mal 10 hoch 11 Partikel des AAV-GFP enthält.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie die sicherste intravitreale Injektion durchführen müssen, ohne die Linse oder die Netzhaut zu berühren. Führen Sie dann eine extrem feine Einwegnadel mit 30 Gauge durch den Äquator und neben die Limbus in den Glaskörperraum ein. Nachdem die Nadel in das Auge eingeführt wurde, injizieren Sie einen Mikroliter Lösung, während Sie die Nadel im Zentrum des Glaskörperraums beobachten.Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für Experimente an der inneren Limitansmembran und injizieren Sie beide Augen bei Experimenten an der Blut-Retina-Schranke. Nach der Injektion wird jedes behandelte Auge mit einer antiinflammatorischen und einer antibakteriellen topischen Therapie versorgt. Eine Woche später werden die Pupillen mit Neosynephrin und Mydriaticum dilatiert und Fundusuntersuchungen mit einer Augenhintergrundkamera durchgeführt.Verfolgen Sie die GFP-Expression durch Beobachtungen nach einer Woche, zwei Wochen, einem Monat und zwei Monaten nach der Injektion. Nach der Entnahme der Augen von einem euthanasierten injizierten Tier sezieren Sie die Augen, um Linse und Hornhaut zu entfernen. Danach fixieren Sie das präparierte Auge eine Stunde lang durch Einbetten in 4% Paraformaldehyd. Nach einer Stunde kryoschützen Sie die Augen eine weitere Stunde bei Raumtemperatur in 10% Saccharose. Anschließend lassen Sie die Augen bei Raumtemperatur für ein Drittel einer Stunde in 20% Saccharose einwirken.Lassen Sie die Augen schließlich über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 30 %igen Saccharoslösung. Am nächsten Tag werden die Augenschalen in einem Einbettungsharz wie beispielsweise Cryo-Matrix eingebettet und eingefroren. Anschließend werden mit dem Kryostaten 10 µm dicke Schnitte angefertigt und auf für gefrorenes Gewebe vorbereitete Objektträger aufgebracht.Permeabilisieren Sie die Schnitte auf den Objektträgern nun fünf Minuten lang mit einem Tensid. Danach führen Sie zwei kurze Waschungen in PBS durch. Anschließend blockieren Sie die Augen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Um die Präparation bei retinalen Flachpräparaten zu erleichtern, fixieren Sie die enukleierten Augen 15 bis 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Diese Fixierung sowie die Fixierung nach der Präparation müssen sorgfältig durchgeführt werden, da dies entscheidend für die Erhaltung der GFP-Fluoreszenz ist. Innerhalb von 15 bis 30 Minuten der Fixierungszeit präparieren Sie die Augen, entfernen Sie die Hornhaut und die Linse.L&ouml;sen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel und von der Sklera, indem Sie entlang der Ora serrata und des Sehnervs schneiden. Tauchen Sie die Netzh&auml;ute nach der Dissektion weitere 30 Minuten in 4 % Paraformaldehyd, um das Gewebe und das fluoreszierende Protein in den transduzierten Netzhautzellen zu fixieren. Sp&uuml;len Sie die Probe nach der Fixierung f&uuml;nf Minuten lang in steriler PBS bei pH 7,4 aus.Danach das PBS durch Blockierpuffer wechseln und die Netzhäute vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie den Markierungsschritt, indem Sie die Proben entweder vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit den primären Antikörpern im Blockierpuffer inkubieren. Nach der Applikation des primären Antikörpers die Gewebe dreimal mit PBS waschen und anschließend die Gewebe in einer 1:500-Verdünnung von mit Alexa Fluor markierten Antikörpern im Blockierpuffer inkubieren.Einwirkzeit von einer Stunde für Kryoschnitte oder zwei Stunden für flache Präparate bei Raumtemperatur einhalten und vor Licht schützen. Nach der Applikation des sekundären Antikörpers diesen wie zuvor durch drei Waschungen mit PBS entfernen. Führen Sie nun Entlastungsschnitte an der Netzhaut durch, damit diese flach auf einen Objektträger aufgebracht werden kann, wobei entweder die Photorezeptoren oder die Ganglienzellen der Netzhaut nach oben weisen. Geben Sie ein wässriges Eindeckmedium auf und setzen Sie einen Deckgläser auf. Die Präparate können vor der konfokalen Mikroskopie bei vier Grad Celsius gelagert werden.Beginnen Sie mit der Erzeugung einer positiven Kontrolle für zirkulierende AAV-Partikel. Entnehmen Sie zunächst eine 10 bis 20 Mikroliter große Blutprobe, bevor Sie das AAV injizieren. Danach, nach Einleitung der Anästhesie, injizieren Sie 100 Mikroliter der viralen Stammlösung in den Blutkreislauf.Die einfachere Methode, Substanzen in den Blutstrom zu injizieren, ist die penile Vene. In dieser Videoaufnahme injizieren wir einen blauen Farbstoff als visuelle Kontrolle der Injektion. Nehmen Sie in den folgenden drei Tagen regelmäßig kleine Blutproben und opfern Sie anschließend die Maus. Extrahieren Sie aus einer Gewebeprobe die genomische DNA der Proben mithilfe eines kommerziellen Kits. Führen Sie mit der DNA eine PCR-Amplifikation mit einem Primerpaar für GFP durch. Führen Sie 30 Zyklen mit 45 Sekunden Verlängerungszeit und einer Annealing-Temperatur von 55 Grad Celsius durch. Es wurde erwartet, dass das Transduktionsmuster des SHH 10-Vektors in den DP 71-Null-Mäusen zunimmt. Wenn das Tiermodell Störungen in der Struktur der inneren Begrenzungsmembran aufweist, weisen die DP 71-Null-Mäuse beeinträchtigte retinale Barrieren auf und stellen daher einen nützlichen Vergleich dar: Bei der intravitrealen Injektion zielt SHH 10 in DP 71-Null-Mäusen effizienter auf Müller-Gliazellen ab.Dies deutet auf eine Destabilisierung der inneren Begrenzungsmembran in dieser transgenen Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen hin. Die Injektion von AAV5-GFP zeigte ebenfalls eine Durchlässigkeit der inneren Begrenzungsmembran. AAV5 war bei intravitrealer Injektion in Wildtyp-Mäusen unwirksam, erwies sich jedoch als stark wirksam in der Genübertragung auf Photorezeptoren bei Mäusen mit beeinträchtigten retinalen Barrieren, wie beispielsweise bei den DP 71-Null-Mäusen.Mittels PCR-Analyse bleibt die Blut-Retina-Schranke bei DP71-defizienten Mäusen selektiv gegenüber AAV-Partikeln, da nach intravitrealer Injektion in ihren Blutproben keine Spuren von AAV nachgewiesen wurden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie adenoassoziierte Viren verwendet werden können, um die Integrität der inneren Begrenzungsmembran oder die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke zu testen, indem man das Transduktionsmuster der Retina oder das Vorhandensein von AAV-Partikeln im Blutkreislauf analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Dieses Video zeigt, wie primäre Mittelhirnneuronen von Mäusen mit Adeno-assoziierten Viren infiziert werden, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator tragen. Die Fluoreszenz des Indikators bestätigt die erfolgreiche Infektion und ermöglicht die Echtzeitüberwachung der neuronalen Infektion.

