Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke und die Integrität der inneren Begrenzungsmembran in Tiermodellen retinaler Erkrankungen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst AAV-Partikel, die ein GFP-Transgen enthalten, in das Glaskörpergel oder in die Blutbahn injiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Injektionen Blutproben zu entnehmen.

Die Blutentnahme wird durch wöchentliche in vivo Fundus-Aufnahmen ergänzt. Der letzte Schritt besteht darin, Immunhistochemie an retinalen Flachpräparaten und retinalen Kryoschnitten durchzuführen. Abschließend werden konfokale Mikroskopie und PCR verwendet, um das Transduktionsmuster als Indikator für die Integrität der ILM zu zeigen und AAV-Partikel im Blutkreislauf nachzuweisen, wodurch die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke demonstriert wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden besteht darin, dass die AAV-Paste-Methode Informationen über die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke liefert, die von anderen Zellen nicht bereitgestellt werden. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die AAV-vermittelte Gentherapie, da sie dazu beiträgt, die Durchlässigkeit der Blut-Retina-Schranke für AAV-Partikel sicherzustellen und somit unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden. Diese Methode kann Aufschluss über die Integrität der inneren Begrenzungsmembran in Tiermodellen anderer Netzhauterkrankungen, wie beispielsweise diabetischer Ratten, geben.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir beobachteten, dass die Retina unseres DP 71-Null-Mausmodells, die einen Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke zeigte, effizienter transduziert wurde als die Retina des Wildtyps.

Beginnen Sie mit der Anästhesierung von C-57 Black-Six-J-Mäusen. Überprüfen Sie den Verlust von drei Reflexen: des Stellreflexes, des Withdrawal-Reflexes und der Schwanzquetschreaktion.

Der Verlust dieser Reflexe bestätigt die Anästhesie. Danach weiten Sie die Pupillen, indem Sie 5 % Neosynephrin und 0,5 % Mydriaticum mittels Tropfflasche auf die Hornhaut auftragen. Anschließend befeuchten Sie die Augen mit einer tierärztlichen Salbe, um übermäßiges Austrocknen zu verhindern. Laden Sie nun eine ultrafeine Einwegnadel der Stärke 30 Gauge mit einer Stammlösung auf, die eine bis vier mal 10 hoch 11 Partikel des AAV-GFP enthält.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie die sicherste intravitreale Injektion durchführen müssen, ohne die Linse oder die Netzhaut zu berühren. Führen Sie dann eine extrem feine Einwegnadel mit 30 Gauge durch den Äquator und neben die Limbus in den Glaskörperraum ein. Nachdem die Nadel in das Auge eingeführt wurde, injizieren Sie einen Mikroliter Lösung, während Sie die Nadel im Zentrum des Glaskörperraums beobachten.

Verwenden Sie ein Auge als Kontrolle für Experimente an der inneren Limitansmembran und injizieren Sie beide Augen bei Experimenten an der Blut-Retina-Schranke. Nach der Injektion wird jedes behandelte Auge mit einer antiinflammatorischen und einer antibakteriellen topischen Therapie versorgt. Eine Woche später werden die Pupillen mit Neosynephrin und Mydriaticum dilatiert und Fundusuntersuchungen mit einer Augenhintergrundkamera durchgeführt.

Verfolgen Sie die GFP-Expression durch Beobachtungen nach einer Woche, zwei Wochen, einem Monat und zwei Monaten nach der Injektion. Nach der Entnahme der Augen von einem euthanasierten injizierten Tier sezieren Sie die Augen, um Linse und Hornhaut zu entfernen. Danach fixieren Sie das präparierte Auge eine Stunde lang durch Einbetten in 4% Paraformaldehyd. Nach einer Stunde kryoschützen Sie die Augen eine weitere Stunde bei Raumtemperatur in 10% Saccharose. Anschließend lassen Sie die Augen bei Raumtemperatur für ein Drittel einer Stunde in 20% Saccharose einwirken.

Lassen Sie die Augen schließlich über Nacht bei vier Grad Celsius in einer 30 %igen Saccharoslösung. Am nächsten Tag werden die Augenschalen in einem Einbettungsharz wie beispielsweise Cryo-Matrix eingebettet und eingefroren. Anschließend werden mit dem Kryostaten 10 µm dicke Schnitte angefertigt und auf für gefrorenes Gewebe vorbereitete Objektträger aufgebracht.

