Name: Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die schnelle Isolierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm mittels Kollagenas-Verdau und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise phänotypische Charakterisierungen für Immunologie-Studien.

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Wir danken Aaron Rae (Abteilung für Pädiatrie der Emory University und Flow Core des Children's Healthcare of Atlanta) für die Zellsortierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine NIH-Förderung (AA01787001), einen Career Development Award der Crohn's and Colitis Foundation of America sowie einen Seed-Zuschuss des Emory-Egleston Children's Research Center an T.L.D.

1. Dissektion und Dissoziation von intestinalen Epithelzellen
Herstellung der Reagenzien und Vorbereitung der Ausrüstung:
<ul>
	<li>CMF-PBS (PBS ohne Ca2+/Mg2+) auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>CMF-HBSS (HBSS ohne Ca2+/Mg2+) mit 5 % FBS (CMF-HBSS/FBS) und 2 mM EDTA auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Orbital-Schüttler auf 37 °C vorwärmen.</li>
</ul>
Hinweis: Die Schritte 1.1 bis 1.7 müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Umfang des Zelltods zu minimieren und eine maximale Zellausbeute zu erzielen.
<ol>
	<li>Töten Sie die Mäuse in einer CO2-Kammer und besprühen Sie den Bauch- und Brustbereich mit 70%igem Ethanol.</li>
	<li>Führen Sie mit einer Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Abdomens durch und klappen Sie die Haut zurück, um das Peritoneum freizulegen.</li>
	<li>Trennen Sie den Magen vom oberen Dünndarm, indem Sie am Pylorus-Sphinkter schneiden. Lösen Sie das Mesenterium mit einer Pinzette und schneiden Sie erneut am Ileozäkal-Klappenübergang, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu lösen. Schneiden Sie am Anusrand und lösen Sie das Mesenterium weiter auf, bis der Dickdarm vollständig frei ist.</li>
	<li>Schneiden Sie den Dickdarm mit der Schere längs auf und spülen Sie fäkale Bestandteile und Schleim aus dem Darmlicht in CMF PBS bei Raumtemperatur aus.</li>
	<li>Entfernen Sie mit Schere und Pinzette makroskopisch die Peyer-Plaques entlang der antimesenterialen Seite des Dünndarms und schneiden Sie den Dünndarm längs auf.</li>
	<li>Spülen Sie das Darmlicht des Dünndarms von fäkalen Bestandteilen und Schleim in CMF PBS bei Raumtemperatur aus.</li>
	<li>Schneiden Sie Dünndarm und Dickdarm getrennt in etwa 1,5 cm lange Stücke und geben Sie diese in separate 50-ml-Konischgefäße, die jeweils 30 ml vorgewärmtes CMF HBSS/FBS mit 2 mM EDTA enthalten. Geben Sie nicht mehr als einen Darm pro 50-ml-Konischgefäß hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie jedes 50-ml-Konischgefäß horizontal in einen Rüttelapparat und rütteln Sie 20 Minuten lang bei 250 U/min und 37 °C.</li>
	<li>Platzieren Sie ein einziges feines Metallsieb über einen Abfallbehälter und gießen Sie den Inhalt jedes 50-ml-Konischgefäßes durch, um die 1,5 cm langen Darmstücke zurückzugewinnen. Geben Sie diese in separate 50-ml-Konischgefäße, die jeweils 30 ml vorgewärmtes CHBSS/FBS mit 2 mM EDTA enthalten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.8.</li>
</ol>
2. Gewebeverdauung und Isolierung von Darmzellen
Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:
<ul>
	<li>Kollagenase-Lösung: 1,5 mg/ml Typ VIII-Kollagenase, gelöst in vorgewärmtem CMF HBSS/FBS mit 40 μg/ml von DNase I</li>
	<li>Vorwärmendes CMF HBSS/FBS und 2 mM EDTA.</li>
	<li>Vorwärmer orbitaler Schüttler bei 37 °C.</li>
	<li>Eiskalte CMF HBSS/FBS.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Nach der zweiten Schüttelphase gießen Sie den Inhalt jedes 50-ml-Konischkolbens durch das Sieb und überführen 1,5 cm lange Darmstücke nach dem Vorsichtig-abtupfen überschüssiger Medien mit einem Papiertuch in ein kleines, plastisches Wiegeschälchen.</li>
	<li>Verkleinern Sie die 1,5 cm langen Darmstücke mithilfe einer Schere rasch direkt im Wiegeschälchen und geben Sie den zerkleinerten Darm in 20 ml Kollagenase-Lösung. Stellen Sie jeden 50-ml-Konischkolben horizontal in einen Rüttelapparat und inkubieren Sie 10–20 Minuten bei 37 °C mit 200 U/min. Siehe untenstehende Diskussion zur Optimierung.</li>
