Name: Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Interaktion zwischen mononukleären Phagozyten und CD4-T-Zellen im antigengetriebenen Kolitis-Modell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Ereignisse in der intestinalen Lamina propria und liefert Einblicke in die Pathogenese chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wie bei jedem anderen Modell, das Antigen-driven oben kann beschrieben ulcerosa Modell einige Probleme präsentieren, die der Forscher die Technik der Durchführung bewusst sein müssen. Wenn die OT-II / Red + CD4 + T - CD62L + Zellen in den Rechner eingespritzt wird , muss der Prüfer sehr sanft und vorsichtig , um die Nadel in die Bauchhöhle einzuführen. Geschieht dies nicht, so kann es zu dem Zerreißen des Darms der Maus, die den Tod oder eine subkutane Verabreichung von Zellen führen kan...

Der Darm ist die größte Oberfläche des Körpers, die der äußeren Umgebung ausgesetzt ist. Große Arrays von resident Mikroben besiedeln den menschlichen Darm die intestinale Mikrobiota (oder Mikroflora) zu bilden. Dies wird geschätzt , von bis zu 100 Billionen mikrobiellen Zellen zu bestehen und ist eine der am dichtesten besiedelten bakterielle Lebensräume bekannt in der Biologie 1-3. Im GIT Bakterien besiedeln eine Darm-Nische , wo sie überleben und 4 multiplizieren. Im Gegenzug stiftet die Mikrobiota den Host mit zusätzlichen funktionellen Eigenschaften , die nicht auf ihrem Genom codiert 1. Zum Beispiel regt die Mikrobiota die Proliferation von Epithelzellen produziert Vitamine , die Gastgeber selbst nicht produzieren kann, reguliert den Stoffwechsel und schützt vor Krankheitserregern 4-6. Diese vorteilhafte Beziehung gegeben, haben einige Autoren vorgeschlagen , dass Menschen &quot;Super-Organismen&quot; oder &quot;holobionts&quot; sind , die eine Mischung aus Bakterien und menschlichen Genen 7,8 sind. In Anbetracht der positiven Auswirkungen der Mikrobiota auf der (menschlichen) host, muss der Darm-Immunsystem commensal Mikroben zu tolerieren ihre Existenz in das Lumen zu ermöglichen , sondern auch die Erreger abzutöten, 9-11 von luminalen Seite eindringen. Die intestinale Immunsystem Mechanismen zwischen harmlosen und potentiell schädlichen luminalen Mikroben zu unterscheiden entwickelt; jedoch sind diese Mechanismen noch nicht gut verstanden 12. Darm Aufrechterhaltung der Integrität erfordert eine streng reguliert Immunhomöostase 13 die Balance zwischen Toleranz und Immunität zu halten. Ein Ungleichgewicht in Immunhomöostase trägt zur Induktion von intestinalen Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 3,14. Es gibt zwei Haupttypen von IBD: Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC). Bei Patienten mit diesen Erkrankungen leiden in der Regel von rektale Blutungen, schweren Durchfall und Bauchschmerzen 15,16. Die einzige Ursache von IBD ist nach wie vorunbekannt, aber eine Kombination von genetischen Faktoren, Umwelteinflüsse und dysregulated Immunreaktionen könnten das Schlüsselereignis für die Entwicklung der Krankheit 15 sein. Tiermodelle für IBD sind seit über 50 Jahren verwendet. In den letzten Jahrzehnten neue IBD Modellsysteme wurden die verschiedenen Hypothesen über die Pathogenese von IBD 17,18 zu testen , entwickelt. Die am besten charakterisierte Modell der chronischen Kolitis ist die T-Zell - Transfer - Modell , das Störung der T-Zell - Homöostase 19,20 induziert. Dieses Modell beinhaltet naive T - Zellen von Mäusen immunokompetente in Wirte übertragen , die T- und B-Zellen (wie RAG - / - und SCID - Mäuse) fehlt 16,21. Die Entwicklung der Krankheit in diesem Modell wird durch die Auswertung der Anwesenheit von Durchfall, reduzierte körperliche Aktivität, und der Verlust von Körpergewicht für 3-10 Wochen überwacht. Dies wird so das Wasting - Syndrom 16 genannt. Im Vergleich zu den gesunden Mäusen die Kolon-Gewebe transplantiert Wirte ist thicker, kürzer und schwerer 16. Verwendung des T - Zellen - Übertragungsmodell ist es möglich , zu verstehen , wie verschiedene T - Zellpopulationen 22 zur Pathogenese von IBD beitragen kann. Die T-Zellen-Transfer-Modell analysiert nicht die Wechselwirkungen zwischen den APCs und T-Zellen im Krankheitsprozess in einer Antigen-spezifischen Weise. Es hat sich gezeigt , dass eine Wechselwirkung zwischen myeloiden Zellen und lymphoiden Zellen für die Entwicklung von Darmentzündungen 23 verantwortlich sein könnte. Obwohl viele Aspekte der IBD geklärt sind, die ersten Ereignisse, die noch an der Krankheitsentwicklung führen muss deutlich verstanden werden. Es wurde in der Abwesenheit von Mikrobioten Übertragungs colitis gezeigt , dass nicht 24 festgelegt werden. Vor kurzem mehrere Theorien legen nahe , dass IBD 25 ein Ergebnis einer Immunantwort gegen kommensalen Bakterien sein könnte. Autoren haben auch vorgeschlagen, dass kommensalen Bakterien sind wesentliche Entzündung im distalen Darm zu induzieren26. In keimfrei (GF) Tiere , die intestinale Immunsystem 27,28 Regel beeinträchtigt, sondern eine Kolonisierung dieser Mäuse mit einem Gemisch aus specific pathogen free Bakterien führt zur Entwicklung des vollständig kompetenten intestinale Immunsystem 29. Daher scheint der Mikrobioten ein Schlüsselelement bei der Pathogenese von IBD zu sein, entweder als ein Mechanismus, der prädisponiert oder schützt gegen die Entwicklung von Darmentzündung 30,31. Aktuelle Theorien besagen , dass IBD ein Ergebnis der mikrobiellen Ungleichgewicht ist, genannt dysbiosis, in genetisch prädisponiert Patienten 32, aber es ist noch nicht klar , ob die Dysbiose ist die Ursache oder die Folge der Krankheit 12. Angesichts der Rolle von Mikroorganismen in der Entwicklung von IBD, zeigten in vitro - Experimente , dass CD4 + T - Zellen durch APCs gepulst mit Darmbakterien 33,34 aktiviert werden kann. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die aus Antigenenverschiedene commensal Bakterienarten, wie beispielsweise E. coli, Bacteroides, Eubacterium und Proteus der Lage sind, CD4 + T - Zellen 35 zu aktivieren. Dies zeigt, dass Präsentation von bakteriellen Antigenen an T-Zellen von Bedeutung für die Entwicklung von IBD ist. Abgeleitet Um die Komplexität von mehreren Antigenen zu reduzieren durch die Mikroflora im Krankheitsverlauf, ein E. coli - Stamm wurde erstellt, der die OVA - Antigen produziert. Transfer ulcerosa wurde durch Injizieren von OVA-spezifischen T - Zellen in RAG induziert - / - Tieren besiedelt mit OVA-exprimierenden E. coli. Dieses Modell basiert auf den letzten Hinweise darauf , dass CX 3 CR1 + MPs, eine wichtige Zell - Untergruppe in der Kolon - Lamina propria (clp) 36, sind mit CD4 + T - Zellen während der Übertragung in Wechselwirkung Colitis 37. MPs Darmlumen für teilchenförmiges Antigen, wie Bakterien abzutasten, deren Dendriten unter Verwendung von 36, 38,39. Vorherige Studiengezeigt , dass die Abgeordneten wie OVA aufnehmen kann Lumen 40,41 in den Darm auch lösliche Antigene, eingeführt. Angesichts der Fülle von CX 3 CR1 + MPs im clp, ist es möglich , dass diese Zellen luminalen Bakterien probieren können und die Interaktion mit CD4 - T - Zellen. Konfokale Bildgebung von Mäusen transplantiert mit OVA-spezifischen CD4 + T - Zellen mit E. kolonisiert coli CFP-OVA, zeigen , daß CX 3 CR1 + MPs in Kontakt mit OT-II CD4 + T - Zellen während der Entwicklung von antigen-getrieben ulcerosa. Dieses Modell erlaubt die Untersuchung der Antigenpräsentation Prozess zwischen intestinalen APCs und T-Zellen spezifisch nur für bestimmte Antigen-exprimierenden Bakterien in das Darmlumen.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shake</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>Modell 3020 GFL</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Spalt Couvettes&nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell System&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>High Pure Plasmid Isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH & Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Kammer&nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>Ladefarbstoff</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Leiter&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0312</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid-Lösung</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>Foto-Dokumentationssystem&nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Sequenzierung&nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter&nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue Solution</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, Vereinigtes Königreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH & Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>Elektro-Löschpapier</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ovalbumin-Antikörper&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG&nbsp; HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus Western Blotting Substrat</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trisbase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ CD62 L+ T Isolationskit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Säulen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Säulen&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Zuführnadel 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>Maus BD Fc Block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugierte mAb-Bindung V&szlig; 5.1, 5.2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>APC-konjugierte mAb-Bindung CD4 GK1.5&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3 Software</td><td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta konfokales Rastermikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Workstation</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEM Software&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp Immunplatten&nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin konjugierte alkalische Phosphatase</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>Alkalisches Phosphatase-Substrat 4-Nitrophenylphosphat Dinatriumsalzhexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECAN Mikrotiterplatten-ELISA-Reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWin Software</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I rekombinante</td><td></td><td>4536282001</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung einer präsentation von antigenen zu studieren antigen-driven ulcerosa modell durch antigen-präsentierende zellen zu t-zellen präsentieren

