Name: Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4 + CD45RB Hoch T-Zellen in immundefizienten Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie die Induktion von Kolitis durch adoptiven Transfer von CD4+ CD45RBhoch T-Zellen in immundefiziente Mäuse. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen chronisch-darmbezogener Entzündungen.

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Diese Arbeit wurde vom amerikanischen Gesellschaft für Gastroenterologie (AGA) Forschung Wissenschaftler-Preis und Crohn und Colitis Foundation of America (CCFA) Career Development Award (den SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) und Universität von North Carolina Center for Gastrointestinal Biology unterstützt und Disease Grants P30 DK34987 (Histologie Core). Der UNC-Durchflusszytometrie Core Facility ist teilweise durch eine NCI-Center Core-Unterstützung Grant (P30CA016086) an den UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center unterstützt. Wir danken Lukas B. Borst von North Carolina State University College of Veterinary Medicine für seine Hilfe bei histopathologischen Analyse und Immunhistochemie.

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Tier Protokolle werden von und in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Vorschriften und der National Research Council Handbuch für die Pflege und Verwendung von Labortieren zugelassen. Spendermäusen kann entweder männlich oder weiblich ist, aber Empfängermäuse sollte männlich. Wenn weibliche Empfänger zu verwenden sind, müssen die Spendermäuse female 5 sein. Pflegen Kolonien regelmäßig, unsteril Betten und nicht angesäuerten Wasser mit, da diese die Darmflora auswirken, und damit die Colitis Phänotyp der Mäuse 5,6. 1. Versuchsvorbereitung <ol><li> Verwenden eiskalte Medien und Puffer. Halten Zellen auf Eis während des Experimentes. </li><li> Führen Sie das Experiment in sterile Biohazard Haube mit steriler Technik. </li></ol> 2. Isolierung von Milz-T-Zellen <ol><li> Einschläfern Spendermaus / Mäuse in CO 2 Kammer durch zervikale Dislocatio gefolgtn. Spray Abdomen mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie einen horizontalen Schnitt im Bauch und abziehen Haut Bauchfell aus. Halten Bauchfell entfernt von der inneren Organe mit der Zange und einen Einschnitt in der linken Bauchfell zu entlarven und die Milz herausschneiden. </li><li> Legen Sie die Milz in 10 ml Komplett Medien in einer Petrischale. Entfernen und entsorgen Sie überschüssiges Gewebe von Milz. </li><li> Verwenden Sie 2 sterilisiert Glasobjektträger zu zerkleinern und necken neben der Milz in Einzelzellsuspension. Filterzellensuspension durch ein 70 um Sieb in einem 50 ml konischen Röhrchen und spülen Sieb mit 5 ml Vollmedium. Platzieren Sie bis zu 5 Milz in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder durch Vakuumsauger in Abfallbehälter geben. </li><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen in 5 ml pro Milz Lysispuffer an Erythrozyten für 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Gleiches Volumen Vollmedium (5 ml pro Milz) zu dem Rohr. </li><li&gt; Centrifuge Zellen bei 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder durch Vakuumsauger in Abfallbehälter geben. </li><li> Vorsichtig in 10 ml Labeling Buffer resuspendieren Zellen. </li><li> Zählen von Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. <ol><li> Entfernen Sie 20 ul Zellsuspension und fügen Sie 180 ul Trypanblau auf ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und gut mischen. Nach 5 Minuten, fügen Sie 10 ul markierte Zellen zu Hämozytometer und zählen nicht-blauen Zellen unter dem Mikroskop. Ermittlung der Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen. Entsorgen Sie Zell / Trypanblau-Mix. </li></ol></li><li> Zentrifuge Zellen in 10 ml Markierungspuffer bei 450 × g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder durch Vakuumsauger in Abfallbehälter geben. </li></ol> 3. Anreicherung von CD4 + T-Zellen Hinweis: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für bestimmte Produkte in diesem Abschnitt verwendet. <ol><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen zu einer Einzelzell-Suspension von 20 x 10 6 Zellen / ml in kaltem Etikettening Buffer. </li><li> Mit 5 &amp; mgr; l pro 1 × 10 6 Zellen von biotinyliertem CD4 T-Zell-Anreicherung Antikörper. Inkubieren Zellen auf Eis für 15 min. </li><li> Fügen 10x Volumen Labeling Buffer. Zentrifuge Zellen bei 450 · g für 7 min. Sorgfältig absaugen all des Überstandes mit Vakuumsauger in Abfallbehälter geben. </li><li> Gründlich vortexen Streptavidin-konjugierten magnetischen Partikeln. Mit 5 ul der Teilchen pro 1 x 10 6 Zellen. </li><li> Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig. Halten Gemisch bei 6-12 ° C für 30 min. </li><li> Hinzufügen Markierungspuffer auf eine Konzentration von 