	<li>Vortexen Sie kurz, um eine vollständige Dissoziation verbliebener Darmgewebestücke sicherzustellen, und filtrieren Sie die Suspension direkt durch ein 100-μm-Zellsieb in einen 50-ml-Konischkolben.</li>
	<li>Füllen Sie jeden 50-ml-Konischkolben mit CMF HBSS/FBS auf und zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 1500 U/min und 4 °C. Falls nach der Zentrifugation bei Kolonproben kein fester Pellet sichtbar ist, sollten die Proben erneut 3,5 Minuten zentrifugiert werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Zellpellet in eiskaltem CMF HBSS/FBS; stellen Sie die Proben anschließend auf Eis.</li>
	<li>Fahren Sie mit Abschnitt 3 zur FACS-Aufnahme/-Analyse oder mit Abschnitt 4 zur magnetischen Anreicherung mittels Mikroperlen für die Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung fort.</li>
</ol>
3. Antikörper-Färbung für die mehrfarbige Durchflusszytometrie-Analyse von DCs und Makrophagen
Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:
<ul>
	<li>Kaltes CMF PBS.</li>
	<li>Kaltes Färbepuffer (CMF PBS + 5 % FBS).</li>
	<li>Bereiten Sie die Totzellen-Färbung in kaltem CMF PBS mit einer Verdünnung von 1:1000 unter Verwendung des LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antikörper-Färbemischung vor, indem Sie die folgenden mit Fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (mAKs) zum kalten Färbepuffer hinzufügen: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.</li>
</ul>
<ol>
	<li>Überführen Sie die Zellen in ein 5-ml-Rundbodentestgefäß aus Polystyrol (FACS-Röhrchen).</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem CMF-PBS.</li>
	<li>Incubieren Sie die Proben 15 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit einer Totzellen-Färbung.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem CMF-PBS.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen mit 2.4G2 Anti-FcγRIII/II in eiskaltem Färbe-Puffer für 10 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in eiskaltem Färbe-Puffer.</li>
	<li>Incubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit einem Antikörper-Färbecocktail.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbe-Puffer, resuspendieren Sie die Proben in 400 μl eiskaltem Färbe-Puffer und filtrieren Sie sie durch einen 40-μm-Filterdeckel an den FACS-Röhrchen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben am LSR II-Zytometer (BD) gemäß der in Abschnitt 5 und Abbildung 1 beschriebenen Torgestrategie.</li>
</ol>
4. Anreicherung von DCs und Makrophagen aus dem Darm
Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:
<ul>
	<li>Eiskaltes Färbepuffer (CMF PBS + 5 % FBS).</li>
</ul>
<ol>
	<li>Inkubieren Sie die aus Schritt 2,5 erhaltene Einzelzell-Suspension gemäß Herstelleranweisungen mit CD11b- und CD11c-MACS-Beads.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem Färbe-Puffer, gefolgt von einer Zentrifugation.</li>
	<li>Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL eiskaltem Färbe-Puffer; geben Sie die Suspension nacheinander durch einen 100 μm- und einen 40 μm-Zellsieb.</li>
	<li>Reichern Sie die an magnetische Beads gebundenen Zellen durch positive Selektion mittels einer MACS LS-Magnet-Säule an.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4,2 und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit den Oberflächenmarkern in Form von mAK, wie in Schritt 3,7 beschrieben.</li>
	<li>Waschen Sie die magnetisch angereicherten Zellen zweimal mit eiskaltem Färbe-Puffer. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 500 μL eiskaltem Färbe-Puffer ohne Natriumazid und geben Sie die Suspension durch ein 40 μm-Zellsieb in ein FACS-Röhrchen.</li>
	<li>Führen Sie anschließend die FACS-Aufreinigung auf dem BD ARIA II Cell Sorter durch, um intestinale DC- und/oder Makrophagen-Teilpopulationen von Interesse zu sortieren.</li>
</ol>
5. Gating-Strategie für LP-APC
Hinweis: Beachten Sie, dass ungefärbte Darmzellen als negativer Kontrollansatz verwendet werden können, um die korrekte Platzierung der Tore zur Unterscheidung positiver und negativer Populationen zu unterstützen.
