Name: Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Lernen Sie sondenbasierte Echtzeit-PCR zur quantitativen Messung von microRNAs in Plasma- und Serumproben. Diese Methode ermöglicht die Entdeckung neuer Biomarker für Krebs und Diabetes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Alle Autoren erkennen die Infrastruktur Unterstützung der NHMRC CTC, University of Sydney, der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien und den Rebecca Cooper Foundation, Australien. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Australian Research Council (FT110100254) und der JDRF, Australien (CRN201314) finanziert, um WW, RJF AAH und MVJ durchgeführt alle Nasslabor Experimente durchgeführt ASJ Datenanalyse. WW schrieb den ersten Entwurf. AAH geplant das Studium und die Daten analysiert. Alle Autoren lesen und einigten sich auf die endgültige Fassung der Handschrift, Zahlen und Arbeitsblätter zur Veröffentlichung eingereicht.

<ol><li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+animal+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li>
<li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478(2010).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development%2C+regeneration+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li>
<li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Endocrinol+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li>
<li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li>
<li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24(2006).</li>
<li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89(2009).</li>
<li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li>
<li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Endocrinol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li>
<li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148(2008).</li>
<li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li>
<li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792(2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292(2014).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294(2013).</li>
<li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li>
<li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury%3A+A+TaqMan%28R%29+Low+Density+Array+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms%3A+microarray%2C+beads+array%2C+and+quantitative+real-time+PCR+array%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167(2011).</li>
<li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123(2006).</li>
<li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+microarray+profiling%2C+real-time+PCR%2C+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li>
<li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR%2C+how+to+use+it+and+what+is+available%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li>
<li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta,, V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368(2012).</li>
<li>TPF & SPF File Download Options [Internet]. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html">http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/products/tpf-spf-download.html</a> (2014).</li>
<li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
</ol>

Artikel Verarbeitung / Veröffentlichungskosten wurden von Life Technologies fallen, nach der Annahme des Manuskripts zur Veröffentlichung.

Die kritischen Schritte innerhalb der Sonde qPCR-basierte Protokolle, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sind Sie sicher, dass es 1) das gleiche Volumen und die Konzentration der RT-Produkt wird in jedem qPCR Reaktions geladen, 2) die richtigen Verhältnisse und Mengen der Komponenten benötigt qPCR Reaktion vorbereitet und gut gemischt, 3) die korrekte und einheitliche Volumina sind miteinander qPCR Reaktion gegeben, und 4) die Vorbereitung und Laden von jeder Probe und Reaktionsgemisch wird in kürzester Zeit wie möglich durchgeführt, während immer noch darauf achten, die obigen kritischen Schritte bereits erwähnt. Die Mikrofluidik Array Karten müssen geeignete Zentrifuge und spezifische Eimer. Jede Schaufel kann bis zu 3 Karten (beladen / leer) zu halten. Achten Sie immer darauf, dass alle 3 Slots eines Becher belegt sind und die Schaufel, indem ähnliche Eimer (Eimer dies sollte auch 3 Karten, entweder leer oder voll enthalten) in die entgegengesetzte Schlitz der Zentrifuge ausgeglichen. Beim Aufsetzen der Karte in der bucket Halter, stellen Sie sicher, dass die 8 Stauseen projizieren nach oben und Reaktionsfeldern vor der Außenwand