20-80 x 10 6 Zellen / ml. Übertragung von bis zu 1,0 ml pro 12 x 75 mm Rund Reagenzglas markierten Zellen (als &quot;positive-Bruch Rohr&quot; bezeichnet). </li><li> Platzieren Sie jede positive Fraktion Rohr auf Magneten für 6-8 min. </li><li> Mit den positiven Fraktion Rohre noch auf den Magneten, Überstand vorsichtig Transfer vom positiven Bruchrohr mit Glas Pasteur-Pipette in ein neues steriles 50 ml konischen Röhrchen (referred als &quot;angereicherte Fraktion&quot;). Diese angereicherte Fraktion enthält CD4 + T-Zellen. Achten Sie darauf, um die markierten Zellen mit dem Magneten angezogen zu stören. </li><li> Die Zellen in der positiven Fraktion Rohre in dem gleichen Volumen des Markierungspuffer durch Auf- und Abpipettieren kräftig nach links, wie in Schritt 3.6. Zeigen positive Fraktion Rohr wieder auf Magneten für 6-8 min. </li><li> Mit positiven Bruchrohre noch auf den Magneten, sorgfältig überStand (angereicherte Fraktion, CD4 +) von positiv-Bruchrohr mit Glaspasteurpipette auf 50 ml ohne Unterbrechung Zellen Magneten befestigt sterile konische Röhrchen aus Schritt 3.8. </li><li> Die Schritte 3,9-3,10 um die Ausbeute an CD4 + T-Zellen erhalten erhöhen. Weiter Protokoll mit angereicherten Fraktion (CD4 + Zellen). </li></ol> 4. Beschriften und Sortieren von Zellen 7 <ol><li> Zentrifuge angereicherten Zellen bei 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Abgießen oder Vakuum SUCTIonen in die Abfallbehälter. </li><li> Zellen in 1 ml Markierungspuffer. Entfernen Aliquot von Zellen zu zählen und um die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss, wie in Schritt 2.9 zu beurteilen. </li><li> Hinzufügen eines Volumens von Markierungspuffer bis 10 x 10 6 Zellen / ml; Wenn Zellen bereits &lt;10 x 10 6, Zentrifuge bei 450 · g für 7 min, verwerfen Stand durch Abgießen oder Vakuumansaugung in den Abfallbehälter und fügen Volumen Markierungspuffer bis 10 x 10 6 Zellen / ml. <ol><li> Getrennte Teilmengen von etwa 5-10 x 10 5 Zellen je Set für ungefärbte, Isotyp-gefärbt und einzelne befleckten Kontrollzellen in Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol></li><li> Mit 5 &amp; mgr; g / ml CD4-FITC und 1 ug / ml CD45RB-PE an Zellen. Hinzufügen Isotypkontrolle Flecken und einzelne Flecken in der gleichen Konzentration zu Aliquots in Mikrozentrifugenröhrchen eignen. Gut mischen, aber sanft und Inkubation auf Eis vor Licht für 30 Minuten geschützt. </li><li> Fügen 10x Volumen Labeling Buffer, um Zellen und Steuers. Zentrifuge 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Vakuumansaugung in Abfallbehälter geben. </li><li> Resuspendieren in Markierungspuffer zu Volumen in Schritt 4.5. Zentrifuge 450 g für 7 min. Überstand verwerfen durch Vakuumansaugung in Abfallbehälter geben. </li><li> Resuspendieren in Markierungspuffer auf 10 x 10 6 Zellen / ml. Pass Zellen durch 70 &amp; mgr; m Sieb in FACS-Röhrchen. Halten Sie auf dem Eis vor Licht geschützt, bis sie zur FACS. </li><li> Einzurichten und zu bestimmen, eine angemessene Entschädigung für die Zellsortierer mit ungefärbten Zellen und Single-gefärbten Kontrollen. </li><li> Ausschließen nonviable Zellen mit Vorwärts- und Seitenstreuung Gating (1A). Up Gating für CD4 + und CD45RB + -Zellen mit Isotyp-gefärbten Bedienelemente ein. Gate-Zellen auf CD4 + -Population. </li><li> Sortieren CD4 + Zellen in CD45RB hoch und niedrig CD45RB Populationen mit einem einfachen Histogramm für PE-gefärbten Zellen in Röhrchen mit 2 ml Komplett Medien. Die CD45RB hoch </sup&gt; Bevölkerung stellt die höchsten 40% der CD4 + CD45RB + -Zellen (CD45RB hoch), und die CD45RB niedrig Bevölkerung ist die untersten 20% der CD4 + CD45RB + -Zellen (CD45RB niedrig; 1B). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Abbildung 1: Repräsentative Durchflusszytometrie Plots von CD4 + CD45RB T-Zell-Populationen während der FACS-Analyse (A - C) FITC CD4- und PE CD45RB-gefärbten Splenozyten aus Spender C57BL / 6-Mäuse wurden durch FACS sortiert in CD4 + CD45RB hoch und CD4 +. CD45RB geringe T-Zell-Populationen. (A) Doublet Ereignisse auf der vorderen Streudiagramm ausgeschlossen. (B) Lymphozyten wurden in Vorwärts- und Seitenstreudiagramm gated. (C) CD4 + </sup&gt; T-Zellen wurden gated, und (D) CD4 + CD45RB + T-Zellen wurden auf einer PE gegen Events Histogramm aufgetragen. CD4 + CD45RB niedrigen Zellen wurden als die niedrigste 20% der CD45RB + Zellen sein. CD4 + CD45RB hoch Zellen wurden als die höchste 40% CD45RB + -Zellen bestimmt. <ol start="11"><li> Führen Sie ein Aliquot jeder Zellpopulation auf dem FACS-Maschine, um die Reinheit der Bevölkerung zu bewerten. </li><li> Zentrifuge sortierten Zellen bei 450 g für 7 min. Resuspendieren in 1 ml PBS. Entfernen Aliquot von Zellen zu zählen und um die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss, wie in Schritt 2.9 zu beurteilen. </li></ol> 5. Die Injektion von Zellen in Empfänger <ol><li> Resuspendieren sortierten Zellen auf 4 x 10 6 Zellen / ml (CD45RB hoch) oder 2 x 10 6 Zellen / ml (CD45RB niedrig) in PBS. </li><li> Übertragen Sie 100 ul von CD45RB hoch Zellen pro Empfänger zu neuen sterilen Röhrchen. Geben Sie 100 ul PBS proEmpfänger dieser Röhre. So ist die Gesamtinjektionsmenge pro Tier 200 ul und Gesamtbetrag der Zellen pro Empfänger 4 x 10 5 CD4 + CD45RB hoch naiven T-Zellen. </li><li> Wenn Versuchsgruppe, die regulatorischen T-Zellen erwünscht ist, dann 100 ul der CD45RB hoch Zellen pro Empfänger zu neuen sterilen Röhrchen. 