Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Permeabilität der Blutnetzhautschranke und die innere Grenzmembranintegrität in Tiermodellen für Netzhauterkrankungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst A-A-V-Partikel, die ein A-GFP-Transgen enthalten, in den Glaskörper oder in den Blutkreislauf injiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Injektionen zu nehmen.

Die Blutentnahme wird durch eine wöchentliche In-vivo-Fundusbildgebung ergänzt. Der letzte Schritt ist die Durchführung der Immunhistochemie an Netzhautlappenhalterungen und retinalen Kryoschnitten. Letztendlich werden konfokale Mikroskopie und PCR verwendet, um den Transduktionsmusterindikator für die ILM-Integrität zu zeigen und a v Partikel im Blutkreislauf zu detektieren und so die Durchlässigkeit der Blutnetzhautschranke zu demonstrieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik, gegenüber unseren bestehenden Methoden, besteht darin, dass die AAV-Pastenmethode Informationen über die Durchlässigkeit der Blutnetzhautbarriere liefert, die von anderen Zellen nicht bereitgestellt wird. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die AAV-vermittelte Gentherapie, da sie dazu beiträgt, die Durchlässigkeit der Blutnetzhautschranke für AAV-Partikel sicherzustellen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden. Diese Methode kann Einblicke in die Integrität der inneren Grenzmembran in Tiermodellen anderer Netzhauterkrankungen wie z.B. diabetischer Ratten geben.

Wir hatten die ID für diese Methode zum ersten Mal, als wir sahen, dass die Netzhaut unseres DP 71 Non-Use-Modells, das den Zusammenbruch der Netzhautschranke im Blut zeigte, effizienter transduziert wurde als das Wild Tap. Beginnen Sie jetzt mit der Betäubung von C 57 schwarz sechs J Mäusen. Überprüfen Sie, ob drei Reflexe verloren gegangen sind: der Schreibreflex, der Entzugsreflex und die Schwanzklemmreaktion.

Der Verlust dieser Reflexe bestätigt die Anästhesie, dann erweitern Sie die Pupillen, indem Sie 5%Nesrin und 0,5%Mooratum mit einer Pipette auf die Hornhaut auftragen. Verwenden Sie dann eine Tiersalbe, um die Augen zu befeuchten, damit sie nicht zu stark trocknen. Laden Sie nun eine ultrafeine 30-Gauge-Einwegnadel mit Stammlösung, die ein bis viermal 10 bis 11. Partikel A-A-V-G-F-P enthält.

Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie die sicherste intravitreale Injektion durchführen müssen, ohne die Linse oder die Netzhaut zu berühren. Führen Sie dann eine ultrafeine 30-Gauge-Einwegnadel durch den Äquator und neben dem Limbus in die Glaskörperhöhle. Nachdem Sie die Nadel in das Öhr eingeführt haben, injizieren Sie einen Mikroliter Lösung, während Sie die Nadel in der Mitte der Glaskörperhöhle beobachten.

Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für Experimente mit der inneren Grenzmembran und injizieren Sie beide Augen pro Blut-Netzhautschranken-Experiment. Tragen Sie nach der Injektion eine entzündungshemmende und eine antibakterielle topische Behandlung auf jedes injizierte Auge auf. Eine Woche später erweitern Sie die Pupillen mit Nesrine und MyUM und führen Sie Fundusuntersuchungen mit einer Augenfunduskamera durch.

Verfolgen Sie die GFP-Expression mit Beobachtungen eine Woche, zwei Wochen, einen Monat und zwei Monate nach der Injektion. Nachdem Sie die Augen eines euthanasierten injizierten Tieres entnommen haben, präparieren Sie die Augen, um die Linse und die Hornhaut zu entfernen. Dann das Eintauchen.

Fixieren Sie das präparierte Auge eine Stunde lang in 4%para Formaldehyd. Nach einer Stunde kryoschützen Sie die Augen in 10%iger Saccharose für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Dann die Augen eine Drittelstunde lang bei Raumtemperatur in 20%iger Saccharose einweichen.

Zum Schluss lassen Sie die Augen über Nacht bei vier Grad Celsius in 30%iger Saccharoselösung. Am nächsten Tag betten Sie die Augenmuscheln in ein Einbettharz wie Cryo Matrixx ein und frieren Sie sie ein. Machen Sie dann mit dem Kryostaten 10-Mikrometer-Schnitte und montieren Sie sie auf Objektträger, die für gefrorenes Gewebe vorbereitet sind.

Nun die Abschnitte auf den Objektträgern fünf Minuten lang mit Spülmittel durchsehen. Folgen Sie mit zwei kurzen Waschungen in PBS. Blockieren Sie dann die Augen für eine Stunde bei Raumtemperatur für retinale flache Halterungen.