<ol>
	<li>Erstellen Sie wie in Abbildung 1 gezeigt ein Punktediagramm und schließen Sie Zellen aus, die positiv für die Totzellen-Färbung sind (Abb. 1A), gefolgt vom Ausschluss von Doppelereignissen (Abb. 1B und C). Gehen Sie danach gemäß Streuung vorwärts und seitlich auf die Zellen von Interesse und achten Sie darauf, Zelltrümmer auszuschließen (Abb. 1D).</li>
	<li>Erstellen Sie ein weiteres Punktediagramm und grenzen Sie zusätzlich CD45+- und I-Ab+-Zellen ein, die phänotypisch antigenpräsentierende Zellen (APCs) charakterisieren (Abb. 1E).</li>
	<li>Analysieren Sie in einem separaten Punktediagramm die Expression von CD11b und CD11c, um spezifische DC- und Makrophagen-Subpopulationen zu unterscheiden (R1, R2 und R3; Abb. 1F). Die Zellen von R1 sind CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen. Der Bereich R2 ist so abgegrenzt, dass diese Zellen ähnliche Oberflächenexpression von CD11c wie die Zellen von R1 aufweisen, aber zusätzlich CD11b exprimieren. Anschließend wird der Bereich R3 für Zellen festgelegt, die CD11b+ und CD11cdunkel/- sind.</li>
	<li>Analysieren Sie die Bereiche R1, R2 und R3 weiter hinsichtlich der Expression von F4/80 und CD103, um Makrophagen- und DC-Populationen zu differenzieren. Die CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen von R1 exprimieren hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80 (Abb. 1G). Die CD11b+CD11c+-Zellen von R2 setzen sich aus DCs und Makrophagen zusammen, basierend auf ihrer gegensätzlichen Expression von CD103 und F4/80 (Abb. 1H). Schließlich stellen die CD11b+CD11cdunkel/--Zellen von R3 Makrophagen dar, basierend auf dem phänotypischen Profil F4/80+ und CD103- (Abb. 1I)16.</li>
</ol>
6. Repräsentative Ergebnisse
<img alt="Streudiagramme der Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellpopulationen, einschließlich CD-Markern und Totzellsfärbung." src="/files/ftp_upload/4040/4040fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Gating-Strategie für intestinale DCs und Makrophagen. Zunächst wurden tote Zellen (A) sowie Doppelzellen (B und C) von der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurden Zellen aus dem Dünndarm entsprechend dem Forward- und Side-Scatter (D) selektiert, und antigenpräsentierende Zellen (APCs) wurden als CD45+I-Ab+ definiert (E). Makrophagen und DCs wurden anhand der Expression von CD11b und CD11c identifiziert (F). Die Expression von CD103 und F4/80 für Zellen, die zuvor in den Populationen R1 (G), R2 (H) und R3 (I) vorab selektiert wurden, wurde analysiert.