100 l CD45RB niedrigen Zellen pro Empfänger auf die gleiche Röhre. Gesamtinjektionsmenge pro Tier ist 200 ul; Verhältnis von CD45RB hoch: CD45RB niedrigen Zellen ist 2: 1. </li><li> Injizieren Sie 100 ul von CD45RB hoch oder CD45RB hoch / niedrig CD45RB CD4 + Zellen intraperitoneal in der rechten und linken Seite des Bauches (insgesamt 200 ul) jedes Empfängers. </li></ol> 6. Überwachung der Krankheitsprogression in Empfängertiere <ol><li> Um den klinischen Zustand der Empfängertiere zu bewerten, weisen Gesamt klinischen Scores für das folgende parameters 8 am Tag der Injektion, danach wöchentlich und bei der Opferung: <ol><li> Bestimmen Sie verschwenden durch Messung Gewichtsverlust: 0 - keine Gewichtsabnahme; 1 - 0,1 bis 10% Verlust der ursprünglichen Körpergewichts; 2 - mehr als 10% Verlust der ursprünglichen Körpergewichts (Abbildung 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Abbildung 2: Klinische und pathologische Anzeichen einer Entzündung nach der Übertragung von Wildtyp-CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in Rag1 auftreten - / - und NRDKO Empfängermäuse 11 (A) NRDKO Empfänger verloren im Durchschnitt 10% ihres ursprünglichen Körpergewicht um 5. Wochen nach der Übertragung, während Rag1- / - Empfänger nicht klinischen Anzeichen einer Krankheit aufweisen, zu diesem Zeitpunkt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert Prozentsatz der anfänglichen Körpergewicht für die Kohorte ± SEM. ** P &lt;0.005. (B) Einige Mäuse entwickelten eine schwere Darmentzündung, wie durch die Anwesenheit von Rektumprolaps demonstriert. Dies ist ein repräsentatives Bild der Darmvorfall in einem NRDKO Empfängermaus. (C) Stark, Doppelpunkte sowohl Rag1 - / - und NRDKO Empfängermäuse sind verdickt und verkürzt im Vergleich zu Doppelpunkte von Rag1 - / - und NRDKO Mäuse ohne T-Zell-adoptiven Transfer. Colons von NRDKO Empfängermäuse zeigen schwere Entzündung und erhöhte Dickgewichte (Daten nicht gezeigt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Bestimmen Sie die Qualität des Stuhls, indem Tier in sauberen Behälter, bis sie durchlaufen hatHocker: 0 - keine; 1 - weicher Stuhl; 2 - tränende und / oder Blut im Stuhl. </li><li> Bestimmen Sie die allgemeine Gesundheit des Tieres durch die Anwesenheit der folgenden Anzeichen einer Krankheit: 0 - keine gekrümmte Haltung, Borsten Fell oder Hautläsionen; 1 - einem der folgenden vorhanden: gekrümmte Haltung, Borsten Fell oder Hautveränderungen. </li><li> Bestimmen Vorhandensein Rektumprolaps: 0 - nicht vorhanden; 1 - vorhanden ist (2B). </li></ol></li><li> Opfern Tiere durch CO 2 Inhalation gefolgt durch Genickbruch, wenn sie 20% ihres Ausgangskörpergewicht verloren gehen oder in gewünschten Zeitpunkt, je nachdem was zuerst eintritt. Klinischen Erkrankung ist in der Regel erkennbar ab Woche 5 post Fülle. </li><li> Beurteilen der Schwere der Erkrankung, wie oben beschrieben 5,7. <ol><li> Vergeben klinischen Scores, wie in Schritt 6.1 8. </li><li> Messen Kolon Länge und das Gewicht (2C). </li><li> Führen Sie die histologische Analyse der Entzündung5. </li><li> Bestimmen spontane Zytokinexpression in Darmgewebe Explantatkulturen 9, Mesenteriallymphknoten 10 und / oder Serum 11. <ol><li> Kurz gesagt, für Explantatkulturen 9, entfernen Sie Doppelpunkte nach der Tötung offenen Längsrichtung, und sauber mit PBS. Doppelpunkte Inkubieren auf einem Orbitalschüttler bei 250 Upm in vollständige Medien für 30 Minuten bei Raumtemperatur eingestellt. </li><li> Hacken Sie Gewebe in kleine Stücke und bei 37 ° C in vollständige Medien für 24 Stunden inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit und verwenden Sie für die Quantifizierung von Zytokinen auf 100 mg Gewebe mittels ELISA. </li></ol></li><li> Führen ex vivo Charakterisierung der T-Zell-Phänotypen und / oder Funktion 10. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Induzieren Kolonentzündung in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + CD45RB + T-Zellen in immundefizienten Mäusen. Wir verwendeten C57BL / 6 Spender Milz und syngenen Rag1 - / - Empfängermäuse, obwohl auch andere Stämme (zB BALB / c, 129S6 / SvEv, nicht-übergewichtigen diabetischen (NOD)) und genetische Modelle der Immunschwäche (zB SCID, Rag2 - / -), können ebenfalls verwendet werde...