Erleichtern Sie die Dissektion, indem Sie die entkernten Augen 15 bis 30 Minuten lang in 4%para-Formaldehyd fixieren. Diese Fixierung und die Fixierung nach der Dissektion müssen ordnungsgemäß durchgeführt werden, da dies für die Erhaltung der GFP-Fluoreszenz innerhalb von 15 bis 30 Minuten nach der Fixationszeit entscheidend ist. Präparieren Sie die Augen, entfernen Sie die Hornhaut und die Linse.

Trennen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel und von der Sklera, indem Sie um die oralen Serrata und den Sehnerv herum schneiden. Tauchen Sie die Netzhaut nach der Dissektion für weitere 30 Minuten in 4%Para-Formaldehyd, um das Gewebe und das fluoreszierende Protein in den transduzierten Netzhautzellen zu fixieren. Nach der Fixierung waschen Sie die Probe fünf Minuten lang in sterilem PBS bei pH 7,4.

Schalten Sie dann das PBS auf Blockierungspuffer um und inkubieren Sie die Netzhaut vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Beginnen Sie den Markierungsschritt, indem Sie die Proben mit den Primärantikörpern entweder vier Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius in Blockpuffer inkubieren. Nach dem Auftragen des Primärantikörpers waschen Sie das Gewebe dreimal mit PBS und inkubieren Sie das Gewebe in einer Verdünnung von 1 bis 500 für konjugierte Antikörper in Blockierungspuffer.

Inkubieren Sie eine Stunde lang für Kryo-Schnitte oder zwei Stunden für flache Halterungen. Tun Sie dies bei Raumtemperatur und schützen Sie es vor Licht. Nachdem der Sekundär aufgetragen wurde, entfernen Sie ihn mit drei Wäschen in PBS.

Nehmen Sie wie bisher entlastende Schnitte an der Netzhaut vor, so dass sie flach auf einem Objektträger montiert werden kann, wobei entweder die Photorezeptoren oder die retinalen Ganglienzellen nach oben zeigen. Tragen Sie ein wässriges Eindeckmedium und einen Decklader auf. Die Objektträger können vor der konfokalen Mikroskopie bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Beginnen Sie mit der Erzeugung einer positiven Kontrolle für die Zirkulation von a a v Teilchen. Nehmen Sie zunächst eine Blutprobe von 10 bis 20 Mikrolitern, bevor Sie das A A v injizieren. Injizieren Sie dann nach der Betäubung 100 Mikroliter der Stammviruslösung in den Blutkreislauf.

Der einfachere Weg, Substanzen in den Blutkreislauf zu injizieren, ist die Penisvene. In dieser Videoaufnahme injizieren wir blauen Farbstoff als visuelle Kontrolle der Injektion in den nächsten drei Tagen. Entnehmen Sie weiterhin regelmäßig eine kleine Blutprobe und opfern Sie dann die Maus aus einer Gewebeprobe.

Extrahieren Sie die genomische DNA aus den Proben mit einem kommerziellen Kit, wobei Sie die DNA verwenden. Führen Sie eine PCR-Amplifikation mit einem Primerpaar durch, um GFP in 30 Zyklen mit 45-Sekunden-Verlängerungen und 55 Grad Celsius durchzuführen. Es wurde erwartet, dass das Transduktionsmuster des SHH 10-Vektors in den DP 71 NU-Mäusen zunimmt. Wenn das Tiermodell Störungen in der Struktur der inneren Grenzmembran zeigte, haben DP 71 null Mäuse eine kompromittierte retinale Barriere und sind daher ein nützlicher Vergleich in den DP 71 null Mäusen, so zielt die intravitreale Injektion von S SHH 10 effizienter auf Miller-Gliazellen ab.

Dies deutet auf eine Destabilisierung der inneren Grenzmembran in dieser transgenen Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen hin. Die Injektion von A A V 5G FP zeigte auch die innere Grenzpermeabilität der Membran. AAV 5 war durch intravitreale Injektion bei Wildtyp-Mäusen wirksam, wurde aber bei Mäusen mit geschwächten Netzhautbarrieren, wie z. B. bei den DP 71 Null-Mäusen, stark wirksam bei der Genabgabe an Photorezeptoren.

Durch PCR-Analyse. Die Blut-Netzhautschranke in DP 71 null-Mäusen bleibt selektiv für AAV-Partikel, da in ihren Blutproben nach intravitrealer Injektion keine Spur von a a v gefunden wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Adeno-assoziierte Virus verwenden, um die Integrität der inneren Grenzmembran oder die Permeabilität der Blutbiopsie zu testen, indem Sie das Transduktionsmuster der Netzhaut oder das Vorhandensein von AV-Partikeln in den Blutkreislauf analysieren.