<img alt="Durchflusszytometriediagramme (A–C) für CD11c, CD11b; Diagramm zum Einfluss der Gewebeverdauung auf die Gesamtanzahl der Zellen (D–F)" src="/files/ftp_upload/4040/4040fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Die Zellausbeute und die Qualität der Antikörperfärbung hängen von der Verdauerungszeit ab. Färbemuster für CD11b und CD11c sowie die Gesamtzellausbeute bei unter- (A, D), optimal- (B, E) oder überverdautem (C, F) Darmgewebe.
Darmzellen wurden aus dem Dünndarm einer C57BL/6-Maus isoliert, und DCs sowie Makrophagen wurden mittels FACS auf dem BD LSR II analysiert. Spannung und Kompensation wurden mithilfe von nicht angefärbten und mit einzelnen Fluorochromen angefärbten Milzzellen eingestellt. Tote Zellen (Abb. 1A) und Doppelzellen (Abb. 1B und C) wurden zunächst von der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurden die Zellen von Interesse anhand von Forward- und Side-Scatter (Abb. 1D) analysiert, gefolgt von der Gating-Strategie auf CD45+- und I-Ab+-Zellen (Abb. 1E). Danach wurde die Expression von CD11b und CD11c innerhalb der CD45+I-Ab+-Zellen untersucht, um drei Bereiche (R1, R2 und R3; Abb. 1F) abzugrenzen. Die Expression von CD103 und F4/80 in den drei Bereichen wurde bewertet, um jeweils zwischen DCs und Makrophagen zu unterscheiden. Die CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen des Bereichs R1 exprimierten hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80 (Abb. 1G). Die CD11b+CD11c+-Zellen des Bereichs R2 setzten sich aus DCs und Makrophagen zusammen, basierend auf ihrer gegensätzlichen Expression von CD103 und F4/80 (Abb. 1H), während die CD11b+CD11cdunkel/--Zellen des Bereichs R3 Makrophagen darstellen, basierend auf dem phänotypischen Profil F4/80+ und CD103- (Abb. 1I)16. Makrophagen innerhalb des R2-Gates und Makrophagen im R3-Gate weisen ähnliche Forward- und Side-Scatter-Eigenschaften auf und sind durch die Expression von CD11c unterscheidbar. Die funktionelle Differenzierung dieser Subpopulationen ist weiterhin unvollständig verstanden.
Der Zusammenhang zwischen der Dauer der Gewebeverdauung und der Gesamtzellausbeute sowie der Expression von CD11b und CD11c ist in Abbildung 2 dargestellt. Bei Darmgewebe, das 3 Minuten lang verdaut wurde (Unterverdaung), war die Gesamtzahl der gewonnenen Zellen gering (Abb. 2D), wodurch nur wenige dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen zur Charakterisierung verfügbar waren (Abb. 2A). Eine Gewebeverdauung über 11 Minuten führte zu einer hohen Ausbeute an lebenden Zellen (Abb. 2E), wobei Populationen von DCs und Makrophagen hohe Mengen an CD11b und CD11c exprimierten und phänotypisch klar unterscheidbar waren (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu ergab eine Verdauung über 50 Minuten (Überverdaung) eine vergleichbare Zellausbeute im Vergleich zur optimierten Verdauung (Abb. 2E und F); die Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen mittels CD11b und CD11c wurde jedoch unklarer, da die Expression von CD11c abnahm (Abb. 2C) und die Anzahl an toten Zellen stieg (Daten nicht gezeigt).

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</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

<img src="/files/ftp_upload/4040/4040fig3.jpg" alt="Diagramm zur Optimierung der Zellausbeute: Faktoren wie Kollagenase, Gewebeverdauung, Integrität, Größe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Faktoren, die für die Optimierung der Zellausbeute und der Oberflächenantigenexpression wichtig sind. Die Zellausbeute und die Expression von Oberflächenantigenen werden direkt beeinflusst durch die Dauer der Gewebeverdauung, die spezifischen Eigenschaften der Kollagenase, de...

