Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4 ⁺ CD45RB ^Hoch T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Darmentzündung durch den adoptiven Transfer naiver T-Zellen in immundefiziente Mäuse zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen aus der Milz der Maus isoliert, die Blutzellen lysiert und dann die Population für Zöliakie-4-positive T-Zellen angereichert wird. Der zweite Schritt besteht darin, diese Zellen mit fluoreszierenden DI-konjugierten CD 4- und CD 45 RB-Antikörpern zu markieren.

Anschließend werden die markierten Zellen anhand von Fakten in CD 45, RB low und CD 45 RB high Populationen sortiert. Der letzte Schritt besteht darin, die hohen Zellen von CD 45 RB durch intraperitoneale Injektion in immundefiziente Mäuse zu übertragen. Letztendlich werden die übertragenen Zellen aktiviert und verursachen in Abwesenheit von T-regulatorischen Zellen lokale Gewebeschäden, die zu einer experimentellen Kolitis führen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung entzündlicher Darmerkrankungen zu beantworten, wie z. B. die Rolle spezifischer Zellpopulationen und der gastrointestinalen Mikrobiota bei der Krankheitsentstehung. Nachdem Sie die Spendermaus eingeschläfert haben, besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren. Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt über den Bauch und schälen Sie die Haut zurück, um das Bauchfell mit einer Pinzette freizulegen.

Halten Sie das Bauchfell von den inneren Organen fern und machen Sie einen Schnitt im linken Bauchfell. Als nächstes schneiden Sie die Milz aus der Maus heraus und legen sie in eine Petrischale mit 10 Millilitern eiskaltem, vollständigem Medium. Zerkleinern Sie die Milz mit zwei sterilen Objektträgern, um eine einzellige Suspension herzustellen.

Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie das Sieb dann mit fünf Millilitern kompletter mittlerer Belastung bis zu fünf Milz in einem konischen Röhrchen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 mal G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und resuspendieren Sie die Zellen dann vorsichtig in 10 Millilitern eiskaltem Markierungspuffer

Kombinieren Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 180 Mikrolitern 0,4%iger Trianblaulösung und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der nicht-blauen Zellen unter dem Mikroskop, um mit der Anreicherung des Pellets zu beginnen, und reaktivieren Sie die Zellen vorsichtig in eiskaltem Markierungspuffer in einer Konzentration von 20 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie fünf Mikroliter biotinylierten CD-Antikörper mit vier T-Zell-Anreicherungen pro mal 10 zu den sechs Zellen und inkubieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang mit dem Antikörper auf Eis.

Geben Sie das 10-fache Volumen des Markierungspuffers in die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen dann sieben Minuten lang bei 450-fachem G. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Zellpellet zu stören. Als nächstes werden die Streptavidin-konjugierten magnetischen Partikel durch Vortexen wieder suspendiert und fünf Mikroliter Partikel pro einmal 10 zu den sechs Zellen der Zellen hinzugefügt.

Mischen Sie die Partikel mit den Zellen, indem Sie das Röhrchen vorsichtig schnippen, und inkubieren Sie die Mischung dann 30 Minuten lang bei sechs bis 12 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen auf eine Konzentration von 20 bis 80 mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter mit Markierungspuffer. Übertragen Sie dann einen Milliliter markierter Zellen in ein 12 Millimeter x 75 Millimeter großes Reagenzglas mit rundem Boden und platzieren Sie dieses Röhrchen mit positiver Fraktion für sechs bis acht Minuten auf einem Magneten.

Entfernen Sie mit dem Röhrchen auf dem Magneten vorsichtig den Überstand mit einer Glaspasterpipette, ohne die markierten Zellen zu stören, und geben Sie ihn in ein neues steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Diese Fraktion enthält die CD vier positive T-Zellen. Entfernen Sie das Röhrchen für die positive Fraktion aus dem Magneten und resuspendieren Sie die Zellen in Markierungspuffer, indem Sie kräftig pipettieren.

