Ein Verfahren zur Auswahl Struktur-Schalt Aptamere zu einem Farbmetrik Gold-Nanopartikeln Assay angewandt
28. Februar 2015
Es wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele bereitgestellt, basierend auf einer einstellbaren Methode zur Auswahl magnetischer Beads. Aptamere, die mit strukturwechselnden Eigenschaften ausgewählt wurden, sind vorteilhaft für Assays, die eine Konformationsänderung erfordern, um das Vorhandensein eines Ziels zu signalisieren, wie z. B. der beschriebene Goldnanopartikel-Assay.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, strukturschaltende apti für die Integration als Erkennungselemente auf Detektionsplattformen zu generieren, die eine Änderung der Aptamerbestätigung bei der Zielbindung signalisieren. Dies wird durch Hinzufügen einer biotinylierten Fängersonde und einer komplementären DNA-Bibliothek zu Streptokokken-Tabin-beschichteten magnetischen Beads erreicht, um die DNA-Bibliothek auf der Bead-Oberfläche zu immobilisieren. Als nächstes wird ein Magnet auf die Lösung aufgebracht, um die Bindungssequenzen von den nicht bindenden Sequenzen, die auf den Kügelchen verbleiben, zu trennen.
Die zurückgehaltenen Sequenzen werden dann aufgereinigt und für die nächste Auswahlrunde amplifiziert. Nach einigen Auswahlrunden wird ein negativer Auswahlschritt in den Prozess eingefügt. Nach mehreren Auswahlrunden zeigt das ausgewählte aptr eine strukturelle Veränderung bei der Zielbindung basierend auf einem Goldnanopartikel-Zieldetektionsassay.
Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie der lösungsbasierten Zelle X besteht darin, dass wir das Ziel nicht an einer festen Stütze fixieren müssen. Die Implikationen dieser Technik liegen also in der Risikobewertung des physiologischen Zustands eines Individuums, und es ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Cortisol ein Indikator für Stress ist, der zur Bewertung von Gesundheitsproblemen führen kann. Verwenden Sie für dieses Protokoll immer frisch zubereitete DNA-Lösungen, speziell für das Ziel und die Kontrolle.
Die Präparation der DNA erfordert besondere Aufmerksamkeit. Übertragen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot der DNA-Bibliothek in ein Thermocycler-Röhrchen und erhitzen Sie es fünf Minuten lang in einem Thermomischer auf 95 Grad Celsius. Übertragen Sie dann das Röhrchen auf Eis, bis es benötigt wird, bevor Sie diese DNA verwenden, um ihre genaue Konzentration auf einem Spektralphotometer zu bestimmen.
Bereiten Sie als Nächstes die magnetischen Kügelchen vor, wirbeln Sie die kodierten magnetischen Kügelchen vor und übertragen Sie 400 Mikroliter davon in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie dieses Rohr für zwei Minuten auf den Magneten, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie dann die Perlen. Fügen Sie 400 Mikroliter Bindepuffer hinzu und wirbeln Sie sie ein, um die Wäsche abzuschließen.
Trennen Sie die Kügelchen mit einem Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Immobilisieren Sie als Nächstes die Einfangsonde auf den magnetischen Kügelchen.
Beginnen Sie mit der Resus-Suspendierung der Kügelchen und 400 Mikroliter Bindungspuffer mit einer 50-Mikromolar-Capture-Sonde. Dann inkubieren Sie die Kügelchen 10 Minuten lang unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur. Um die Sonde mit freiem Auffang zu entfernen, waschen Sie die Kügelchen noch dreimal wie zuvor mit 400 Mikrolitern Bindungspuffer pro Waschgang.
Fügen Sie nach den drei Wäschen weitere 400 Mikroliter Puffer hinzu und sammeln Sie 100 Mikroliter Bead-Lösung für die restlichen Schritte, während Sie den Rest bei vier Grad Celsius aufbewahren. Der Restbetrag kann für nachfolgende Auswahlrunden bis zu drei Wochen verwendet werden. Wenn mehr Kügelchen benötigt werden, können sie mit längeren Sonden vorbereitet werden, um die Stringenz in diesem Auswahlschema zu erhöhen.