Die entzündlichen Darmerkrankungen (CED) Morbus Crohn und Colitis ulcerosa resultieren aus einem unvollständig definierten und komplexen Zusammenspiel zwischen Immunantworten des Wirts, genetischer Anfälligkeit, Umweltfaktoren und dem enterischen luminalen Gehalt1. Jüngste genomweite Assoziationsstudien berichten über Assoziationen zwischen regulatorischen Genen von Immunzellen und IBD-Anfälligkeit2,3. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunzell-intrinsische Gene sind in diesen Studien vertreten, was auf eine zentrale Rolle dieser Zellpopulationen in der IBD-Pathogenese hinweist.
Es existieren derzeit mehr als 50 Tiermodelle für menschliche CED. Obwohl es kein Modell gibt, das die menschliche CED perfekt phänografisch kopiert, sind viele nützlich, um verschiedene Aspekte menschlicher Krankheiten zu untersuchen, einschließlich des Beginns und Fortschreitens der Krankheit und der Wundheilungsreaktion. Bei der hier beschriebenen Methode wird die Darmentzündung mit syngenem milzhaftem CD4+CD45RB-High-T-Zell-Adoptive-Transfer in T- und B-Zell-defiziente Empfängermäuse initiiert4. Die CD4+CD45RB-Populationmit hohem T-Gehalt enthält hauptsächlich naive T-Zellen, die für die Aktivierung vorbereitet sind und in der Lage sind, chronische Dünndarm- und Dickdarmentzündungen zu induzieren. Diese Methode ermöglicht es dem Forscher, wichtige experimentelle Variablen, einschließlich angeborener und adaptiver Immunzellpopulationen, zu modifizieren, um biologisch relevante Fragen zur Pathogenese der Krankheit zu beantworten. Darüber hinaus bietet diese Methode eine präzise Initiierung des Krankheitsausbruchs und einen gut charakterisierten experimentellen Zeitverlauf. Dies ermöglicht die kinetische Untersuchung klinischer Merkmale des Krankheitsverlaufs bei Mäusen. Die durch diese Methode induzierte Darmentzündung hat viele Gemeinsamkeiten mit der menschlichen IBD, darunter chronische transmurale Entzündung des Dick- und Dünndarms, Pathogenese, die durch Zytokine wie TNF und IL-12 gesteuert wird, und systemische Symptome wie Auszehrung5. Somit ist es ein ideales Modellsystem für die Untersuchung der Pathogenese der humanen CED.
Die Methode hier beschreibt detailliert das Protokoll zur Induktion von experimenteller Kolitis durch adoptiven Transfer von CD4+CD45RBHigh T Zellen in Rag1-/- Mäuse. Wir besprechen die wichtigsten technischen Schritte, die erwarteten Ergebnisse, die Optimierung und die Fehlerbehebung. Wir befassen uns mit den Elementen, die für die erfolgreiche Entwicklung dieses murinen Modells der Darmentzündung zu Forschungszwecken erforderlich sind.