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Entzündliche Darmerkrankung (CED) ist eine chronische Entzündung, die den Magen-Darm-Trakt (GIT) betrifft. Eine der besten Möglichkeiten, die immunologischen Mechanismen während der Krankheit zu untersuchen, ist das T-Zell-Transfermodell der Kolitis. In diesem Modell werden immundefiziente Mäuse (RAG-/-Empfänger) mit naiven CD4+ T-Zellen aus gesunden Wildtyp-Wirten rekonstituiert.
Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der frühesten immunologischen Ereignisse, die zu Krankheiten und chronischen Entzündungen führen, wenn die Darmentzündung fortbesteht, aber nicht von einem definierten Antigen abhängt. Um die potenzielle Rolle von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) im Krankheitsprozess zu untersuchen, ist es hilfreich, ein antigengetriebenes Krankheitsmodell zu haben, in dem ein definiertes kommensales abgeleitetes Antigen zu Kolitis führt. Daher wurde ein Antigen-getriebenes Kolitis-Modell entwickelt. In diesem Modell werden OT-II CD4+ T-Zellen, die nur spezifische Epitope im OVA-Protein erkennen können, in RAG-/- Wirte transferiert, die mit CFP-OVA-exprimierenden E. coli belastet sind. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen APCs und T-Zellen in der Lamina propria.

Ein Antigen-driven ulcerosa Modell zu etablieren ein E. coli - Stamm in welcher wurde konstruiert , das ein Plasmid enthält das Gen für GFP an die codierende Sequenz für das Hühner - Ovalbumin - Protein fusioniert ist und das Fusionskonstrukt unter der Kontrolle des starken konstitutiven Promotor P hyper (1A) ausgedrückt wird. Fluoreszenzmikroskopie zeigt , daß das rekombinante E. coli PCFP-OVA, jedoch nicht die elterliche...

In diesem Antigen-getriebenen Colitis-Modell wurden OT-II CD4+ T-Zellen, die ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren, adoptiv in RAG-/- Mäuse übertragen, die ein grün fluoreszierendes Protein in mononukleären Phagozyten (MPs) exprimieren. Die Wirte wurden mit Escherichia coli (E.coli) konfrontiert, die das Ovalbuminprotein (OVA) exprimierten, das mit einem cyanfluoreszierenden Protein (CFP) fusioniert war.