der Zentrifuge. Dreh die Karten bei 331 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Nach dem ersten Durchlauf, öffnen Sie die Zentrifuge und optisch sicher, dass die Reaktionsmischung wurde durch die 384 Vertiefungen verzichtet. Wiederholen Sie den Spin bei gleichen Einstellungen für ein weiteres Mal. Entfernen Sie die Karte aus Eimer und sicherzustellen, dass das Niveau der Reaktionsmischung in jedem der acht Stauseen einheitlich ist. Etwaige Unstimmigkeiten bei den in den Behältern links Flüssigkeitsvolumen machen die Karte ungeeignet zum weiteren Gebrauch. Um die gleiche Konzentration der RT-Produkt haben, wird dieselbe Eingangskonzentration von RNA in jedem RT-Reaktion gegeben. Die Gesamt-RNA-Konzentration wird unter Verwendung eines Mikro volumespectrophotometer gemessen. Die beobachtete 260/280 Verhältnis so niedrig wie 1.3 für die RNA aus Plasma / Serum isoliert werden; dies scheint nicht zu wirken auf den nachgelagerten qPCR bezogene Verfahren oder Daten erzeugt 30. Ebenso ist die 260/280 Verhältnisdie hier getesteten RNA-Proben lagen zwischen 1,3 bis 1,7 ohne abnormale Effekte in der qPCR beobachtet. Bei Verwendung einer geringen Gehalt an RNA-Proben, wie die aus biologischen Flüssigkeiten, kann es schwierig werden, um RNA vor der Verarbeitung zu quantifizieren. Wir empfehlen die Verwendung von synthetischen Spike-in an der RNA-Isolierung sowie die reverse Transkription Stufen. Nach unserer Erfahrung Arabidopsis thaliana miRNA-Kandidaten (ath-miR-159a und ath-miR-172a) über Caenorhabditis elegans miRNAs (wie cel-miR-39 oder cel-miR-54), die in unserer Erfahrung können höher sind bevorzugt Homologie als die von A. thaliana. Die Verwendung einer solchen stufenspezifischen Spike-in kann für die Normalisierung der miRNA Daten über mehrere Proben zu verschiedenen Zeitpunkten getestet ausmachen. Mit einem festen Eingangslautstärke von RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion wird auch empfohlen 32,33. Die drei Sonden-basierte Protokolle für miRNA Quantifizierung hier beschriebenen erfordern unterschiedliche MengenGesamt-RNA-Eingang, unterschiedliche Workflows und Kosten. Jeder der Abläufe sind entworfen, um unterschiedliche Durchsätze, basierend auf der Anzahl der miRNA und der Anzahl der zu analysierenden Proben zu bieten. Mit zunehmendem Durchsatz (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), die Kosten pro Reaktion mit einer Zunahme in der Menge an Daten über eine Zeiteinheit erhalten wird. Da alle diese Plattformen nutzen TaqMan Chemie, kann die Qualität der erhaltenen Daten erwartungsgemäß ähnlich sein werden. TaqMan qPCR ist ein etabliertes Verfahren zur Identifizierung der Fülle von miRNAs im Serum / Plasma Proben 9,11,27. Obwohl die drei Plattformen hier diskutierten dieselbe Chemie, eine Abnahme der Reaktionsvolumen führt zu einer Verringerung des dynamischen Bereichs des Transkripts Detektion (Farr RJ et al., Unveröffentlichte Daten). Der 96-Loch-qPCR-Plattform ist eine geringeren Durchsatz, aber hohe Empfindlichkeit Plattform und unserer Ansicht nach der &quot;Goldstandard&quot; für alle sondenbasierten (oder dye based) PCR-Plattformen. Dies kann jedochdie wirtschaftlichste und effiziente Plattform nicht sein, wenn mehrere Hundert oder Tausende von Proben, die untersucht und für mehrere microRNAs. Mikrofluidik (TLDA) und nanofluidics (OA) Plattformen mit hohem Durchsatz / Content-Plattformen zur Akquisition von größeren Daten in kürzerer Zeit zu ermöglichen. Obwohl Chargenunterschiede wurden in den TLDA Karten beobachtet worden ist, kann diese durch Anfordern TLDA Karten aus dem gleichen Ansatz minimiert werden. Wir beobachten, dass TLDA Plattform (Abbildung 3) zeigten signifikante Unterschiede in 17% der Mitte - geringe Häufigkeit miRNAs bei der Prüfung mit dem gleichen Probe auf unterschiedliche Chargen TLDA Karten. Wir empfehlen daher die gleichen Chargennummern für die Analyse mit TLDA Karten. Diese Variante könnte auch aufgrund der technischen Variabilität inklusive eventueller Beladung und Pipettierfehlern sein. Wir empfehlen jedoch, Bestellung / Anforderung der gleichen Charge von TLDA Karten. Keine signifikante Batch-Variante wurde auf die OA-Plattform beobachtet. Trotzdem TaqMan basierend experimental qPCR nähert Angebot Leichtigkeit, um die Fülle von miRNAs im Plasma / Serum Proben zu messen. Die niedrigen, mittleren und hohen Durchsatz Ansätze hier nicht an die Flexibilität, um eine Reihe von Proben und miRNAs mit einem hocheffiziente, reproduzierbare und sauber (geringem Hintergrundrauschen) Chemie analysieren.