<table><tbody><tr><td>1X PBS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;- und Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-frei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank’s ausgeglichene Salzlösung (HBSS) mit Phenolrot</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001603</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES in 0,85 % NaCl</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td>Hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Group</td><td>14785000</td><td>Stammlösung: 100 mg/ml</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Totzellfarbstoff-Kit für 405 nm Anregung</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:1000</td></tr><tr><td>CD45-PerCP mAb (30F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100</td></tr><tr><td>CD103-PE mAb (M290)</td><td>BD Biosciences</td><td>557495</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100</td></tr><tr><td>Fc&amp;#947;RIII/II mAb (2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:200</td></tr><tr><td>CD11c-APC mAb (N418)</td><td>eBioscience</td><td>17-0114-82</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100</td></tr><tr><td>MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb</td><td>eBioscience</td><td>56-5321-82</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100</td></tr><tr><td>CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-82</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:200</td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)</td><td>eBioscience</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Mikroperlen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-601</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-Mikroperlen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>Kegelförmige 50-mL-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Einfacher Drahtsiebfilter</td><td>Chefmate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine Wägepfanne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-116</td><td></td></tr><tr><td>100-&amp;mu;m-Zellsieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m-Zellsieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5-mL-Rundbodenröhrchen aus Polystyrol</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100</td></tr><tr><td>MaxQ 4450 Tisch-Orbital-Schüttler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS MACS-Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von dendritischen zellen und makrophagen aus dem mausdarm

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Im Darm befinden sich einzigartige Populationen angeborener und adaptiver Immunzellen, die daran beteiligt sind, die Toleranz gegenüber der Kommensalflora und Nahrungsantigenen zu fördern, und gleichzeitig bereitstehen, entzündliche Reaktionen gegen invasive Pathogene auszulösen1,2. Antigenpräsentierende Zellen, insbesondere DCs und Makrophagen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Immunhomöostase, da sie in der Lage sind, die Mikrobiota wahrzunehmen und angemessen darauf zu reagieren3–14. Eine effiziente Isolierung intestinaler DCs und Makrophagen ist ein entscheidender Schritt zur Charakterisierung des Phänotyps und der Funktion dieser Zellen. Obwohl bereits viele wirksame Methoden zur Isolierung intestinaler Immunzellen, einschließlich DCs und Makrophagen, beschrieben wurden6,10,15–24, basieren viele dieser Methoden auf langen Verdauungszeiten, die negativ die Expression von Oberflächenantigenen, die Zellviabilität und/oder die Zellausbeute beeinflussen können. Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung großer Mengen lebensfähiger intestinaler DCs und Makrophagen. Die phänotypische Charakterisierung intestinaler DCs und Makrophagen erfolgt durch direktes Anfärben der isolierten Darmzellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern für die mehrfarbige Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden hochreine Populationen von DCs und Makrophagen für funktionelle Untersuchungen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierperlen gegen CD11c und CD11b sowie anschließender Zellsortierung isoliert.