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Das übergeordnete Ziel dieses antigentreibenden Kolitis-Modells besteht darin, zu bestimmen, ob CX3CR1-positive monozytäre Phagozyten während einer antigenspezifischen Kolitis mit CD4-positiven T-Zellen interagieren und diese aktivieren, und ob diese von monozytären Phagozyten abhängige Expansion effektorischer T-Zellen in der intestinalen Lamina propria stattfindet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, beispielsweise welche Arten von Interaktionen zwischen antigenpräsentierenden Zellen und effektorischen T-Zellen in der kolischen Lamina propria auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung der Interaktionen von Immunzellen sowie der Faktoren, die zur Pathogenität entzündlicher Darmerkrankungen führen, ermöglicht.Diese Methode verwendet das T-Zell-Transfer-Kolitis-Modell, bei dem rote fluoreszierende, antigenspezifische naive CD4-T-Zellen in einen immundefizienten Wirt transferiert werden, der das grüne fluoreszierende Protein in mononukleären Zellen exprimiert. Dem Zelltransfer folgt die orale Gabe von blau fluoreszierenden, Antigene exprimierenden Bakterien. Die immunologischen Vorgänge, die in der intestinalen Lamina propria der Wirtstiere stattfinden, können in verschiedenen Stadien der Krankheitsentwicklung verfolgt werden.Öffnen Sie mit einer Schere den Dickdarm in Längsrichtung und spülen Sie das Gewebe in einer Petrischale mit 25 Milliliter PBS, um Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Schneiden Sie den Dickdarm in Stücke von fünf bis acht Millimeter Länge und geben Sie die resultierenden Fragmente in 20 Milliliter frisches DPBS ohne Calcium und Magnesium, ergänzt mit zehn Millimolar HEPES und fünf Millimolar EDTA. Vortexen Sie das Gefäß mit der Probe 30 Sekunden lang auf maximaler Stufe.Anschließend 10 Minuten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren, um das Epithel zu entfernen. Am Ende der Inkubation erneut 30 Sekunden lang verwirbeln. Danach den Überstand, der die epithelialen Zellen enthält, verwerfen.Überführen Sie die Gewebestücke in ein neues Gefäß mit 20 Milliliter frischem PBS, HEPES und EDTA-Puffer und wiederholen Sie die Inkubation mit den Vortexschritten vorher und nachher. Nach der dritten Wiederholung sind alle epithelialen Zellen entfernt und der Überstand ist klar. Waschen Sie die Gewebefragmente vorsichtig in PBS, um eventuelle restliche epitheliale Zellen zu entfernen.Schneiden Sie die Gewebefragmente in zwei mal zwei Millimeter große Stücke und überführen Sie die Stücke zur Verdauung in zehn Millimeter RPI-Medium, das mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ acht und zehn Einheiten pro Milliliter DNAse eins ergänzt wurde. Vortexen Sie die Proben 30 Sekunden lang. Inkubieren Sie anschließend die Gewebestücke bei 37 Grad Celsius unter Schütteln für 30 bis 35 Minuten und vortexen Sie das Gefäß alle fünf Minuten während der Inkubation.Wenn das Gewebe verdaut ist, filtrieren Sie die entstandene Suspension durch einen 70-Mikron-Zellfilter in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie den Zellfilter einmal nach und pelletieren Sie die Einzelzell-Suspension durch Zentrifugation. Schließlich waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und zentrifugieren erneut.Anschließend die Anzahl der lebensfähigen Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmen. Ovalbumin-Protein produzierendes e. coli, das cyanfarbenes fluoreszierendes Protein exprimiert, aktiviert die Produktion von Interferon-Gamma in OT-II-Zellen in vitro, im Gegensatz zu e.coli, die nur CFP exprimieren. Die ex vivo 3D-Konfokalabbildung des kolonischen Gewebes transgener, grün fluoreszierendes Protein exprimierender Mäuse, die mit E. coli PCFP-Ova gefüttert wurden, zeigt das Vorhandensein der fluoreszierenden Proteine exprimierenden Bakterien innerhalb der kolonischen Krypten nahe den intestinalen Epithelzellen sowie eine Kolokalisation mit den phagozytierenden Zellen des Wirts dar.Bei OT-II-roten Tieren zeichnen sich die CD4-positiven T-Zellen durch ihre Ko-Expression von rotem fluoreszierendem Protein und V-beta-fünf-komma-eins aus. Nach Herausforderung mit e. coli PCFP ova verlieren BNT-Lymphozyten-defiziente, grün fluoreszierendes Protein exprimierende transgene Mäuse, die adoptiv mit OT-II-roten CD4-positiven, CD62-Ligand-positiven T-Zellen transplantiert wurden, rasch an Körpergewicht und entwickeln klinische Anzeichen einer Kolitis.Sieben Tage nach der Zellübertragung haben nur wenige Wirt-Phagozyten E. coli PCFP-Ova aufgenommen, und OT-II-rote positive Zellen werden nicht nachgewiesen. Vierzehn Tage nach der Zellübertragung zeigen Wirt-Phagozyten, die das E.Die e. coli PCFP-Ova befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den adoptiv übertragenen OT-II-rot-positiven Zellen. 21 Tage nach der Zellübertragung haben zahlreiche Wirtszellen die e. coli PCFP-Ova und die donor OT-II-rot-positiven Zellen aufgenommen, die im gesamten kolonischen Lamina propria verstreut vorzufinden sind und engen Kontakt mit den phagozytierenden Zellen des intestinalen Wirts aufweisen.Wenn die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Färbung intestinaler Lymphozyten und die Analyse von Serumzytokinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Aktivierungszustand von CD4-T-Zellen zu beantworten und die Schwere der Kolitis zu bestätigen. Nach jeder Weiterentwicklung ebnet diese Technik den Weg für die Forschung im Bereich der Immunologie, um die kleinen Ereignisse zu untersuchen, die bei der Maus als Modellorganismus zur entzündlichen Darmerkrankung führen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunzellen aus der kolonischen Lamina propria für die nachgeschaltete ex vivo-Analyse isoliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Generierung eines chemisch induzierten Mausmodells für Colitis — eine entzündliche Darmerkrankung. Die Maus darf eine Dextran-Natriumsulfat (DSS)-Lösung für eine angemessene Dauer zu sich nehmen. Beim Verzehr schädigt DSS die Schleim- und Epithelschichtbarriere im Dickdarm, so dass Darmmikroben in das darunter liegende Gewebe eindringen können – wo sie von den ansässigen Immunzellen wahrgenommen werden, um eine übertriebene Immunantwort zu vermitteln,...