Mikro-RNAs (miRNAs) sind ~ 22 Nukleotid nicht-kodierenden (NC-) RNAs, die als Regulatoren der Genexpression 1-3. Die meisten miRNAs bei Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, zur Förderung der 3&#39;-UTR, die negative Regulation der Genexpression 2-4 führt. Dies erfolgt in der Regel über eine Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomale Drop-off. miRNAs Umlauf ist gezeigt worden, Biomarkern in Forschungs- und klinischen Gebieten für eine Vielzahl von Krankheiten, wie Diabetes 5-7, Eierstock- 8, 9 Prostata und Brustkrebs 10,11, Hepatitis B 12 und anderen Autoimmunerkrankungen 13 sein. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich miRNAs in verschiedenen Zellen oder Gewebe zu identifizieren, ebenso wie im Umlauf aus menschlichem Plasma und Serumproben, die besser zugänglich und weniger invasiv ist 9,11-15. Verschiedene Methoden der miRNA Quantifizierung wurden established mit mehreren Plattformen, wie beispielsweise die Standard-96-Well-Platte Plattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik Kartenplattform 12,18-23 und der Nanofluidik Array-Plattform 17,24. Quantitative real-time PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, relative oder absolute Zahl der Transkripte Messung mit mehreren (Farbstoff- oder Sonde-basierte) Chemie. Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil der niedrigen Hintergrundfluoreszenz und eine hohe Empfindlichkeit, eine einzige Abschrift Kopie zu erkennen. Es ist relativ kostengünstig, einfach zu bedienen und sehr gut reproduzierbar, so dass es eine bevorzugte Methode zur Quantifizierung und Bestimmung miRNA-Expression 25. Probe qPCR-basierte Verfahren umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: die reverse Transkription (RT) und qPCR 4,26,27. RT ist, wo der Stamm-Schleifen-RT-Primer an einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und komplementären (c) DNA umgewandelt. Quantifizierung der cDNA-Produkt wird dann unter Verwendung miRNA-spezifischen PCR Primern26-28. Das Prinzip der sondenbasierten qPCR basiert auf dem Nachweis von Komplementärstrangverlängerung in Echtzeit, was die Hydrolyse des fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet bezogen. Diese Sonden wurden entwickelt, um einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) erlauben. Detektion der Emission von der Fluoreszenzreporter (Emitter) von der Nähe des Löschermolekül maskiert. Wenn Taq-Polymerase (pol) sich von der Stromaufwärts-Primer und erreicht eine Gabel (das 5&#39;-Ende der Sonde), hydrolysiert das Taq Pol-Exonukleaseaktivität der Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziations / Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher. Diese Version von einem einzigen Molekül Fluoreszenzemitter wird durch den Detektor erfasst und als eine inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals von diesem gut / Reaktions dargestellt. Der Anstieg in der Fluoreszenz ist proportional zu der Menge an PCR-Produkt erzeugt wird, so dass eine genaue quantification des amplifizierten Ziel 26,28. Mit zunehmender Nachfrage miRNA Quantifizierung mittlere bis hohe Durchsatz-Technologien wurden entwickelt, damit eine größere Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit verarbeitet werden. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein mittelDurch innovative mikrofluidische Design auf Sondenbasis qPCR Chemie bietet eine Erhöhung der Zahl von miRNAs auf einer Platte analysiert. TLDA beinhalten die Verwendung eines vorgegebenen Pool von RT-Primer, die verwendet werden, um die cDNA zu synthetisieren. Diese cDNAs werden anschließend in einen kunden 384er mikrofluidischer Karte gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mittels qPCR 22,26,29 bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrockneten Primer und Sonden zur spezifischen miRNA (en) zu verstärken, also bis zu 384 Reaktionen können in Einzel TLDA Karte 26 verarbeitet werden. Die nanofluidics Array ein Hochdurchsatz-Plattform, die zum Nachweis von Gen-Transkripte verwendet wird <sup&gt; 24 unter Verwendung der gleichen Sonde basierenden Chemie. Es nutzt eine proprietäre Matrix mit hydrophoben hydrophilen Wechselwirkungen einfache Laden der 33 Nanoliter-Reaktionsmischung in einer Anordnung von 3072 Durchgangslöcher auf einem Edelstahl-Schlitten 24 zu erleichtern. Dieser Artikel befasst sich zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs im Serum / Plasma durchgeführt werden und die kritischen Faktoren, die berücksichtigt werden müssen bei der Durchführung und Interpretation dieser Daten. Getroffen, um Konto, werden ihre individuellen Vor- und Nachteile in diesem Artikel beschrieben werden.

