Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dendritische Zellen oder dcs und Makrophagen der Maus für die phänotypische und funktionelle Charakterisierung schnell zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Darmgewebe entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Darmepithel vom Lamin propria zu trennen.

Als nächstes wird das intestinale Lamin Propria in den letzten Schritten des Eingriffs verdaut. Die Lamin propria-Zellen werden mit Fluoreszenz und konjugierten Antikörpern gefärbt und für bestimmte Zellpopulationen gesperrt. Letztendlich können intestinale DC- und Makrophagenpopulationen für funktionelle Studien zur Beurteilung der Zytokinproduktion, der Antigenpräsentation und der Regulation von Immunzellen genauer charakterisiert und gereinigt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht also darin, dass die Schnelligkeit des Gewebeverdaus eine optimale Expression von Antigenen auf der Zelloberfläche, die Lebensfähigkeit der Zellen und/oder die Zelluläre gewährleistet. Nachdem Sie die Maus eingeschläfert und den Tod durch den Zehenkneifreflex bestätigt haben, sprühen Sie testweise 70% Ethanol auf den Bauch und den Thorax des Tieres. Machen Sie dann mit einer Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches und schälen Sie die Haut zurück, um das Bauchfell freizulegen.

Öffnen Sie das Bauchfell mit einer Schere, nachdem Sie am Pilo-Schließmuskel geschnitten haben, um den Magen vom oberen Dünndarm zu trennen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das Mesenterium wegzukitzeln. Erneut an der Ileozökalklappe schneiden, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu befreien. Reißen Sie das Mesenterium vom Dickdarm weiter auseinander und machen Sie einen Schnitt am Analrand.

Schneiden Sie den Dickdarm mit einer Schere in Längsrichtung auf und waschen Sie mit Raumtemperatur C-M-F-P-B-S den Stuhlinhalt und den Schleim aus dem Darmlumen. Verwenden Sie dann die Schere und Pinzette zu makroskopisch. Präparieren Sie die Scheiterhaufenflecken entlang der antimesenterialen Oberfläche des Dünndarms und schneiden Sie den Dünndarm in Längsrichtung auf.

Reinigen Sie anschließend das Dünndarmlumen von Stuhlinhalt und Schleim mit mehr Raumtemperatur C-M-F-P-B-S. Schneiden Sie getrennt voneinander den Dünn- und Dickdarm in etwa 1,5 Zentimeter große Stücke und legen Sie die Stücke in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen, die 30 Milliliter Vorkriegs-C-M-F-H-B-S-S mit FBS und zwei millimolare EDTA enthalten. Legen Sie jedes konische 50-Milliliter-Röhrchen horizontal in einen Orbitalschüttler und schütteln Sie die Röhrchen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei 250 U/min.

Legen Sie dann ein einzelnes Drahtsieb über einen Abfalleimer. Gießen Sie den Inhalt jedes konischen 50-Milliliter-Röhrchens durch das Netz, um die Darmstücke zu gewinnen, und legen Sie sie dann in neue einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern C-M-F-H-B-S-S mit FBS mit zwei Millimolaren EDTA vor. Zum Schluss legen Sie die Röhrchen für weitere 20 Minuten wieder in den Orbitalschüttler.

Gießen Sie nach der zweiten Runde des Schüttelns den Inhalt jedes Röhrchens durch das Sieb. Tupfen Sie das überschüssige Medium wieder mit einem Papiertuch ab und geben Sie dann die Darmstücke in ein kleines Plastikmolkeschiffchen. Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist die Gewebeverdauung Um den Erfolg zu gewährleisten, müssen alle verschiedenen Parameter der Verdauungsdauer, die Eigenschaften der Kollagenase, die Integrität des Gewebes und die Größe des zu verdauenden Gewebes berücksichtigt werden.