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Im Darm befinden sich einzigartige Populationen an Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems, die an der Förderung der Toleranz gegenüber der kommensalen Flora und ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Zellen oder DCs und Makrophagen aus der Mausdarmwand schnell zu isolieren, um sie phänotypisch und funktionell zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Darmgewebe gewonnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Darmepithel von der Lamina propria zu lösen.Anschließend wird die intestinale Lamina propria in den letzten Schritten des Verfahrens verdaut. Die Zellen der Lamina propria werden mit fluoreszenzmarkierten konjugierten Antikörpern gefärbt und für spezifische Zellpopulationen gezielt ausgewählt. Letztendlich können intestinale DC- und Makrophagenpopulationen genauer charakterisiert und für funktionelle Untersuchungen zur Beurteilung der Zytokinproduktion, der Antigenpräsentation und der Regulation von Immunzellen gereinigt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt also darin, dass die Schnelligkeit der Gewebeverdauung eine optimale Expression von Zelloberflächenantigenen, die Zellviabilität und die zellulären Eigenschaften gewährleistet. Nach der Tötung der Maus und Bestätigung des Todes mittels der Zehenquetschreflexprüfung, sprühen Sie 70 %igen Ethanol auf den Bauch- und Brustbereich des Tieres. Anschließend verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Abdomens zu machen, und ziehen die Haut zurück, um das Peritoneum freizulegen.Öffnen Sie das Peritoneum mit einer Schere, nachdem Sie am Pilo-Sphinkter geschnitten haben, um den Magen vom oberen Dünndarm zu trennen, und lösen Sie mit einer Pinzette das Mesenterium. Schneiden Sie erneut am Ileozökalklappenbereich, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu lösen. Setzen Sie die Trennung des Mesenteriums vom Dickdarm fort und führen Sie einen Schnitt am Analkanalrand durch.Verwenden Sie eine Schere, um den Darm längs zu öffnen, und spülen Sie mit C-M-F-P-B-S bei Raumtemperatur die fäkalen Inhalte und den Schleim aus dem Darmlumen. Verwenden Sie anschließend die Schere und die Pinzette, um makroskopisch die Peyer-Plaques entlang der antimesenterialen Fläche des Dünndarms zu dissezieren und den Dünndarm längs zu eröffnen.Als Nächstes spülen Sie den Dünndarm-Lumen mit weiterem C-M-F-P-B-S bei Raumtemperatur, um fäkale Inhalte und Schleim zu entfernen. Schneiden Sie Dünndarm und Dickdarm separat in etwa 1,5 cm lange Stücke und geben Sie diese in einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße, die jeweils 30 Milliliter vorgewärmtes C-M-F-H-B-S-S mit FBS und zwei Millimolar EDTA enthalten. Stellen Sie jedes 50-Milliliter-Konischgefäß horizontal in einen Rüttelapparat und rütteln Sie die Gefäße 20 Minuten lang bei 250 U/min und 37 Grad Celsius.Stellen Sie als Nächstes ein einziges Sieb mit Maschendraht über einen Abfalleimer. Gießen Sie den Inhalt jedes 50-Milliliter-Konischgefäße durch das Sieb, um die Darmstücke zurückzugewinnen, und geben Sie diese dann in neue einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße, die 30 Milliliter vorgewärmtes C-M-F-H-B-S-S mit FBS und zwei Millimolar EDTA enthalten. Stellen Sie die Gefäße abschließend erneut 20 Minuten lang in den Rüttelapparat.Nach der zweiten Schüttelphase gießen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch das Sieb. Tupfen Sie erneut die überschüssige Nährlösung mit einem Papiertuch ab und überführen Sie anschließend die Darmstücke in ein kleines, plastisches Petrischälchen. Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist die Gewebeverdauung, um den Erfolg sicherzustellen. Dabei müssen alle verschiedenen Parameter wie Dauer der Verdauung, Eigenschaften des Kollagenasepräparats, Gewebestabilität und Größe des zu verdauenden Gewebes unter raschem Einsatz einer Schere berücksichtigt werden.Zerkleinern Sie die Darmstücke und geben Sie den gehackten Darm in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das 20 Milliliter Kollagenase-Lösung enthält. Stellen Sie das Konischgefäß horizontal in den Rüttelapparat und verdauen Sie die Darmstücke 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min. Vortexen Sie das Gefäß nun kurz, um eine vollständige Dissoziation des verbleibenden Darmgewebes sicherzustellen, und filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 