<table><tbody><tr><td>96 Well-Plattform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>für die reverse Transkription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4427975</td><td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 Die Assays werden in einer Packung mit RT-Primern und PCR-Primern geliefert.</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transkriptionskit</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4366597 oder 4366596</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 oder http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 Das TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit ist das gleiche Kit, das für die reverse Transkription in allen drei TaqMan-Plattformen verwendet wird – 96-Well-Plattform, TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Für qPCR auf einer 96-Well-Plattform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, kein AmpErase UNG&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4367846</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 Der 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix wird für die qPCR verwendet auf&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen-96-Well-Plattform und TLDA.</td></tr><tr><td>MicroAmp Optischer Klebefilm</td><td>Aufgetragene Biosysteme</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte, 0,1 ml&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td></tr><tr><td>Microfluidics-Plattform (TLDA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Für die reverse Transkription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siehe 96-Well-Plattform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Kit (4366597 oder 4366596) (wie oben gezeigt).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Primer, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399966</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 Die Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 werden für RT ein&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex RT Primer, Human Pool B v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444281</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 Die Megaplex RT Primer, Human Pool B v3.0 werden für RT on &nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>ODER</td><td></td><td></td><td>ODER</td></tr><tr><td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4444750</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 Das Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 wird für RT on&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Für die Vorverstärkung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4391128 oder 4488593</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 oder http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 Der TaqMan PreAmp Master Mix wird für die Voramplifikation von qPCR auf&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4444303</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 Der Megaplex PreAmp Primer, Human Pool B v3.0 dient zur Voramplifikation von qPCR auf&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primer, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4399233</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 Die Megaplex PreAmp Primer, Human Pool A v2.1 werden für die Voramplifikation von qPCR auf&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>1x TE Puffer (100 ml)</td><td>Invitrogen</td><td>12090-015</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product Der 1x TE Puffer wird für die Voramplifikation von qPCR auf&nbsp; die beiden TaqMan-Plattformen TLDA und OpenArray.</td></tr><tr><td>Zum Laden und Ausführen der 384-Well-Mikrofluidik-Karte</td><td></td><td></td><td></td>(TLDA)</tr><tr><td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td></tr><tr><td>Nanofluidics-Plattform (OpenArray)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Für die reverse Transkription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>siehe 96-Well-Plattform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Kit (4366597 oder 4366596) (wie oben gezeigt).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Für die Voramplifikation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>beziehen Sie sich auf TLDA-Präamplifikationsreagenzien (wie oben gezeigt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zum Laden und Ausführen der Objektträger</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 Panel)</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4470187</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Zubehör-Kit&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4469576</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td></tr><tr><td>OpenArray 384-Well-Probenplatten&nbsp; &nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4406947</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td></tr><tr><td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems &nbsp;</td><td>4462159</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td></tr><tr><td>OpenArray AccuFill Systemtipps&nbsp;</td><td>Angewandte Biosysteme &nbsp;</td><td>4457246</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td></tr><tr><td>andere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Qiagen</td><td>129117</td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td></tr></tbody></table>

sonde-basierte echtzeit-pcr ansätze zur quantitativen messung von micrornas

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Sondenbasierten quantitative PCR (qPCR) ist ein bevorzugtes Verfahren zum Messen Transkript Fluss, da es eines der am meisten empfindlichen Nachweisverfahren, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Sondenbasierte Chemie bietet den geringsten Grundfluoreszenz im Vergleich zu anderen (Farbstoff) Chemien. Gegenwärtig gibt es verschiedene Betriebssysteme, dass die Verwendung sondenbasierte Chemie Transkript Fluss zu quantifizieren. qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemßig verwendete Verfahren ist jedoch nur ein Maximum von 96 Proben oder miRNAs kann in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Dies ist zeitraubend und mühsam, wenn eine große Anzahl von Proben / miRNAs analysiert werden. Hochdurchsondenbasierten Plattformen wie Mikrofluidik (zB TaqMan Array Card) und nanofluidics Arrays (zB Openarray) bieten eine einfache reproduzierbar und effizient die Fülle von mehreren mikroRNAs detektieren in einer großen Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit. Hier zeigen wir, den Versuchsaufbau einnd Protokoll für die miRNA-Quantifizierung von Serum oder Plasma-EDTA-Proben, mit Sonde-basierte Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik und Nanofluidik Arrays) mit steigendem Durchsatz.