Hacken Sie die Darmstücke und geben Sie dann den gehackten Darm in ein 50 Millimeter großes konisches Röhrchen mit 20 Millilitern Kollagenaselösung. Legen Sie das konische Röhrchen horizontal in den Orbitalschüttler und verdauen Sie die Darmstücke bei 200 U/min für 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wirbeln Sie nun das Röhrchen kurz ein, um eine gründliche Dissoziation des verbleibenden Darmgewebes zu gewährleisten, und filtrieren Sie dann den Zellschlamm durch ein 100-Mikron-Zellsieb direkt in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Zum Schluss füllen Sie das konische Röhrchen mit C-M-F-H-B-S-S mit FBS auf und zentrifugieren die Zelllösung zweimal für fünf Minuten bei 425 mal G bei vier Grad Celsius. Gießen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem C-M-F-H-B-S-S mit FBS und legen Sie die Proben auf Eis. Nach dem Färben der Zellen für die interessierenden Oberflächenproteine.

Beginnen Sie mit der Erstellung eines Punktdiagramms, das die Zellen ausschließt, die positiv für die Färbung toter Zellen sind, wie hier gezeigt. Schließen Sie als Nächstes Doublet-Ereignisse aus, wie hier und hier gezeigt. Verwenden Sie nun die vorderen und seitlichen Streukanäle, um die interessierenden Zellen zu gaten, und stellen Sie sicher, dass kein Schmutz vorhanden ist.

Erstellen Sie dann ein weiteres Dotplot-Gating für das CD 45-positive und das IAB-positive Antigen. Durch die Darstellung von Zellen in einem separaten Punktdiagramm werden Bereiche zur Unterscheidung bestimmter DC- und Makrophagen-Untergruppen erstellt. Die hier gezeigte Region R one fängt die CD 11 C positiven CD 11 B dumpf negativen Zellen ein.

Die Region R zwei beschreibt die Zellen, die ein ähnliches Maß an Oberflächenexpression für CD 11 C aufweisen wie die Zellen in der Region R eins, die aber auch CD 11 B exprimieren.Die drei Regionen R bezeichnen die Zellen, die CD 11, B positiv und CD 11 C dumpf negativ sind. Diese drei Regionen können weiter auf die Expression von F four 80 und CD 1 0 3 analysiert werden, um Makrophagen- bzw. DC-Populationen zu unterscheiden. Wie in diesem Punktdiagramm zu sehen ist, exprimieren die CD 11 C positiven CD 11 B dumpf negativen Zellen in der Region R eins hohe Spiegel von alpha ein CD 1 0 3 und niedrige Spiegel von F vier 80.

Dieses Punktdiagramm zeigt, dass CD 11 B-positive CD 11 C-positive Zellen in der R-2-Region sowohl aus DCS als auch aus Makrophagen bestehen, basierend auf ihrer dichotomen Expression von CD 1, 0, 3 und F vier 80. Ausgehend von ihrem F vier 80 positiven und CD 1 0 3 negativen phänotypischen Profil R drei bestehen die gesperrten CD 11 B positiven CD 11 C del negativen Zellen aus Makrophagen, die Beziehung zwischen der Dauer der Gewebeverdauung auf die Gesamtzellausbeute und der Expression von CD 11 B und CD 11 C wird in den folgenden sechs Abbildungen veranschaulicht. Darmgewebe, das drei Minuten lang verdaut wird, ergibt eine geringe Gesamtzellzahl, was dazu führt, dass nur wenige dcs und Makrophagen für die Charakterisierung zur Verfügung stehen. Die Verdauung des Gewebes für 11 Minuten führt zu einer robusten Ausbeute an lebenden Zellen, was zu Populationen von dcs und Makrophagen führt, die hohe Spiegel von CD 11 B und CD 11 C exprimieren, die phänotypisch unterschiedlich sind.

Im Gegensatz dazu führt ein Aufschluss von 50 Minuten zu einer ähnlichen Zellausbeute im Vergleich zum optimierten Aufschluss. Die Abgrenzung verschiedener Zellpopulationen anhand von CD 11 B und CD 11 C gestaltet sich jedoch schwieriger. Mit zunehmender Expression von CD 11 C nimmt die Expression von CD 11 C ab.

Durch die Optimierung der Parameter für die Verdauung des Darmgewebes kann also schnell eine robuste Zellausbeute erreicht werden. Daher kann die schnelle Isolierung von intestinalen DCs und Makrophagen der Maus nützlich sein, um die funktionellen Eigenschaften von Immunzellen mit intakten Oberflächenantigenen zu bewerten.