Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke aufzubauen, das der natürlichen Haut ähnelt, und mit Hilfe eines automatisierten Wundgeräts präzise und reproduzierbare Wunden unter sterilen Bedingungen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre humane dermale Fibroblasten in ein Kollagen-Ein-Hydrogel eingebettet werden. Als nächstes sitzen die primären humanen epidermalen Keratinozyten auf der Oberseite des mit Fibronektin beschichteten Hydrogels.

Dann wird das Modell unter getauchten Bedingungen kultiviert, und dann wird unter einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ein dreidimensionales Hautäquivalent in voller Dicke gebildet, das aus einer dermalen Komponente und einer mehrschichtigen Epidermis besteht. Abschließend wird eine standardisierte Wunde in einer sterilen Umgebung erzeugt. Letztendlich werden immunhistochemische Färbungen und Mikroskopie verwendet, um die histologische Struktur des verwundeten Hautäquivalents in voller Dicke zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden, wie z. B. Tiermodelle, besteht darin, dass das Hautäquivalent in voller Dicke aus primären menschlichen Zellen besteht. Zusammen mit dem automatisierten Wundgerät können wir also standardisierte Wunden erzeugen, so dass das automatisierte Wundgerät einen Einblick in die Heilungsprozesse von Hautwunden in einer humanisierten Umgebung geben kann. Es kann auch auf unsere Systeme wie das Bone Tissue Engineering angewendet werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Wundheilung zu beantworten, wie z. B. biologische Prozesse, die zugrunde liegende Hautreparatur und die zelluläre Wechselwirkung zwischen der epidermalen und dermalen Komponente. Lösen Sie zunächst Kollagen mit 0,1 % Essigsäure bis zu einer Endkonzentration von sechs Milligramm pro Milliliter auf. Bereiten Sie die Gel-Neutralisationslösung vor, indem Sie 232,5 Milliliter von zwei X dmm, 7,5 Milliliter FCS, 7,5 Milliliter von drei Molaren und 2,5 Milliliter von fünf Milligramm pro Milliliter mischen.

Chondroitinsulfat wird in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte eingesetzt, humane dermale Fibroblasten oder HDFS abgelöst und die Zellsuspensionen fünf Minuten lang zentrifugiert. Bei 270 G werden die Zellen gezählt und ein Eloqua mit 1.200.000 HDF fünf Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie bei 270 g die Schlinge und verwenden Sie vier Milliliter abgekühlte Gel-Neutralisationslösung, um das HDF vorsichtig zu resuspendieren, ohne Luftblasen zu verursachen.

Dann resuspendieren Sie die Lösung mit acht Millilitern Kollagenlösung. Verwenden Sie anschließend eine mehrstufige Pipette und geben Sie 500 Mikroliter Kollagenzellmischung zu jedem Einsatz. Inkubieren Sie die Gele in der 24-Well-Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, damit sich die Gele verfestigen können.

Verwenden Sie dann zwei Milliliter DMM plus 10 % FCS pro Vertiefung. Um die Gele einzutauchen, inkubieren Sie die Gele 24 Stunden lang. Verwenden Sie Reinstwasser, um das menschliche Fibronektinprotein auf eine Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter aufzulösen.

Nachdem Sie die dermalen äquivalenten Gele 24 Stunden lang inkubiert haben, entfernen Sie das Medium. Verwenden Sie 25 Mikroliter Fibronektinlösung, um jedes dermale Äquivalent abzudecken, und inkubieren Sie die Gele 30 Minuten lang. In der Zwischenzeit resuspendieren Sie die menschliche Epidermis, Keratinozyten oder HKS mit kgm zwei plus 5% FCS auf eine Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Liter Samen, 100.000 Heeks auf jedem Gel.

Inkubieren Sie dann Gele für 45 Minuten, damit die Zellen mit kgm two ready plus 5% FCS haften können, tauchen Sie die Zellen ein und setzen Sie die Inkubation fort. Nach zwei- bis dreitägiger Inkubation ersetzen Sie das Medium durch 2 %FCS, gefolgt von einem mittleren Austausch ohne FCS zwei bis drei Tage später. Tag sieben, entfernen Sie das Medium vollständig.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um jeden Einsatz in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu platzieren. Fügen Sie dann 1,5 Milliliter Airlift-Medium pro Vertiefung hinzu. Achten Sie darauf, die Oberfläche des FTSC nicht zu benetzen.

Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage für weitere 14 Tage. Bereiten Sie die automatische Aufwickelvorrichtung vor, indem Sie 70 % Ethanol und ultraviolettes Licht verwenden, um den Arbeitsbereich mit einer sterilen Pinzette zu desinfizieren. Platzieren Sie die Hautäquivalente in den dafür vorgesehenen Bereichen der Trägerplatte der Autoklavenprobe.

Setzen Sie eine Probenträgerplatte in die Buchse unterhalb des Bohrkopfes ein. Verwenden Sie die Steuerungssoftware, um die Verwundungsparameter wie folgt einzustellen. Schleudergeschwindigkeit 15.000 U/min Durchdringung, 1,5 Millimeter.

Antrieb 100 Hertz. Übertragen Sie die Verwundungsparameter an die automatische Verwundungsvorrichtung. Beginnen Sie mit der Verwundung, wenn Sie fertig sind.

Entfernen Sie die Probenträgerplatte aus der Pfanne und übertragen Sie das verwundete FTSE mit einer sterilen Pinzette zurück in den Einsatz, der für die Kultivierung verwendet wurde. Inkubieren Sie den verwundeten FTSE bis zur experimentellen Bewertung. Nutzen Sie die Modelle für seine histologische Analyse jederzeit.

Die isolierten HDFS und HKS wurden durch immunhistochemische Färbung charakterisiert, bevor sie für FTSE verwendet wurden. Die HDF sind positiv für Menton, einen Marker für Fibroblasten primäres HEK-Protein CYTOKERATIN 14, aber fast kein spätes Keratinozyten-Differenzierungsprotein CYTOKERATIN 10. Die FTSE wurden sieben Tage lang unter den Bedingungen des getauchten Mediums kultiviert, gefolgt von 14 Tagen an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit.

Während dieses Prozesses schrumpft die FTSC innerhalb von 21 Tagen erheblich. Die HEK vermehren sich, indem sie die mittlere Stufe so verändern, dass die Oberfläche der Modelle der Luft ausgesetzt ist. Und durch die Erhöhung der Kalziumkonzentration werden die HKS stimuliert, sich in eine mehrzellige Epidermis zu differenzieren, die aus mehreren lebenswichtigen Zellschichten von Keratinozyten besteht.

In verschiedenen Zuständen der D-Differenzierung und der Atrium-Hornhaut. Vergleicht man die Hämatin- und Eosin-Färbung von FTSE mit der nativen menschlichen Haut, so wird deutlich, dass FTSE die histologische Architektur der Haut nachahmt. Das HDF im Kollagen-Ein-Hydrogel kann mit primären Antikörpern gegen Vimentin gefärbt werden.

Darüber hinaus bilden Keratinozyten eine epidermale Schicht, die aus Cytokeratin 14-positiven Zellen und dem Marker für die späte Differenzierung besteht. CYTOKERATIN 10 wird in den superbasalen Schichten exprimiert. Darüber hinaus ist das St.Stratum cornium nach seiner Entwicklung positiv für RIN.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Dermatologie den Weg zur Erforschung der kutanen Wundheilung und eines standardisierten In-vitro-Aufbaus, der der menschlichen Haut sehr nahe kommt.