Die empfohlene Volumen für eine miRNA-Sonde-basierte Assays qPCR Reaktion ist 20 ul. Anmerkung: Wir haben bestätigt, dass ein Reaktionsvolumen von 5 ul der Lage ist, ähnliche Ergebnisse wie die unter Verwendung von 20 ul Volumen 4,7,30 erreicht herzustellen. Absenken des Reaktionsvolumen auf 5 ul ermöglicht eine 75% ige Abnahme der Kosten für Reagenzien, ohne merklichen Verlust der Empfindlichkeit. Wie in Abbildung 2 dargestellt, Reaktionsvolumen von 20 ul und 5 ul zeigen eine starke Co-Verhältnis bis 39 Zyklen (mit r 2 von 0,92, p = 0,0002). Mikrofluidik Array stellt ein Werkzeug zur Gewinnung von Daten über 754 miRNAs in einer Probe in etwa 5 Stunden (für Karte A und die Karte B), die eine effizientere Methode zur Analyse mehrerer Proben im Vergleich zu herkömmlichen Platte mit 96 Vertiefungen PCR ist ausgedrückt. Wir verglichen miRNA Mikrofluidik Array Karten für die gleiche Probe (Probe A und Probe A Wiederholung) 3A -. B zeigt eine Bland-Altman-Plot (&lt;strong&gt; 3A) und Korrelation Grundstück (3B) für alle 754 miRNAs für diese Proben getestet. Es gibt 3 verschiedene Steuer miRNAs (U6, RNU44 und RNU48) nach dem Zufallsprinzip auf beiden Karten (Karten A und B) an verschiedenen Standorten platziert. Wenn Werte U6 Zyklus Schwelle (Ct) zwischen den 2 läuft im Vergleich haben wir nicht beobachten, signifikante Unterschiede zwischen den Werten (Tabelle 4). Es ist auch wichtig zu beachten, dass U6 ist in größerer Fülle (niedrigere Ct-Wert) in der Probe beurteilt ausgedrückt. Dann verglichen wir alle miRNAs, die Ct-Werte in beiden Läufen (n = 150) haben zwischen 0-19,99, die ähnlich Ausdruck miRNAs insgesamt mit einem Koeffizient der Bestimmung von 98% (3C-D) hatte. Von allen 277 miRNAs, die Ct-Werte zwischen 20 und 29.99 in den beiden Läufen haben, unterschieden sich 16 miRs deutlich zwischen den ursprünglichen und wiederholen Läufe (3E - F) Die Zahl der miRNAs mit signifikanten Unterschied zwische.n die Durchläufe erhöht (89 von 327), wenn die Ct-Werte wurden zwischen 30-40 für beide Läufe (Abbildung 3G - H) ausgewählt. Die nanofluidics Array Plattform liefert die Daten für 754 miRNAs von jedem Serum / Plasma-Probe getestet, wie in 4A dargestellt ist es wichtig, diese Verstärkungskurven zu untersuchen. - Wie es bei allen qPCR - sicherzustellen, dass das Ergebnis anzeigt wahre Verstärkung. Jedes der 48 Untergruppen (Abbildung 1) enthält auch einen Test für die drei beliebtesten &quot;Hauswirtschaft&quot; ncRNAs. U6, RNU44 und RNU48 4B veranschaulicht eine typische Clustering von U6 repliziert aus einer einzigen Probe. Diese Wiederholungen anzuzeigen niedrige Standardabweichung (SD &lt;0,5) und so sind ein Indikator für die Zuverlässigkeit. Alternativ 4C zeigt die erhöhte Variabilität U6 Replikate (SD&gt; 0.5) in einer zweiten Probe. Dies schließt nicht die Gültigkeit o negierenf die übrigen Tests, obwohl es notwendig eine gründliche Kritik. U6, wie bei den meisten &quot;Hauswirtschaft&quot; miRNAs in biologischen Flüssigkeiten, können eine Variable Ausdruck haben. Es sei darauf hingewiesen, daß eine der Proben, in 4C skizziert, wird 4-fach weniger U6 Gehalt als die in Figur 4B dargestellt. Da die Höhe der U6 in Probe in 4C dargestellt ist, 75% weniger als mit der, in der Platte 4B dargestellt zu beginnen, wird eine verstärkte technische Variabilität aufgrund der Poisson-Verteilung von Transkripten, die von der kleinen Reaktionsvolumen 17 verstärkt wird erwartet. Ein weiteres nützliches Tool ist die Qualitätskontrolle (QC) Bilder, für den Export zur Verfügung, sobald der Lauf beendet ist. Eine Auswahl davon ist der Fluoreszenz von ROX, der passive Farbstoff in der qPCR Reagenzgemisch gefunden, um zu bestätigen, dass jedes Durchgangsloch wurde korrekt (Abbildung 5) geladen. Ein Durchgangsloch oder gar ein eigenes<html> Reifen Subarray kann nicht geladen werden aufgrund einer unzureichenden Probenvolumen, Verdampfung, in die Vertiefungen der 384er-Probenplatte, Versagen der Probe Plattendichtung, oder Defekte in dem Accufill Systems oder seiner Spitzen vollständig entfernen vorliegende Blasen. Jede entladen Durchgangsbohrungen