Permeabilisieren Sie die Schnitte auf den Objektträgern nun fünf Minuten lang mit einem Tensid. Danach führen Sie zwei kurze Waschungen in PBS durch. Anschließend blockieren Sie die Augen eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Um die Präparation bei retinalen Flachpräparaten zu erleichtern, fixieren Sie die enukleierten Augen 15 bis 30 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Diese Fixierung sowie die Fixierung nach der Präparation müssen sorgfältig durchgeführt werden, da dies entscheidend für die Erhaltung der GFP-Fluoreszenz ist. Innerhalb von 15 bis 30 Minuten der Fixierungszeit präparieren Sie die Augen, entfernen Sie die Hornhaut und die Linse.

Lösen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel und von der Sklera, indem Sie entlang der Ora serrata und des Sehnervs schneiden. Tauchen Sie die Netzhäute nach der Dissektion weitere 30 Minuten in 4 % Paraformaldehyd, um das Gewebe und das fluoreszierende Protein in den transduzierten Netzhautzellen zu fixieren. Spülen Sie die Probe nach der Fixierung fünf Minuten lang in steriler PBS bei pH 7,4 aus.

Danach das PBS durch Blockierpuffer wechseln und die Netzhäute vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Beginnen Sie den Markierungsschritt, indem Sie die Proben entweder vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit den primären Antikörpern im Blockierpuffer inkubieren. Nach der Applikation des primären Antikörpers die Gewebe dreimal mit PBS waschen und anschließend die Gewebe in einer 1:500-Verdünnung von mit Alexa Fluor markierten Antikörpern im Blockierpuffer inkubieren.

Einwirkzeit von einer Stunde für Kryoschnitte oder zwei Stunden für flache Präparate bei Raumtemperatur einhalten und vor Licht schützen. Nach der Applikation des sekundären Antikörpers diesen wie zuvor durch drei Waschungen mit PBS entfernen.

Führen Sie nun Entlastungsschnitte an der Netzhaut durch, damit diese flach auf einen Objektträger aufgebracht werden kann, wobei entweder die Photorezeptoren oder die Ganglienzellen der Netzhaut nach oben weisen. Geben Sie ein wässriges Eindeckmedium auf und setzen Sie einen Deckgläser auf. Die Präparate können vor der konfokalen Mikroskopie bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Beginnen Sie mit der Erzeugung einer positiven Kontrolle für zirkulierende AAV-Partikel. Entnehmen Sie zunächst eine 10 bis 20 Mikroliter große Blutprobe, bevor Sie das AAV injizieren. Danach, nach Einleitung der Anästhesie, injizieren Sie 100 Mikroliter der viralen Stammlösung in den Blutkreislauf.

Die einfachere Methode, Substanzen in den Blutstrom zu injizieren, ist die penile Vene. In dieser Videoaufnahme injizieren wir einen blauen Farbstoff als visuelle Kontrolle der Injektion. Nehmen Sie in den folgenden drei Tagen regelmäßig kleine Blutproben und opfern Sie anschließend die Maus. Extrahieren Sie aus einer Gewebeprobe die genomische DNA der Proben mithilfe eines kommerziellen Kits. Führen Sie mit der DNA eine PCR-Amplifikation mit einem Primerpaar für GFP durch. Führen Sie 30 Zyklen mit 45 Sekunden Verlängerungszeit und einer Annealing-Temperatur von 55 Grad Celsius durch. Es wurde erwartet, dass das Transduktionsmuster des SHH 10-Vektors in den DP 71-Null-Mäusen zunimmt. Wenn das Tiermodell Störungen in der Struktur der inneren Begrenzungsmembran aufweist, weisen die DP 71-Null-Mäuse beeinträchtigte retinale Barrieren auf und stellen daher einen nützlichen Vergleich dar: Bei der intravitrealen Injektion zielt SHH 10 in DP 71-Null-Mäusen effizienter auf Müller-Gliazellen ab.

Dies deutet auf eine Destabilisierung der inneren Begrenzungsmembran in dieser transgenen Mauslinie im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen hin. Die Injektion von AAV5-GFP zeigte ebenfalls eine Durchlässigkeit der inneren Begrenzungsmembran. AAV5 war bei intravitrealer Injektion in Wildtyp-Mäusen unwirksam, erwies sich jedoch als stark wirksam in der Genübertragung auf Photorezeptoren bei Mäusen mit beeinträchtigten retinalen Barrieren, wie beispielsweise bei den DP 71-Null-Mäusen.

Mittels PCR-Analyse bleibt die Blut-Retina-Schranke bei DP71-defizienten Mäusen selektiv gegenüber AAV-Partikeln, da nach intravitrealer Injektion in ihren Blutproben keine Spuren von AAV nachgewiesen wurden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie adenoassoziierte Viren verwendet werden können, um die Integrität der inneren Begrenzungsmembran oder die Permeabilität der Blut-Retina-Schranke zu testen, indem man das Transduktionsmuster der Retina oder das Vorhandensein von AAV-Partikeln im Blutkreislauf analysiert.