Zum Beispiel wurden nach Runde 13 längere Sonden verwendet, wobei an diesem Punkt eine signifikante Anreicherung mit anderen Stringenzen erreicht wurde. Wenn Sie Kügelchen aus dem Lager verwenden, waschen Sie das Arbeitsaliquot zunächst zweimal mit 200 Mikrolitern Bindepuffer pro Waschgang. Ansonsten sind frisch hergestellte Perlen schon sauber.
Geben Sie nun 100 Mikroliter snap cool DNA zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Isolieren Sie nach der Inkubation die Kügelchen, bevor Sie den Überstand entsorgen. Berechnen Sie die Konzentration der enthaltenen DNA, um zu bestimmen, wie viel DNA an die Kügelchen gebunden ist.
Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal mit 200 Mikrolitern Bindepuffer. Lassen Sie den Bindepuffer die Kügelchen jeweils fünf Minuten lang unter leichtem Rühren waschen. Bereiten Sie dann das Zielmolekül in Bindungspuffer bei 100 Mikromolaren vor und resuspendieren Sie die Kügelchen in 200 Mikrolitern dieses Präparats, dem Zielmolekül.
In diesem Fall ist Cortisol in der ersten Auswahlrunde typischerweise hoch konzentriert. Inkubieren Sie die Kügelchen mit dem Target eine halbe Stunde lang unter leichtem Rühren bei Umgebungsbedingungen. Speichern Sie nach der Inkubation die Snat mit den angedeuteten Zielsequenzen.
Nach jeder zweiten Anreicherungsrunde ist eine Probe aus dem endgültigen Überstand zu entnehmen, um den Prozess zur Überwachung zu überwachen. Entfernen Sie das Cortisol durch Dialyse aus dem Überstand. Dies kann übersprungen werden, wenn das Zielmolekül die Messung der DNA-Absorption bei 260 Nanometern nach jeder Runde nicht beeinträchtigt, die Zielbindungs-DNA mittels PCR unter Verwendung des gesammelten Überstands aus dem positiven Selektionsschritt als Vorlage amplifizieren.
Führen Sie vorläufig immer eine kleine Test-PCR durch, um die optimale Anzahl an Amplifikationen zu bestimmen. Entnehmen Sie nach jedem Zyklus 10 Mikroliter Proben und vergleichen Sie die Proben mit einer Leiter mit 25 Basenpaaren. Hier sollte die Bibliothek mit 85 Basenpaaren über amplifizierten Produkten nach dem 10. Zyklus laufen, so dass weniger Zyklen verwendet werden sollten.
Dieses Ergebnis kann von Runde zu Runde variieren, so dass immer ein Testlauf notwendig ist. Führen Sie dann eine PCR in großem Maßstab mit der ausgewählten Anzahl von Zyklen unter Verwendung von acht Streifenröhrchen durch. Amplifizieren Sie sechs bis acht Milliliter des Reaktionsgemischs, um die erforderliche Menge an Amplikon für die nächste Auswahlrunde zu erhalten, die zwischen einem und 2,5 Nanomol DNA liegt.
Überprüfen Sie eine Probe der PCR-Produkte mit einem Gel. Wandeln Sie dann den Großteil der Produkte mit nichtmagnetischen, mit Stepp beschichteten Kügelchen in einzelsträngige DNA um. Laden Sie 300 Mikroliter Kügelchen in eine kleine Säule, die von Fritz blockiert wird.
Waschen Sie dann die Kügelchen mit einer Lockspritze vorsichtig mit fünf Millilitern Bindepuffer. Wenn Sie die Lösung zum Waschen der Säule wechseln, entfernen Sie die Spritze aus der Säule und entfernen Sie den Kolben aus der Spritze. Dadurch wird eine unnötige Störung der Perlen vermieden.