müssen identifiziert werden, um die Kennzeichnung miRNAs als &quot;nicht nachweisbar&quot;, zu vermeiden, wenn in Wirklichkeit der Test wurde nicht geladen. Wenn dieses Problem auftritt, zu bestätigen, dass mindestens 5 &amp; mgr; l Probe / Mastermix in jedem Well der 384-well-Probenplatte geladen wird, die Probenplatte ordnungsgemäß vor der Beladung zentrifugiert, ist die Siegelfolie vollständig entfernt, und die beladene Openarray Schieber verschlossen und innerhalb der vorgegebenen Zeit für alle aufeinanderfolgenden Durchläufen ausführen. Wenn Lade Problem nicht beseitigen, können diese werden eher die sich auf bestimmte Partie oder des Loses der Arrays oder ähnlichen Verbrauchsmaterial und weitere Unterstützung sollte durch den Hersteller eingeholt werden. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Layout von Proben für die Nanofluidik Array-Workflow: (A) Jeder 384-Well-Probenteller können Proben für bis zu 8 Nanofluidik Arrays zu halten. (B) Verwässert ist vorverstärkt cDNA in 8 Vertiefungen (2 Spalten von 4 Zeilen) in benachbarten 8-Well-Gruppen gelegt, mit Pool A und Pool B. Jeder Kreis steht für eine gut. (C) Jede Vertiefung der Probenplatte wird zu einem Unterfeld des Nanofluidik Array geladen werden. Jedes kleine Quadrat stellt einen Teilfeld. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Co-Verhältnis-Analyse für konventionelle 96-well PCR-Plattformen: Co-Verhältnis von 20 ul und 5 ul Reaktionsvolumina auf TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte-Plattform in CT-Werte (39 Zyklen). Wir verglichen 4 verschiedene microRNAs (miR-375, miR-30c, 30d und miR-miR-7) in 4 verschiedenen menschlichen Serum- und Plasmaproben. Nur 11 Datenpunkte aufgezeichnet, da die anderen waren nicht nachweisbar. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Abbildung 3: Die Umlauf miRNA Profiling mit Mikrofluidik Array Karten Mit 2 Mikrofluidik-Karten (Karten-A und-B-Karte), ein Profil von 754 miRNAs erzeugt (A - B). Wie hier gezeigt, haben wir dieselbe Probe für 2 Mikrofluidik Array läuft, um die Reproduzierbarkeit der Mikrofluidik Karte Ergebnisse zu überprüfen. Wir beobachteten einen ähnlichen Ausdruck miRNAs insgesamt mit Ct-Werten zwischen 0 bis 19,99 (C - D). Es gibt nur wenige miRNAs (16 von 277) mit Ct-Werten zwischen 20 bis 29,99 und signifikante Unterschiede zwischen den Wiederholungsläufe (E - F). Achtzig neun von 327microRNAs mit höheren Ct-Werte (30-40) zeigten signifikante Unterschiede zwischen den beiden Durchgängen (G - H). &#160; Die Daten werden mit Hilfe gepaart T-Test analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Abbildung 4: Vertreter Profil von PCR-Produkt Amplifikationskurven: Ist eine repräsentative Figur der kombinierten (A) Amplifikationskurven aller miRNA Ziele für eine menschliche Plasmaprobe. Ein Test auf U6 (eine gemeinsame Steuer ncRNA) ist in jedem Unterfeld platziert. Die Probe in (B) zeigt eine geringe Variabilität (SD &lt;0,5), während (C) zeigt eine hohe Standardabweichung (SD&gt; 0,5) innerhalb U6 repliziert. Beide Proben sind total RNA aus menschlichem Plasma isoliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Abbildung 5: QC Analyse Nanofluidik Arrays: Qualitätskontrolle (QC) Bilder einer richtig eingelegt Nanofluidik Array (links) und einer falsch eingelegt Nanofluidik Array (rechts). Die passive Farbstoff ROX (in der qPCR Reagenzienmix vorhanden), fluoresziert, um eine korrekt geladen Durchgangsbohrung angeben. Die Anordnung auf der rechten Seite hat mehrere Subarrays / Durchgangslöcher, die nicht mit der qPCR Reagenzgemisch geladen werden, und diese sollten als falsch-negative PCR-Reaktionen identifiziert werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td></tr&gt; <tr><td> RT-Puffer (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Reverse-Transkriptase- </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1A: RT Reagenzienmischung Komponenten in einer 5 &amp; mgr; l RT-Reaktionsvorbereitung TaqMan Echtzeit qPCR unter Verwendung eines Standard-96-Well-Platte-Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td><td> Volumen