Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Das übergeordnete Ziel dieses Antigen-getriebenen Colitis-Modells ist es, zu bestimmen, ob CX3, CR1-positive mononukleäre Phagozyten mit CD4-positiven T-Zellen während einer antigenspezifischen Colitis interagieren und diese aktivieren und ob diese mononukleäre Phagozyten-abhängige Effektor-T-Zell-Expansion innerhalb der intestinalen Lamina propria stattfindet. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, z. B. welche Arten von Wechselwirkungen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und den Effektor-T-Zellen in der Dickdarmlamina propria auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Interaktion der Immunzellen und der Elemente ermöglicht, die zur Entstehung von entzündlichen Darmerkrankungen führen.

Diese Methode verwendet das T-Zell-Transfer-Colitis-Modell, bei dem die rot fluoreszierenden Antigen-spezifischen naiven CD4-T-Zellen auf den immundefizienten Wirt übertragen werden und das grün fluoreszierende Protein in mononukleären Zellen exprimieren. Der Zelltransfer erfolgt mit der oralen Sonde der blau fluoreszierenden Antigen-exprimierenden Bakterien. Die Immunereignisse, die in der intestinalen Lamina propria der Wirte stattfinden, können in verschiedenen Stadien der Krankheitsentwicklung beobachtet werden.

Verwenden Sie eine Präparierschere, um den Dickdarm in Längsrichtung zu öffnen, und waschen Sie das Gewebe in einer Petrischale mit 25 Millilitern PBS, um Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Schneiden Sie den Dickdarm in fünf bis acht Millimeter große Stücke und legen Sie die entstandenen Fragmente in 20 Milliliter frisches DPBS ohne Kalzium und Magnesium, ergänzt mit zehn Millimolar HEPES und fünf Millimolar EDTA. Wirbeln Sie das Röhrchen mit der Probe 30 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit.

Dann bei 37 Grad Celsius zehn Minuten lang unter leichtem Schütteln inkubieren, um das Epithel zu entfernen. Am Ende der Inkubation erneut 30 Sekunden lang vortexen. Entsorgen Sie dann den Überstand, der die Epithelzellen enthält.

Übertragen Sie die Gewebestücke in ein neues Röhrchen mit 20 Millilitern frischem PBS-, HEPES- und EDTA-Puffer und wiederholen Sie die Inkubation mit den Vortexing-Schritten davor und danach. Nach der dritten Wiederholung werden alle Epithelzellen entfernt und der Überstand ist klar. Waschen Sie die Gewebefragmente vorsichtig in PBS, um alle verbleibenden Epithelzellen zu entfernen.

Schneiden Sie die Gewebefragmente in zwei mal zwei Millimeter große Stücke und überführen Sie die Stücke zur Verdauung in zehn Millimeter RPI-Medium, ergänzt mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ acht und zehn Einheiten pro Milliliter DNAse eins. Die Proben 30 Sekunden lang vortexen. Dann inkubieren Sie die Gewebestücke bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 30 bis 35 Minuten und wirbeln Sie das Röhrchen während der Inkubation alle fünf Minuten durch.

Wenn das Gewebe verdaut ist, wird die resultierende Aufschlämmung durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen abgeseiht. Waschen Sie das Zellsieb einmal und schleudern Sie die Einzelzellensuspension durch Zentrifugation herunter. Zum Schluss die Zellen einmal in PBS waschen und zentrifugieren.

Bestimmen Sie dann die Anzahl lebensfähiger Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Cyan fluoreszierendes Protein, Ovalbumin-Protein-produzierende E. coli aktivieren die Interferon-Gamma-Produktion in OT-II-Zellen in vitro im Gegensatz zu e.

coli, die nur CFP exprimieren. Die konfokale Ex-vivo-3D-Bildgebung des Dickdarmgewebes von transgenen grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden Mäusen, die mit E. coli PCFP-Eizellen gefüttert wurden, zeigt das Vorhandensein der fluoreszierenden Protein-exprimierenden Bakterien in den Dickdarmkrypten in der Nähe der Darmepithelzellen und kolokalisiert mit den Darmphagozyten des Wirts.

Bei roten OT-II-Tieren zeichnen sich die CD4-positiven T-Zellen durch ihre Co-Expression von rot fluoreszierendem Protein und V beta fünf Komma eins aus. Wenn sie mit E. coli-PCFP-Eizellen konfrontiert werden, verlieren BNT-Lymphozyten-defiziente, grün fluoreszierende Protein-exprimierende transgene Mäuse, die adoptiv mit OT-II-roten CD4-positiven CD62-Liganden transplantiert wurden, schnell an Körpergewicht und entwickeln klinische Anzeichen einer Kolitis.

Sieben Tage nach dem Zelltransfer wurden nur wenige Wirtsphagozyten aus e. coli PCFP-Eizellen entnommen und OT-II-rote positive Blutkörperchen wurden nicht nachgewiesen. 14 Tage nach dem Zelltransfer wurden Wirtsphagozyten, die die e.

coli PCFP-Eizellen befinden sich in unmittelbarer Nähe der adoptiv übertragenen roten OT-II-roten positiven Zellen. Bis 21 Tage nach dem Zelltransfer hat eine große Anzahl von Wirtszellen die E. coli PCFP-Eizellen beprobt, und die rot-positiven OT-II-Spenderzellen, die in der gesamten Dickdarmlamina propria verteilt sind, stehen in engem Kontakt mit den Darmphagozyten des Wirts.

Wenn diese Technik gemeistert wird, kann sie in vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Färbung der intestinalen Lymphozyten und die Serumzytokinanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Aktivierungszustand der CD4-T-Zellen zu beantworten und den Schweregrad der Kolitis zu bestätigen. Nach jeder Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für die Forschung auf dem Gebiet der Immunologie, um die kleinen Ereignisse zu erforschen, die im Mausmodell zu entzündlichen Darmerkrankungen führen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen der Dickdarmlamina propria für die nachgelagerte Ex-vivo-Analyse isoliert