Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

In vitro oder konstruierte menschliche Epidermis-Modelle wurden erstmals in den neunziger Jahren mit dem primären Ziel entwickelt, alternative Testmethoden zu Tierversuchen zu entwickeln. Diese epidermalen 3D-Modelle werden heute häufig verwendet, um sowohl die Sicherheit als auch die Wirksamkeit kosmetischer Inhaltsstoffe zu testen. Während es von mehreren Tissue-Lieferanten erworben werden kann, bietet die Möglichkeit, ein 3D-Modell in einem Labor zu rekonstituieren, mehr Flexibilität für den Endpunkt von Interesse.

Es gibt mehrere Forschungsartikel, die kurz das Rekonstitutionsprotokoll eines 3D-Epidermismodells beschreiben, aber bis heute war kein Video verfügbar, das die kritischen Schritte des Rekonstitutionsprozesses zeigt. Dies ist der Grund für die Veröffentlichung dieses Videopapiers. Die Herstellung der selbst rekonstruierten menschlichen Epidermis ermöglicht viel Freiheit im Kultivierungsprozess, wie z.B. Veränderungen der Zusammensetzung des Kulturmediums, entzündungsfördernde oder oxidative Stressauslöser, Stummschaltung von interessierenden Genen und die Hemmung oder Stimulation bestimmter biologischer Prozesse.

Um zu beginnen, tauen Sie eine Durchstechflasche mit 1 Million kryokonservierten normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten oder NHEKs in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf, indem Sie einen Teil der Durchstechflasche in Wasser tauchen. Inkubieren Sie die Durchstechflasche für ein bis zwei Minuten im Wasserbad, bis nur noch ein kleiner Splitter Eis sichtbar ist. Resuspendieren Sie die Zellen sehr vorsichtig, indem Sie zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren.

Die Zellsuspension wird in zwei T75-Kolben mit insgesamt 15 Millilitern vorgewarntem Auftaumedium überführen, was zu einer Aussaatdichte von 6,7 mal 10 bis zu den vierten Zellen pro Zentimeter Im Quadrat führt. Füllen Sie 24 Well-Platten mit 1,5 Millilitern Tauchmedium vor, idealerweise mit einer Spenderpipette. Nachdem die Zellen auf 80% Konfluenz kultiviert wurden, sind sie bereit für die Aussaat in Einsätzen für die Kultivierung der rekonstruierten menschlichen Epidermis oder RHEs.

Entfernen Sie das Basalmedium mit den NHEKs aus den T75-Kolben. Spülen Sie die Zellen aus, indem Sie fünf Milliliter vorgewärmtes PBS in jeden T75-Kolben geben, und entfernen Sie dann das PBS aus den Kolben. Geben Sie zwei bis drei Milliliter vorgewärmtes 0,05% Trypsin-EDTA in jeden Kolben und stellen Sie sicher, dass die Trypsinlösung gleichmäßig auf dem Zellkulturbereich des Kolbens verteilt ist.

Legen Sie die Kolben für vier Minuten in den Zellkulturinkubator und überprüfen Sie dann, ob sich die Zellen mit dem Mikroskop bei einer 10-fachen Vergrößerung lösen. Rappen Sie den Kolben, um den Zellen zu helfen, sich von der Oberfläche des Kolbens zu lösen. Sobald alle Zellen abgelöst sind, fügen Sie jedem T75-Kolben ein gleiches Volumen vorgewärmten Trypsin-Inhibitor hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension von den Kolben in ein Zentrifugenröhrchen.

Spülen Sie die Kolben mit fünf Millilitern vorgewärmtem PBS aus und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen mit der Zellsuspension. Zentrifugieren Sie die geernteten Zellen fünf Minuten lang bei 400 mal G. Entsorgen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 100 bis 200 Mikroliter in der Röhre.

Streichen Sie vorsichtig mit den Fingern auf das Röhrchen, um das Pellet vorsichtig zu lösen. Kehren Sie das Pellet der Zellen vorsichtig in einem geringen Volumen des untergetauchten Mediums wieder auf und ab und pipettieren Sie es 5 bis 10 Mal, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Beginnen Sie mit einem geringen Volumen, um die Bildung von Zellaggregaten zu vermeiden, und addieren Sie bis zu einem Milliliter eingetauchtes Medium pro anfänglichem T75-Kolben.

Zählen Sie die Zellen in der Suspension mit der Trypanblau-Ausschlussmethode. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit zusätzlichem untergetauchtem Medium, um eine Konzentration von 3,525 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter zu erreichen, wobei die erste Im Textmanuskript enthaltene Gleichung verwendet wird. Führen Sie eine zweite Zellzählung der verdünnten Lösung durch und verwenden Sie die zweite Gleichung im Textmanuskript, um das Zellsuspensionsvolumen zu berechnen, das in den Kultureinsatz eingesät werden soll.