pro 20 ul Reaktions (ul) </td></tr><tr><td> Schnelle PCR-Mastermix (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR Assay (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiesWasser </td><td> 1,45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: </td><td> 4.2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Testkomponente auf Grundlage des ausgewählten miRNA getestet. Tabelle 1B: qPCR Reagenzienmix Komponenten in einem 5 oder 20 &amp; mgr; qPCR Reaktionsansatz für TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2B: PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktions Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung sondenbasierten Nanofluidik miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponentes </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3B:. PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktionsansatz für sondenbasierten Nanofluidik miRNA Platte HINWEIS: Die interaktive Zusatz Excel-Tabellen für die drei Plattformen zur Verfügung gestellt, die bereits einen Anteil von 5% zusätzlich zu zum Pipettieren Fehler zu kompensieren. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Probe A </td><td> Probe A wiederholen </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Die Umlauf miRNA U6 Profilerstellung mithilfe der Mikrofluidik Array Karte. Mit zwei Array Mikrofluidik-Karten (A und B). Ct-Werte U6 Steuer miRNA aus Probe A (insgesamt = 8). Konsequente U6 Steuer miRNA Fluss zwischen den Läufen beobachtet.

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, drei verschiedene sondenbasierte real-time PCR-Methoden zu demonstrieren, die zur Quantifizierung von microRNA in Plasma- und Serumproben verwendet werden. Die sondenbasierte Echtzeit-PCR wird durch Hydrolyse und Detektion der fluoreszenzmarkierten Sonde erreicht, die einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher enthält. Wenn sich die Tack-Polymerase vom stromaufwärts gelegenen Primer bis zum fünfprimigen Ende der Sonde erstreckt, führt sie zu einer physikalischen Dissoziation des Fluoreszenzemitters vom Quencher.Als nächstes wird ein einzelnes Molekül von Fluor vier freigesetzt, das vom Detektor aufgezeichnet und als inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals aus dieser Reaktion dargestellt wird. Letztendlich kann die Menge des erzeugten PCR-Produkts anhand des Anstiegs der Fluoreszenz gemessen werden, was eine genaue Quantifizierung der amplifizierten Zielamplifi ermöglicht. Diese Methode entwickelt sich zu einer vielversprechenden Methode, um neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und andere Krankheiten wie Diabetes zu entdecken.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Häufigkeit von microRNAs in Serum und Plasma geben kann, kann sie auch auf andere Proben wie periphere Zellen und Gewebe angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da einige der Schritte, die mit der Versiegelung des Nanofluidik-Array-Objektträgers verbunden sind, durch einfaches Lesen des Protokolls schwer zu erlernen sein können. Für den sondenbasierten quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweis reifer Mikro-RNA bei 4,2 Mikrolitern der einzelnen QPCR-Reagenzienmischungen in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Platte, gefolgt von 0,8 Mikrolitern der geeigneten, frisch zubereiteten CDNA-Reaktionslösung. Versiegeln Sie die Platte mit der entsprechenden optischen Abdeckung und starten Sie dann die QPCR auf dem real-time PCR-System.Um eine Mikrofluidik-Array-Karte mit einem bis 1000 Nanogramm Gesamt-RNA zu erstellen, tauen Sie zunächst die Primer von Pool A und B auf: Puffer, Desoxynukleotidphosphate, Magnesiumchlorid und RNAs-Inhibitor auf Eis. Um dann eine reverse Transkription durchzuführen, aliquotieren Sie 100 Nanogramm jeder RNA-Probe in ein Röhrchen von Pool A oder Pool B, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Volumens an nukleasefreiem Wasser, um das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen auf drei Mikroliter zu bringen. Als nächstes aliquotieren Sie 4,5 Mikroliter des entsprechenden