Infektion von primären Mittelhirnneuronen der Maus mit gentechnisch veränderten Adeno-assoziierten Viren

Quelle: Grames, M. S., et al. Methoden und Tipps zur intravenösen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren an Ratten und zur Bewertung der Transduktion des Zentralnervensystems. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Schwanzveneninjektion von rekombinanten Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei Ratten. Nach der Injektion in die Seitenschwanzvene gelangt das Virus in den Blutkreislauf, zirkuliert durch das Herz und erreicht das Gehirn, wo es in Neuronen eindringt und die Produktion von...

 Intravenöse Verabreichung von rekombinanten Adeno-assoziierten Virusvektoren in einem Rattenmodell 

Die subretinale Injektion ist eine chirurgische Technik zur effektiven Genabgabe an das retinale Pigmentepithel im Mausauge.  Hier beschreiben wir eine einfache und replizierbare Methode zur subretinalen Injektion von viralen Vektoren in retinales Pigmentepithel bei Versuchsmäusen.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

In diesem Manuskript wird die subkonjunktivale Injektion als gültige Vektorabgabemethode für Augengewebe bei Mäusen unter Verwendung eines Injektionssystems demonstriert, das aus einer Infusions-/Entnahmespritzenpumpe und einer gasdichten herausnehmbaren Spritze in Verbindung mit Mikroinjektionsnadeln besteht. Dieses Injektionssystem ist auch für andere intraokulare Verabreichungswege anpassbar.

Subkonjunktivale Verabreichung von Adeno-assoziierten Virusvektoren in Kleintiermodellen

Adeno-assoziiertes Virus wird in Suspensionszellkultur hergestellt und durch doppelte Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Es sind Schritte enthalten, um die Gesamtvirusausbeute zu erhöhen, das Risiko von Virusausfällungen zu verringern und das endgültige Virusprodukt weiter zu konzentrieren. Die erwarteten Endtiter erreichen 10bis 12 Viruspartikel/ml und sind für die präklinische In-vivo-Anwendung geeignet.

Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Erfahren Sie, wie AAV-Partikel zur Untersuchung der Blut-Retina-Schranke und der inneren Grenzmembran in Netzhautkrankheiten eingesetzt werden. Diese Methode nutzt GFP-Transgene und Konfokalmikroskopie für präzise Analysen.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

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