<table><tbody><tr><td>Name des Reagenzes/ Ausrüstung</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisch</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisch</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956; m Zellsieb</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Complete Medium</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 1% Stift/Streptometer, 10 % FBS, 0,0004 % &beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS Röhrchen + Sieb</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Glasmikroskop-Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Markierungspuffer</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td></td><td></td><td>0,08 % NH4Cl, 0,1 % KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus CD4 T Lymphozytenanreicherungsset - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Reines Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Waschmittel</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640, 1 % Stift/Strepto, 0,0004 % &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

die induktion von murine darmentzündungen durch adoptiven transfer von effektor cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; hoch</sup&gt; t-zellen in immundefizienten mäusen

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Es gibt viele verschiedene Tiermodelle zum Untersuchen der Pathogenese von menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile vorhanden. Wir beschreiben hier eine experimentelle Colitis-Modell, das durch adoptiven Transfer von syngenen Milz CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in T-und B-Zell-defizienten Mäusen Empfänger eingeleitet wird. Die CD4 + CD45RB hoch T-Zellpopulation, die größtenteils aus naiven Effektorzellen induzieren kann chronische Darmentzündung, sehr ähnlich wichtige Aspekte der menschlichen IBD. Dieses Verfahren kann manipuliert werden, um Aspekte der Krankheit Beginn und Fortschreiten zu untersuchen. Zusätzlich kann es für die Funktion der angeborenen, adaptive und regulatorische Immunzellpopulationen, und die Rolle von Umweltfaktoren, das heißt, die Mikroflora im Darmentzündung zu untersuchen. In diesem Artikel erläutern wir die Methode zur Induzierung ulcerosa mit einer Schritt-für-Schritt-Protokoll. Diese includes eine Video-Demonstration der wichtigsten technischen Aspekte erforderlich, um diese Mausmodell der experimentellen Kolitis zu Forschungszwecken erfolgreich zu entwickeln.