Setzen Sie das Rohr für weitere sechs bis acht Minuten wieder in den Magneten ein. Übertragen Sie das SUP Nain wieder vorsichtig in das angereicherte Fraktionsröhrchen. Erhöhen Sie die Ausbeute an vier positiven CD-T-Zellen durch Wiederholen der Anreicherung nach Bedarf, um die Zellen für die Markierung vorzubereiten. Zuerst zentrifugieren Sie die angereicherte Fraktion bei 450-fachem G für sieben Minuten und verwerfen Sie den Überstand.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in Markierungspuffer auf eine Konzentration von 10 mal 10 bis den sechsten Zellen pro Milliliter. Aliquot fünfmal 10 der fünften Zellen in einzelnen Mikrofugenröhrchen für ungefärbte isotopengefärbte und einfach gefärbte Kontrollzellen. Geben Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter CD vier, FE und ein Mikrogramm pro Milliliter CD 45 RB PE-Antikörper in das Röhrchen, das die ursprüngliche Zellsuspension enthält.

Die Isotopenkontrollfärbungen und die Einzelfärbungen in gleicher Konzentration werden den entsprechenden Zellaliquoten zugegeben. Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit den Antikörpern und inkubieren Sie die Röhrchen dann 30 Minuten lang auf Eis. Decken Sie die Röhren ab, um sie vor Licht zu schützen.

Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal in Markierungspuffer, wie im Textprotokoll angegeben, und resuspendieren Sie die Zellen bei 10 mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter in Markierungspuffer. Geben Sie dann die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Sieb in einen Faxschlauch. Legen Sie die Tube auf Eis und decken Sie sie ab, um ein Ausbleichen der Flecken zu verhindern.

Verwenden Sie die ungefärbten und einstufigen Kontrollzellen, um die Kompensation auf dem Zellsortierer zu kalibrieren. Schließen Sie die nicht lebensfähigen Zellen mit Vorwärts- und Side-Scattered-Gating aus. Und dann setzen Sie das Gating für CD vier positive und CD vier RB positive Zellen mit den isotopengefärbten Kontrollen.

Nächstes Gate, die CD vier positive Population und dann sortieren Sie die Zellen in CD 45, RB hoch und CD 45 RB niedrig Populationen. Sammeln Sie die Zellen in Röhrchen mit zwei Millilitern vollständigem Medium und führen Sie dann ein Aliquot von etwa 10 mal 10 zu den dritten Zellen aus jeder Fraktion auf dem Zellsortierer durch, um die Probenreinheit zu beurteilen, um die Zellen CD 45 RB high und CD 45 RB low für die Injektion vorzubereiten, waschen und resuspendieren Sie sie in PBS auf die entsprechende Zelldichte, wie im Textprotokoll angegeben. Halten Sie anschließend die Empfängermaus fest und injizieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension intraperitoneal in die rechte und linke Seite des Bauches.

Überwachen Sie die Empfängermäuse wöchentlich auf klinische Parameter, wie im Textprotokoll angegeben. Das Fortschreiten der Erkrankung nach der Injektion ist in der Regel in der fünften Woche offensichtlich. Opfern Sie eine Maus zu einem bestimmten Zeitpunkt oder wenn sie 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren hat, und extrahieren Sie den Dickdarm.

Messen und notieren Sie dann die Länge und das Gewicht des Dickdarms. CD vier positive CD 45 RB High T-Zellen wurden fünf Wochen nach der Injektion auf rag one knockout und NFIL drei RAG one double knockout Empfängermäuse übertragen. Doppel-Knockout-Mäuse hatten 10% ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren, die Dickdarme beider Rag-One-Knockout- und Double-Knockout-Mäuse.

Empfängermäuse waren verdickt und verkürzt im Vergleich zu Dickdarm aus den Kontrollmäusen CD vier positive CD 45 RB hohe T-Zellen für einen Transfer auf rag one knockout und rag one knockout P one 10 delta mutierte Empfängermäuse Die histologische Analyse drei Wochen nach dem Transfer zeigte epitheliale Hyperplasie, infiltrate entzündlicher Zellen und Kryptenabszesse bei rag one knockout delta mutierten Empfängern, aber nicht rag one knockout Mäuse Nach der Beherrschung. Diese Technik kann in vier bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.