Erstellen und waschen Sie genügend Bead-Säulen für einen Milliliter PCR-Produkt pro Säule. Führen Sie ein PCR-Produkt mit leichtem Druck durch die Säulen. Die DNA-Produkte werden von den Kügelchen zurückgehalten, die an ihren Antisense-Strängen befestigt sind.
Waschen Sie dann die DNA-gebundenen Säulen mit fünf Millilitern Bindungspuffer, um alle PCR-Komponenten zu entfernen, und lassen Sie nur die DNA des Bindungspools übrig, um die DNA aus der Säule zu dehybridisieren, und fügen Sie 0,5 Milliliter 0,2 molares Natriumhydroxid hinzu. Anschließend wird die einzelsträngige DNA im eit mit einer Entsalzungssäule entsalzt, die mit nukleasefreiem Wasser hergestellt wurde. Entsorgen Sie die anfänglichen 0,5 Milliliter Durchfluss.
Lassen Sie dann einen Milliliter nukleasefreies Wasser durch die Säule, um die entsalzte DNA zu sammeln. Messen Sie die Absorption der gesammelten DNA und bereiten Sie sie für die nächste Selektionsrunde vor. Wie im Textprotokoll beschrieben, wird die gesammelte einzelsträngige DNA nun wieder zu einem frisch präparierten Aliquot von Kügelchen hinzugefügt, das mit der Capture-Sonde präpariert wurde.
Die zweite Auswahlrunde ähnelt der ersten, wobei eine niedrigere Cortisolkonzentration verwendet wird. Ab der dritten Runde sollten Sie jedoch einen negativen Auswahlschritt vor der positiven Auswahl einbauen. Für die erste Runde der negativen Selektion fügen Sie den Kügelchen 200 Mikroliter eines mikromolaren Progesterons in Bindungspuffer hinzu.
Es ist strukturell ähnlich, unterscheidet sich aber von Cortisol. Erhöhen Sie in den folgenden Runden die Progesteronkonzentration, nachdem Sie die Mischung eine halbe Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt haben. Entsorgen Sie das Supinat und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 200 Mikrolitern des Bindungspuffers.
Fahren Sie dann mit der Positivauswahl fort. Wie bereits beschrieben, variierte die Konzentration des Substrats im Verlauf der Runden, um die Strenge des Auswahlprozesses zu beeinflussen. Details werden im Textprotokoll besprochen.
Befolgen Sie als Nächstes das Textprotokoll, um den Goldnanopartikel-Assay für den Cortisol-Nachweis durchzuführen. Diese schnelle und unkomplizierte Auslesung der Farbmetrik beruht auf einer strukturellen Veränderung des Aptamers bei der Zielbindung. Somit bietet es eine Metrik zur Bewertung der Fähigkeit der Methode, Aber mit Strukturwechseleigenschaften auszuwählen.
Ein weiterer Vorteil des Goldnanopartikel-Assays besteht darin, dass er ein Signal so verstärkt, dass ein mikromolares Affinitätsaptamer, das kleinen Molekülen gemein ist, in Konzentrationen nachgewiesen werden kann, die um Größenordnungen niedriger als die Dissoziationskonstante sind. Das folgende Selektionsprotokoll wurde verwendet, um Cortisol-spezifische Abers zu isolieren. Dialyse- und Anreicherungsmonitoring wurden eingesetzt, um nach späteren Selektionsschritten eine erhöhte Elution des Zielmoleküls zu zeigen.
Eine Abnahme der Elution wurde beobachtet, wenn in den letzten Schritten weniger Zielmoleküle und längere Einfangsonden verwendet wurden. Next Generation Sequencing wurde verwendet, um die entgangene DNA nach mehreren verschiedenen Runden zu analysieren. Zu Beginn der sechsten Auswahlrunde hatte ein geringer Prozentsatz der Sequenzen eine erhöhte Kopienzahl, die nach 13 Runden in 20 Bins eingestuft wurde.
Ein viel größerer Prozentsatz der Abers hatte eine hohe Kopienzahl. Dann, indem wir den Auswahlprozess strenger gestalten. In den Runden 14 und 15 befand sich fast die Hälfte der ausgewählten Aber im ersten Rang der Kopienzahlhäufigkeit.