Ca. 10 x 10 6 CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen aus 10 Milz von erwachsenen C57BL / 6 Spendermäusen sind zuverlässig isoliert. Diese Anzahl wird in Abhängigkeit von dem Alter und dem Stamm des Spendermaus und dem Können des Forschers variiert. Beim 4 x 10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB hoch -T-Zellen in C57BL / 6 Rag1 übertragen - / - Empfängermäuse, klinischen Anzeichen einer Krankheit entstehen rund 5 Wochen nach der Sättigung oder früher, wenn ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine intestinale Entzündung durch die adoptive Übertragung von naiven T-Zellen in immundefiziente Mäuse zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen aus Maussplenizen isoliert, die Blutzellen lysiert und anschließend die Population für CD4-positive T-Zellen angereichert wird. Der zweite Schritt besteht darin, diese Zellen mit fluoreszierenden DI-konjugierten CD4- und CD45RB-Antikörpern zu markieren.Anschließend werden die markierten Zellen mittels FACS in CD 45 RB niedrige und CD 45 RB hohe Populationen sortiert. Im letzten Schritt werden die CD 45 RB hohen Zellen durch intraperitoneale Injektion in immundefiziente Mäuse übertragen. Letztlich aktivieren sich die übertragenen Zellen und verursachen in Abwesenheit von T-regulatorischen Zellen eine lokale Gewebeschädigung, die zu einer experimentellen Kolitis führt.Mit dieser Methode können zentrale Fragen in der Erforschung entzündlicher Darmerkrankungen beantwortet werden, beispielsweise zur Rolle spezifischer Zellpopulationen und der Mikrobiota des Gastrointestinaltrakts bei der Krankheitsentstehung. Nach der Tötung der Spendermaus die Bauchgegend mit 70 %igem Ethanol besprühen, um die Fläche zu sterilisieren. Anschließend einen horizontalen Schnitt durch die Bauchdecke führen und die Haut mit einer Pinzette nach hinten klappen, um das Peritoneum freizulegen.Halten Sie das Peritoneum von den inneren Organen weg und führen Sie einen Schnitt in das linke abdominale Peritoneum durch. Entfernen Sie danach die Milz von der Maus und legen Sie sie in eine Petrischale, die 10 Milliliter eiskaltes, komplettes Medium enthält. Zerdrücken Sie die Milz mit zwei sterilen Objektträgern, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen.Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Konischglas und spülen Sie das Sieb anschließend mit fünf Millilitern vollständigem Medium aus. Bis zu fünf Milzen in einem Konischglas sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellen danach sieben Minuten bei vier Grad Celsius mit 450 ×g. Aspirieren Sie den Überstand in einen Abfallbehälter und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 10 Milliliter eiskaltem Markierungspuffer.Vermischen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension mit 180 Mikroliter einer 0,4 %igen Trypanblau-Lösung und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der nicht blau gefärbten Zellen unter dem Mikroskop, um die Anreicherungspellets zu beginnen, und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in eiskaltem Markierungspuffer bei einer Konzentration von 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Fügen Sie fünf Mikroliter biotinyliertes CD4-T-Zellen-Anreicherungs-Antikörper pro 1 × 10⁶ Zellen hinzu und inkubieren Sie die Zellen anschließend 15 Minuten lang auf Eis mit dem Antikörper.Gegeben Sie das 10-fache Volumen Puffer für die Markierung zur Zellsuspension hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend sieben Minuten lang mit 450 × g. Aspirieren Sie vorsichtig den Überstand, ohne den Zellenpellet zu stören. Schütteln Sie danach die mit Streptavidin konjugierten magnetischen Partikel durch Vortexen erneut auf und geben Sie fünf µL Partikel pro 1 × 10⁶ Zellen zu den Zellen hinzu.Mischen Sie die Partikel mit den Zellen, indem Sie das Gefäß vorsichtig anstupsen, und inkubieren Sie das Gemisch dann bei sechs bis 12 Grad Celsius für 30 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 20 bis 80 mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter mit Markierungspuffer. Überführen Sie danach ein Milliliter markierter Zellen in ein rundbodiges Reagenzglas mit 12 Millimeter Durchmesser und 75 Millimeter Länge und stellen Sie dieses Reagenzglas mit der positiven Fraktion sechs bis acht Minuten lang auf einen Magneten.Platzieren Sie das Röhrchen