Hängen Sie die 24 Well Culture Inserts in die höchste Position der Trägerplatte und übertragen Sie die Trägerplatte auf die 24 Well Plate, die mit tauchgetauchtem Medium vorgefüllt ist. Fügen Sie das bestimmte Volumen der Zellsuspension zu jedem Einsatz hinzu und achten Sie darauf, den Einsatz nicht zu berühren. Nach der Aussaat die 24 Vertiefungsplatten 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um einen Kanteneffekt zu überwinden.

Bewegen Sie die Platten während dieser Zeit nicht. Übertragen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator und lassen Sie sie drei Tage lang untergetauchten Bedingungen. Setzen Sie nach einer dreitägigen Inkubation im Zellkulturinkubator die Zellen, die an der Membranoberfläche haften, der Luftflüssigkeitsschnittstelle (ALI) aus, indem Sie das untergetauchte Medium mit einem Aspirationssystem und einer Pasteur-Pipette aus glasartigem Fach aus dem apikalen Kompartiment entfernen.

Füllen Sie neue 24 Well-Platten mit 1,5 Milliliter frischem vorgewärmtem ALI-Medium und übertragen Sie die Trägerplatten mit den Kultureinsätzen auf die neuen Multi-Well-Platten. Übertragen Sie die Multi-Well-Platten zurück in den Zellkultur-Inkubator. Aktualisieren Sie das ALI-Medium alle zwei bis drei Tage für 14 Tage.

Keratinozyten in 2D-Kultur zeigen eine traditionelle Morphologie mit einer konsistenten polygonalen Form. Nach 15 Tagen bei ALI bildet die rekonstruierte menschliche Epidermis ein vollständig geschichtetes Gewebe, das durch seine vier epidermalen Hauptschichten angezeigt wird. Die ultrastrukturelle Analyse der rekonstruierten menschlichen Epidermis zu verschiedenen Zeitpunkten im Rekonstitutionsprotokoll zeigt den Verhornungsprozess mit einer erhöhten Anzahl von Hornhautschichten im Laufe der Zeit.

Keratinozyten in der Epidermis zeigen je nach Differenzierungsstadium unterschiedliche Proteinexpressionsprofile. Die Involucrinexpression tritt häufiger in der SG-Schicht auf, während sich die Expression von Filaggrin und Loricrin in den oberen Schichten befindet. Keratin-10-Expression wurde in allen lebensfähigen Schichten mit Ausnahme der SB-Schicht gefunden.

Die rekonstruierte menschliche Epidermis weist funktionelle desmosomale Verbindungen auf, wie die Expression von Desmoglein-1 im Interzellularraum der lebensfähigen epidermalen Schichten zeigt. Die Barriereeigenschaften des rekonstruierten Epidermismodells wurden untersucht, indem die Lebensfähigkeit des Gewebes bei topischer Behandlung mit einem bekannten Barrierestörer bewertet und die Gewebeintegrität bewertet wurde. Die Gewebeintegrität wurde nach 15 Tagen durch Messung des TEER mit einem Voltmeter bestimmt.

Die Reaktionsfähigkeit der Epidermis auf Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor alpha wurde untersucht. Sowohl LPS- als auch TNF-Alpha-Behandlungen waren ungiftig. relativ zur Triton X-100 Steuerung.

Die Freisetzung von Interleukin-1 alpha und Interleukin-8 im RHE-Medium wurde mittels IL-Lyse quantifiziert. Die LPS-Behandlung führte zu einer statistisch signifikanten Hochregulierung bei der Freisetzung von Interleukin-1 alpha und Interleukin-8. Die TNF-alpha-Behandlung führte zu einer statistisch signifikanten Hochregulierung nur bei der Freisetzung von Interleukin-1 alpha.

Eine deutliche Tendenz zu erhöhten Interleukin-8-Spiegeln wurde jedoch auch bei Stimulation mit TNF alpha beobachtet. Nach diesem Protokoll kann TEER als Wert für die Integrität der Barriere gemessen werden. Die Lebensfähigkeit oder Zytotoxizität kann beispielsweise durch einen MTT- oder LDH-Assay gemessen werden.

Der Überstand kann verwendet werden, um die Sekretion von Zytokinen oder anderen Proteinen zu messen. Darüber hinaus kann das Gewebe verwendet werden, um die Expression von Proteinen oder Genen von Interesse zu untersuchen.