Eine Technik zur Generierung eines Mausmodells für Dextransulfat-Natrium-induzierte Kolitis

DNBS / TNBS induzierte Colitis bietet eine alternative und kostengünstige Methode, um die Pathobiologie von entzündlichen Darmerkrankungen zu untersuchen. Die in diesem Papier diskutiert Protokoll beschreibt die erfolgreiche Anwendung von DNBS Colitis bei Mäusen und Ratten zu induzieren, und erlaubt es, Host-Mediated-Darm-Reaktionen gründlich zu studieren.

DNBS / TNBS Colitis-Modelle: Einblicke in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Effekte von Nahrungsfett

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Wir beschreiben hier ein transgenes Reporter-Mausmodell, um die IL-22-produzierenden Zellen in verschiedenen Mausgeweben sichtbar zu machen. Mit dieser Methode kann die Position anderer Zytokine oder Sekretärsproteine in der Maus verfolgt werden.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Murine distalen Kolostomie bietet ein Mausmodell für menschliche Abzweigung Kolitis, eine vorwiegend lymphozytären Kolitis im Dickdarm-Segment aus dem fäkal Strom ausgeschlossen.

Murine distalen Kolostomie, ein neuartiges Modell Ablenkung Colitis bei C57BL/6 Mäusen

Das Protokoll stellt ein vollständig validiertes TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn und Methoden zur Visualisierung von Östrogenrezeptoren durch Immunhistochemie unter Verwendung der Immunfluoreszenz formalinfixierter Dickdarmabschnitte dar, die in Paraffin eingebettet sind.

Visualisierung von Östrogenrezeptoren bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn mit Immunfluoreszenz

In diesem Protokoll wird ein Darmmikrobiota-Antigen-spezifisches T-Zell-Adoptivtransfer-Kolitis-Modell beschrieben. CD4+ T-Zellen werden aus transgenen CBir1 TCR-Mäusen isoliert. Diese sind spezifisch für ein immundominantes Darmmikrobiota-Antigen CBir1 Flagellin, das in Empfänger-Rag1-/- Mäuse übertragen wird, was zu einer Darmentzündung führt.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

Ein neuer DC unabhängige Methode zur Induktion und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen beschrieben. HLA A2-Ig Basis künstlicher Antigen-präsentierende Zellen (AAPC) sind mit HLA-A2 restringierte Peptide effizient erweitern CTL verschiedener Antigen-Spezifität geladen. Diese Technologie birgt ein großes Potenzial für die CTL-basierte adoptiven Immuntherapie.

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

Erfahren Sie die Interaktion zwischen mononukleären Phagozyten und CD4-T-Zellen im antigengetriebenen Kolitis-Modell. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Ereignisse in der intestinalen Lamina propria und liefert Einblicke in die Pathogenese chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen.

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren (Video) | JoVE Journal

Entwicklung einer Präsentation von Antigenen zu studieren Antigen-driven ulcerosa Modell durch Antigen-präsentierende Zellen zu T-Zellen präsentieren

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