auf dem Magneten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Glas-Pasteur-Pipette, ohne die markierten Zellen zu stören. Überführen Sie den Überstand in ein neues steriles 50-Milliliter-Konischglas. Dieser Anteil enthält die CD4-positiven T-Zellen. Nehmen Sie das Röhrchen mit dem positiven Anteil vom Magneten und resuspendieren Sie die Zellen durch kräftiges Auf- und Abpipettieren in Markierungspuffer.Stellen Sie das Gefäß erneut für sechs bis acht Minuten auf den Magneten. Übertragen Sie anschließend vorsichtig das SUP nain in das Gefäß mit der angereicherten Fraktion. Erhöhen Sie die Ausbeute an CD4-positiven T-Zellen, indem Sie die Anreicherung nach Bedarf wiederholen, um die Zellen für die Markierung vorzubereiten. Zentrifugieren Sie zunächst die angereicherte Fraktion bei 450 ×g für sieben Minuten und entfernen Sie das Überstand. Suspenderen Sie die Zellen anschließend in Markierungspuffer auf eine Konzentration von 10 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Aliquotieren Sie 5 × 10⁵ Zellen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen für nichtgefärbte, isotypgefärbte und einfachgefärbte Kontrollzellen. Geben Sie dann 5 µg/mL CD4-FE- und 1 µg/mL CD45RB-PE-Antikörper in das Röhrchen mit der ursprünglichen Zellsuspension.Fügen Sie die Isotop-Kontrollfarbstoffe und die Einzelfarbstoffe in der gleichen Konzentration den entsprechenden Zellaliquoteen hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit den Antikörpern und inkubieren Sie die Röhrchen anschließend 30 Minuten auf Eis. Decken Sie die Röhrchen ab, um sie vor Licht zu schützen.Als Nächstes waschen Sie die Zellen zweimal in Markierungspuffer, wie im Textprotokoll beschrieben, und resuspendieren die Zellen in Markierungspuffer bei 10 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Danach leiten Sie die Zellsuspension durch einen 70-Mikron-Filter in ein FACS-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis und decken Sie es ab, um eine photochemische Zerstörung der Farbstoffe zu verhindern.Verwenden Sie die unbehandelten Einzelzellen-Kontrollen, um die Kompensation am Zellsorter zu kalibrieren. Schließen Sie nicht lebensfähige Zellen durch Vorder- und Seitwärtsstreuungstorung aus. Anschließend legen Sie die Tore für CD4-positive und CD4-RB-positive Zellen anhand der isotypisch gefärbten Kontrollen fest.Nächstes Gatter: die CD4-positive Population, anschließend Sortierung der Zellen in CD45, RB hoch und CD45, RB niedrig Populationen. Sammeln Sie die Zellen in Röhrchen, die zwei Milliliter komplettes Medium enthalten, und analysieren Sie danach einen Aliquot von etwa 10 × 10³ Zellen jeder Fraktion im Zellsortierer, um die Probentreinheit zu bestimmen. Zum Vorbereiten der CD45, RB hoch und CD45, RB niedrig Zellen für die Injektion waschen und resuspendieren Sie diese in PBS auf die im Textprotokoll angegebene Zelldichte. Danach fixieren Sie die Empfängermaus fest und injizieren 100 Mikroliter der Zellsuspension intraperitoneal in die rechte und linke Bauchseite.Überwachen Sie die Empfänger-Mäuse wöchentlich hinsichtlich der in der Textanleitung angegebenen klinischen Parameter. Der Krankheitsverlauf nach der Injektion zeigt sich typischerweise in der fünften Woche. Töten Sie eine Maus zu einem vorbestimmten Zeitpunkt oder, wenn sie 20 % ihres Ausgangskörpergewichts verloren hat, und entnehmen Sie den Kolon.Danach die Länge und das Gewicht des Kolons messen und dokumentieren. CD vier positive CD 45 RB hohe T-Zellen wurden fünf Wochen nach der Injektion in rag eins Knockout- und NFIL drei RAG eins Doppelknockout-Empfängermäuse übertragen. Die Doppelknockout-Mäuse hatten 10 % ihres anfänglichen Körpergewichts verloren, ebenso die Kolons sowohl der rag eins Knockout- als auch der Doppelknockout-Mäuse.Die Kolonien der Empfänger-Mäuse waren im Vergleich zu denen der Kontroll-Mäuse verdickt und verkürzt, die CD4-positive CD45RBhigh T-Zellen für eine Übertragung auf Rag1-Knockout- und Rag1-Knockout P110δ-Mutant-Empfänger-Mäuse erhielten. Die histologische Analyse drei Wochen nach der Übertragung zeigte epitheliale Hyperplasie, infiltrierende entzündliche Zellen und Krypta-Abszesse bei Rag1-Knockout-δ-Mutant-Empfängern, jedoch nicht bei Rag1-Knockout-Mäusen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in vier bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

