Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Das übergeordnete Ziel dieses antigentreibenden Kolitis-Modells besteht darin, zu bestimmen, ob CX3CR1-positive monozytäre Phagozyten während einer antigenspezifischen Kolitis mit CD4-positiven T-Zellen interagieren und diese aktivieren, und ob diese von monozytären Phagozyten abhängige Expansion effektorischer T-Zellen in der intestinalen Lamina propria stattfindet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, beispielsweise welche Arten von Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und effektorischen T-Zellen in der kolischen Lamina propria auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung der Interaktionen von Immunzellen sowie der Faktoren, die zur Pathogenität entzündlicher Darmerkrankungen führen, ermöglicht.

Diese Methode verwendet das T-Zell-Transfer-Kolitis-Modell, bei dem rote fluoreszierende, antigenspezifische naive CD4-T-Zellen in einen immundefizienten Wirt transferiert werden, der das grüne fluoreszierende Protein in mononukleären Zellen exprimiert. Dem Zelltransfer folgt die orale Gabe von blau fluoreszierenden, Antigene exprimierenden Bakterien. Die immunologischen Vorgänge, die in der intestinalen Lamina propria der Wirtstiere stattfinden, können in verschiedenen Stadien der Krankheitsentwicklung verfolgt werden.

Öffnen Sie mit einer Schere den Dickdarm in Längsrichtung und spülen Sie das Gewebe in einer Petrischale mit 25 Milliliter PBS, um Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Schneiden Sie den Dickdarm in Stücke von fünf bis acht Millimeter Länge und geben Sie die resultierenden Fragmente in 20 Milliliter frisches DPBS ohne Calcium und Magnesium, ergänzt mit zehn Millimolar HEPES und fünf Millimolar EDTA. Vortexen Sie das Gefäß mit der Probe 30 Sekunden lang auf maximaler Stufe.

Anschließend 10 Minuten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren, um das Epithel zu entfernen. Am Ende der Inkubation erneut 30 Sekunden lang verwirbeln. Danach den Überstand, der die epithelialen Zellen enthält, verwerfen.

Überführen Sie die Gewebestücke in ein neues Gefäß mit 20 Milliliter frischem PBS, HEPES und EDTA-Puffer und wiederholen Sie die Inkubation mit den Vortexschritten vorher und nachher. Nach der dritten Wiederholung sind alle epithelialen Zellen entfernt und der Überstand ist klar. Waschen Sie die Gewebefragmente vorsichtig in PBS, um eventuelle restliche epitheliale Zellen zu entfernen.

Schneiden Sie die Gewebefragmente in zwei mal zwei Millimeter große Stücke und überführen Sie die Stücke zur Verdauung in zehn Millimeter RPI-Medium, das mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ acht und zehn Einheiten pro Milliliter DNAse eins ergänzt wurde. Vortexen Sie die Proben 30 Sekunden lang. Inkubieren Sie anschließend die Gewebestücke bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 30 bis 35 Minuten und vortexen Sie das Gefäß alle fünf Minuten während der Inkubation.

Wenn das Gewebe verdaut ist, filtrieren Sie die entstandene Suspension durch einen 70-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie den Zellfilter einmal nach und pelletieren Sie die Einzelzell-Suspension durch Zentrifugation. Schließlich waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und zentrifugieren erneut.

Anschließend die Anzahl der lebensfähigen Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmen. Ovalbumin-Protein produzierendes e. coli, das cyanfarbenes fluoreszierendes Protein exprimiert, aktiviert die Produktion von Interferon-Gamma in OT-II-Zellen in vitro, im Gegensatz zu e.

coli, die nur CFP exprimieren. Die ex vivo 3D-Konfokalabbildung des kolonischen Gewebes transgener, grün fluoreszierendes Protein exprimierender Mäuse, die mit E. coli PCFP-Ova gefüttert wurden, zeigt das Vorhandensein der fluoreszierenden Proteine exprimierenden Bakterien innerhalb der kolonischen Krypten nahe den intestinalen Epithelzellen sowie eine Kolokalisation mit den phagozytierenden Zellen des Wirts dar.

Bei OT-II-roten Tieren zeichnen sich die CD4-positiven T-Zellen durch ihre Ko-Expression von rotem fluoreszierendem Protein und V-beta-fünf-komma-eins aus. Nach Herausforderung mit e. coli PCFP ova verlieren BNT-Lymphozyten-defiziente, grün fluoreszierendes Protein exprimierende transgene Mäuse, die adoptiv mit OT-II-roten CD4-positiven, CD62-Ligand-positiven T-Zellen transplantiert wurden, rasch an Körpergewicht und entwickeln klinische Anzeichen einer Kolitis.

Sieben Tage nach der Zellübertragung haben nur wenige Wirt-Phagozyten E. coli PCFP-Ova aufgenommen, und OT-II-rote positive Zellen werden nicht nachgewiesen. Vierzehn Tage nach der Zellübertragung zeigen Wirt-Phagozyten, die das E.

Die e. coli PCFP-Ova befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den adoptiv übertragenen OT-II-rot-positiven Zellen. 21 Tage nach der Zellübertragung haben zahlreiche Wirtszellen die e. coli PCFP-Ova und die donor OT-II-rot-positiven Zellen aufgenommen, die im gesamten kolonischen Lamina propria verstreut vorzufinden sind und engen Kontakt mit den phagozytierenden Zellen des intestinalen Wirts aufweisen.

Wenn die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Färbung intestinaler Lymphozyten und die Analyse von Serumzytokinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Aktivierungszustand von CD4-T-Zellen zu beantworten und die Schwere der Kolitis zu bestätigen. Nach jeder Weiterentwicklung ebnet diese Technik den Weg für die Forschung im Bereich der Immunologie, um die kleinen Ereignisse zu untersuchen, die bei der Maus als Modellorganismus zur entzündlichen Darmerkrankung führen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen aus der kolonischen Lamina propria für die nachgeschaltete ex vivo-Analyse isoliert.