Zu diesem Zeitpunkt gab es etwa 3000 einzigartige Sequenzen in 30.000 Durchläufen. Der ausgewählte AP wurde mit Goldnanopartikeln inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Ziel- oder Vergleichskontrollsubstraten. Dieser Assay zeigte, dass der AP eine höhere Spezifität für Cortisol als für Koliksäure oder für Cortisol aufwies.
Es ist wichtig, die Strenge der Auswahl in jeder Runde zu kontrollieren und die Anzahl der PCR-Zyklen zu optimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Struktur-Switching-AP auswählen und einen Goldnanopartikel-Detektionsassay durchführen.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele mithilfe einer Magnetperlen-Auswahlmethode vorgestellt. Die ausgewählten Aptamere zeigen Konformationsänderungen nach Bindung an das Zielmolekül, was für Nachweisassays von Vorteil ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologie
- Molekularbiologie
- analytische Chemie
Hintergrund
- Aptamere sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die an spezifische Zielstrukturen binden können.
- Strukturwechsel-Aptamere ändern ihre Konformation nach der Bindung an das Zielmolekül, wodurch die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird.
- Goldnanopartikel-Assays nutzen diese Konformationsänderungen zur Signalgebung.
- Diese Methode ermöglicht den Nachweis kleiner Moleküle, ohne das Zielmolekül immobilisieren zu müssen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Auswahl strukturwechselnder Aptamere.
- Verbesserung der Nachweismethoden für kleine Moleküle wie Cortisol.
- Beurteilung physiologischer Zustände anhand von Stressindikatoren.
Verwendete Methoden
- Biotinylierte Capture-Proben und eine komplementäre DNA-Bibliothek werden mit magnetischen Kügelchen verwendet.
- Mittels magnetischer Trennung werden Bindungssequenzen von Nicht-Bindungssequenzen isoliert.
- Mehrere Runden von Selektion und Amplifikation werden durchgeführt, um die gewünschten Aptamere anzureichern.
- Goldnanopartikel-Assays werden genutzt, um die Funktionalität der Aptamere nachzuweisen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Selektion von Aptameren, die strukturelle Veränderungen bei der Bindung an das Zielmolekül zeigen.
- Nachgewiesene Wirksamkeit bei der Detektion von Cortisol als Stressindikator.
- Das Protokoll ermöglicht die Verwendung frisch hergestellter DNA-Lösungen für optimale Ergebnisse.
- Die Anreicherung von Aptameren verbessert sich mit längeren Sonden und erhöhter Stringenz.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Auswahl von Strukturwechsel-Aptameren.
- Diese Aptamere können die Empfindlichkeit von Assays zur Detektion kleiner Moleküle verbessern.
- Der Ansatz weist potenzielle Anwendungen in der Gesundheitsbewertung im Zusammenhang mit Stress auf.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Auswahl von strukturwechselnden Aptameren für kleine Molekülziele ohne Zielimmobilisierung und unterstützt so die Entwicklung von Biosensoren für physiologische Biomarker. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem er Aptamere anreichert, die bei der Bindung eine Konformationsänderung durchlaufen, und somit falsch-positive Ergebnisse durch unspezifische Bead-Interaktionen verringert. Er bietet einen wiederverwendbaren Entdeckungsworkflow für die Assay-Entwicklung in der frühen Arzneimittelentwicklung, insbesondere für Ziele wie Cortisol, bei denen ein schneller, farbmetrischer Nachweis für dezentrale Tests von Wert ist. Der Schwerpunkt des Protokolls auf negativer Selektion und Verlängerung der Sondenlänge verbessert die Stringenz und unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen, indem Hintergrundsequenzen minimiert und Bindemoleküle mit hoher Affinität angereichert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Auswahl von Aptameren, die eine zielinduzierte Konformationsänderung durchlaufen, und liefert damit eine funktionelle Bestätigung der Bindungsspezifität.