induction-murine-intestinal-inflammation-adoptive-transfer-effector

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Dieses Video zeigt die Induktion der Darmtransplantat-gegen-Wirt-Krankheit, GvHD, bei einer tödlich bestrahlten Empfängermaus unter Verwendung von allogenen hämatopoetischen Stammzellen und GvHD-induzierenden Milz-alloreaktiven T-Lymphozyten. Dieses Protokoll hilft bei der Etablierung eines schweren akuten intestinalen GvHD-Modells, um den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und innovative Therapieoptionen zu entwickeln.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit in Mausmodellen durch allogene Knochenmark- und Milzzelltransplantation

Wir bieten eine reproduzierbare Methode, um Typ-1-Diabetes (T1D) bei Mäusen innerhalb von zwei Wochen zu induzieren durch den adoptiven Transfer von Insel-Antigen-spezifischen, primären CD4 + T-Zellen.

Accelerated Typ 1 Diabetes Induktion in Mäusen durch adoptiven Transfer von CD4 + T diabetogene Cells

In diesem Antigen-getriebenen Colitis-Modell wurden OT-II CD4+ T-Zellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren, adoptiv in RAG-/- Mäuse übertragen, die ein grün fluoreszierendes Protein in mononukleären Phagozyten (MPs) exprimieren. Die Wirte wurden mit Escherichia coli (E.coli) konfrontiert, die das Ovalbuminprotein (OVA) exprimierten, das mit einem cyanfluoreszierenden Protein (CFP) fusioniert war.

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Das Zusammenspiel von genetischer Anfälligkeit, Schleimhautimmunität und mikroökologischem Darmmilieu ist an der Pathogenese entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) beteiligt. In dieser Studie wandten wir die fäkale Mikrobiota-Transplantation bei IL-10-defizienten Mäusen an und untersuchten ihre Auswirkungen auf Dickdarmentzündungen und Herzfunktion.

Therapeutische Bewertung der fäkalen Mikrobiota-Transplantation in einem Interleukin-10-defizienten Mausmodell

Die Studie zeigt die Rolle der Haut bei der Modulation der Immunantwort bei Mäusen durch epikutane (EC) Immunisierung. Die EC-Immunisierung mit einem Proteinantigen kann in Kombination mit erregerassoziierten molekularen Mustern Immunantworten bei Kontaktüberempfindlichkeit unterdrücken oder die hautinduzierte Suppression rückgängig machen. Die EC-Immunisierung ist vielversprechend und bietet einen wirksamen, nadelfreien Ansatz für die Immuntherapie.

Mausmodell der epikutan induzierten Immunmodulation

Hier berichten wir über ein Protokoll, das ein Mausmodell für rheumatoide Arthritis (RA) durch adoptiven Transfer von CD4+ T-Zellen von SKG-Mäusen etabliert und ein schnelles und zuverlässiges experimentelles Werkzeug zur Untersuchung der immunologischen Mechanismen, des pathologischen Fortschreitens und der Entwicklung neuer Therapien für RA bietet.

Ein adoptives Transfermodell der rheumatoiden Arthritis bei Mäusen

Lernen Sie die Induktion von Kolitis durch adoptiven Transfer von CD4+ CD45RBhoch T-Zellen in immundefiziente Mäuse. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen chronisch-darmbezogener Entzündungen.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4 + CD45RB Hoch T-Zellen in immundefizienten Mäusen (Video) | JoVE Journal

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4

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