100-Mikron-Zellsieb direkt in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.Schließlich auffüllen des kegelförmigen Reaktionsgefäßes mit C-M-F-H-B-S-S mit FBS und Zentrifugation der Zellsuspension zweimal für jeweils fünf Minuten bei 425 × g und vier Grad Celsius. Anschließend den Überstand dekantieren und das Zellpellet in eiskaltem C-M-F-H-B-S-S mit FBS resuspendieren und die Proben auf Eis stellen. Nach der Färbung der Zellen für die gewünschten Oberflächenproteine.Erstellen Sie zunächst ein Punktdiagramm, bei dem die Zellen ausgeschlossen werden, die positiv für die Totzellen-Färbung sind, wie hier gezeigt. Schließen Sie danach Doppelte-Ereignisse aus, wie hier und hier dargestellt. Verwenden Sie nun die Vorwärts- und Seitenstreuungskanäle, um auf die Zellen von Interesse zu selektieren, und achten Sie darauf, Zelltrümmer auszuschließen.Erstellen Sie anschließend ein weiteres Punktdiagramm mit Toreinstellung auf das CD45-positive und IAB-positive Antigen. Stellen Sie die Zellen in einem separaten Punktdiagramm dar und definieren Sie Bereiche zur Unterscheidung spezifischer DC- und Makrophagensubtypen. Der hier gezeigte R1-Bereich erfasst die CD11c-positiven und CD11b-schwach-negativen Zellen.Der R2-Bereich grenzt die Zellen ab, die ein ähnliches Maß an Oberflächenexpression von CD11c aufweisen wie die Zellen im R1-Bereich, aber zusätzlich CD11b exprimieren. Die R3-Bereiche kennzeichnen die Zellen, die CD11b-positiv und CD11c-schwach-negativ sind. Diese drei Bereiche können weiterhin hinsichtlich der Expression von F4/80 und CD103 analysiert werden, um Makrophagen- und DC-Populationen jeweils zu unterscheiden. Wie in diesem Punktediagramm zu sehen ist, exprimieren die CD11c-positiven, CD11b-schwach-negativen Zellen im R1-Bereich hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80.Dieses Punktdiagramm zeigt, dass CD11b-positive, CD11c-positive Zellen im R2-Bereich aufgrund ihres dichotomen Expressionsmusters von CD103 und F4/80 aus sowohl DCs als auch Makrophagen bestehen. Schließlich werden basierend auf ihrem F4/80-positiven und CD103-negativen phänotypischen Profil im R3-Bereich die selektierten CD11b-positiven, CD11c-negativen Zellen aus Makrophagen bestehen. Der Zusammenhang zwischen der Dauer der Gewebeverdauung und der Gesamtzellausbeute sowie der Expression von CD11b und CD11c wird in den folgenden sechs Abbildungen veranschaulicht. Darmgewebe, das drei Minuten lang verdaut wird, ergibt eine geringe Gesamtzahl an Zellen, was in nur wenigen zur Charakterisierung verfügbaren DCs und Makrophagen resultiert. Eine Gewebeverdauung über 11 Minuten führt hingegen zu einer hohen Ausbeute an lebenden Zellen und liefert Populationen von DCs und Makrophagen, die hohe Mengen an CD11b und CD11c exprimieren und phänotypisch klar voneinander abgrenzbar sind.Im Gegensatz dazu führt eine Verdauung über 50 Minuten zu einer ähnlichen Zellausbeute im Vergleich zur optimierten Verdauung. Die Abgrenzung verschiedener Zellpopulationen mittels CD 11 B und CD 11 C wird jedoch schwieriger, da die Expression von CD 11 C abnimmt und die Anzahl toter Zellen zunimmt.Bei Optimierung der Parameter für die Verdauung von Darmgewebe kann somit schnell eine hohe Zellausbeute erzielt werden. Folglich kann die schnelle Isolierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus der Mausdarmwand nützlich sein, um die funktionellen Eigenschaften von Immunzellen mit intakten Oberflächenantigenen zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Das Ziel dieses Protokolls ist es, mononukleäre Zellen, die in der Lamina-Propria des Dickdarms durch enzymatische Verdauung des Gewebes mit Kollagennase leben zu isolieren. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung mononukleativer Zellen, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die wiederum für eine robuste Immunphenotypisierung verwendet werden kann.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

Isolierung und Charakterisierung der Immunzellen aus mikrodissektierten Maus-Aderhautplexus

Erfahren Sie die schnelle Isolierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm mittels Kollagenas-Verdau und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht präzise phänotypische Charakterisierungen für Immunologie-Studien.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

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