- Operativer Wert: Macht die Immobilisierung des Targets überflüssig, vereinfacht den Arbeitsablauf und verringert Artefakte durch oberflächenbasierte Wechselwirkungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem Sequenzen angereichert werden, die nachweislich eine strukturelle Schaltfunktion aufweisen, und erhöht so das Vertrauen in das Target-Engagement.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Aptamere, die mit Gold-Nanopartikel-Assays kompatibel sind, und ermöglicht eine quantitative, farbimetrische Auswertung für Hochdurchsatz-Screenings.
- Operativer Wert: Erzeugt standardisierte Bindungspools durch wiederholte Selektion und Amplifikation und verbessert so die Reproduzierbarkeit des Assays zwischen verschiedenen Durchläufen.
- Skalierbarkeit: Die verlängerte Länge der Capture-Probe nach Anreicherung erhöht die Stringenz und ermöglicht die Wiederverwendung der Selektionsplattform für mehrere Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Ausgewählte Aptamere weisen Nachweisfähigkeit in Puffer auf, was eine Grundlage für die Erweiterung auf physiologische Flüssigkeiten wie Speichel oder Schweiß bildet.
- Biomarker-Abstimmung: Der Nachweis von Cortisol entspricht der Überwachung stressbezogener Biomarker und ist relevant für die Beurteilung des physiologischen Zustands in präklinischen Sicherheitsstudien.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Die Anreicherungsüberwachung mittels Elution und Sequenzierung ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Spezifität der Aptamere und der Kopienzahlhäufigkeit.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Identifizierung ein und ermöglicht den Übergang von der Aptamer-Auswahl zur Entwicklung funktioneller Assays für den Nachweis kleiner Moleküle.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Isolierung von Aptameren, die zielinduzierte strukturelle Veränderungen widerspiegeln, und klärt Bindungsmechanismus und -spezifität auf.
- Screening: Liefert assaysbereite Aptamere mit nachgewiesener Leistung in kolorimetrischen Formaten und ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen oder Liganden.
- Analytik: Bietet quantitative Ergebnisse über die Signalverschiebung von Goldnanopartikeln und erlaubt den Vergleich von Bindungsbedingungen und Anreicherungsfortschritten.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeitsabläufe an, indem beweisbasierte Daten aus Pufferexperimenten bereitgestellt werden, die eine spätere Anpassung an komplexe Matrizes unterstützen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die magnetische Bead-Selektion mit modifizierbarer Sondenlänge schafft eine wiederverwendbare Plattform für mehrere kleine Molekülziele und reduziert den Aufwand für erneute Entwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem Aptamere mit nachweisbarem konformationellen Umschalten ausgewählt werden, wodurch mechanistische Unklarheiten verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch negative Selektionsschritte und definierte Waschprotokolle und minimiert so die Variabilität zwischen Chargen.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine frühzeitige Beurteilung der Aptamer-Funktionalität ermöglicht wird und somit Investitionen in nicht tragfähige Kandidaten reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung durch Verfolgung der Anreicherung und Sequenzierungsdaten und leitet daraus die Weiterentwicklung auf Grundlage der Dominanz der Kopienzahl und Spezifität ab.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nukleinsäuren, der magnetischen Bead-Separation und der PCR-Optimierung, um Amplifikationsverzerrungen zu vermeiden.
- Benötigt magnetische Separationsausrüstung, Thermocycler und Spektrophotometrie zur DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Bedingungen des Bindungspuffers und der Verwendung negativer Selektionsverbindungen (z. B. Progesteron), um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Die Anpassung an physiologische Flüssigkeiten kann eine Optimierung der Salzkonzentration und Temperatur erfordern, um die Stabilität der Aptamere und deren Zielbindung aufrechtzuerhalten.
- Praktische Einschränkung: Die Trenneffizienz ist durch die Notwendigkeit begrenzt, die Schmelztemperatur nahe Raumtemperatur zu halten, was mehrere Selektionsrunden zur Reduzierung des Hintergrunds erfordert.