reversen Transkriptionsreagenzes und mischen es in die entsprechenden Röhrchen.Geben Sie dann die Proben in den Thermocycler und starten Sie die reverse Transkription. Während die reverse Transkription voranschreitet. Für die Gesamt-RNA-Probeneingabe zwischen einem und 350 Nanogramm tauen Sie den vordefinierten Pool an Voramplifikationsprimern auf Eis auf, wenn die Proben fertig sind, aliquotieren Sie 22,5 Mikroliter des entsprechenden Vorverstärkerreagenzes.Mischen Sie es in die Röhrchen von Pool A und Pool B und geben Sie jeweils 2,5 Mikroliter der rückseitig transkribierten CDNA-Probe hinein. Laden Sie dann die Samples in den Thermocycler und starten Sie den Vorverstärkerzyklus. Am Ende des Zyklus fügen Sie 75 Mikroliter 0,1 x Tris EDTA-Puffer zum vorverstärkten CDNA hinzu, um die Mikrofluidikkarte zu laden.Als nächstes fügen Sie 450 Mikroliter QPCR-Reagenzmischung zu neun Mikrolitern des verdünnten PREPL-amplifizierten CDNA für Karte A hinzu, verwenden Sie das mit dem Primerpool A hergestellte PREPL-amplifizierte Produkt und fügen Sie 441 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 900 Mikrolitern hinzu. Sobald sie Raumtemperatur erreicht hat, nehmen Sie die Tack Man Low Density Array-Karte aus der Verpackung und legen Sie sie mit der Folienseite nach unten auf eine saubere Stelle. Fügen Sie 100 Mikroliter PCR-Reaktion hinzu.In jede der acht Füllöffnungen auf der Karte mischen. Drehen Sie die Karte eine Minute lang bei 331 GS und Raumtemperatur. Schieben Sie dann den Schlitten in einem langsamen, gleichmäßigen und gleichmäßigen Zug über die Krempel, bis er den Endpunkt des Versiegelungsgeräts erreicht.Entfernen Sie die versiegelte Array-Karte, und schneiden Sie die Reservoirs ab. Vergewissern Sie sich dann, dass der richtige beheizte Blockdeckel und der Probenträger im Echtzeit-PCR-System des Mikrofluidik-Arrays installiert sind. Um die nanofluidischen Arrays zu laden, tauen Sie das verdünnte Prepl, das amplifizierte CDNA auf und heften Sie das Echtzeit-QPCR-Reagenz an.Mischen und mischen Sie die QPCR-Reagenzflasche durch Schwenken. Als nächstes fügen Sie 22,5 Mikroliter QPCR-Reagenzmischung zu 22,5 Mikrolitern verdünntem Prepl, amplifiziertem CDNA hinzu. Geben Sie dann fünf Mikroliter jeder Probe in acht Vertiefungen der 384-Well-Probenplatte des Nanofluidik-Array-Workflows und achten Sie darauf, dass Pool A und Pool B jeder Probe platziert werden.Wenn in benachbarten Blöcken mit acht Vertiefungen alle Proben übertragen wurden, decken Sie jeden Abschnitt der Platte mit Stücken des offenen Probenplattenversiegelungsmittels ab. Tauen Sie dann den ersten Nanofluidik-Array-Objektträger nach ca. 15 Minuten auf Raumtemperatur auf. Es wurde bestätigt, dass der richtige Blockbearbeitungsdeckel und der Probenträger in das Nanofluidik-Array-System eingebaut sind, und dann den Kolben der Immersionsflüssigkeitsspritze durch leichtes Ziehen lösen.Entfernen Sie die Kappe, setzen Sie die Spitze auf und spülen Sie die Luft aus der Spitze. Platzieren Sie dann die Spitzen des Ladesystems innerhalb des Ladesystems. Öffnen Sie den Deckel und setzen Sie die Probenplatte in das Ladesystem ein.Ziehen Sie nun ein Paar eng anliegende Handschuhe an. Öffnen Sie vorsichtig die Objektträgerverpackung und kippen Sie den Objektträger langsam aus der Verpackung, ohne die Oberseite zu berühren. Legen Sie die Folie mit dem Barcode auf der linken Seite in das Ladesystem.Entfernen Sie dann die Versiegelung von dem Teil der Probenplatte, der zum Laden vorgesehen ist, und verwenden Sie die Software des Ladesystems, um die Position des Objektträger-Barcodes, die Position des Probenträgers und die Spitzenkonfiguration einzugeben. Entfernen Sie während des Ladens der Folie den durchsichtigen und roten Kunststoff von der Unterseite des Schiebedeckels. Entfernen und verschließen Sie den Objektträger dann vorsichtig innerhalb von 90 Sekunden nach Ende des Ladevorgangs.Platzieren Sie den Objektträger in der Plattenklemme und den Objektdeckel 30 Sekunden lang auf dem Objektträger und vergewissern Sie sich, dass der Deckel so positioniert ist, dass der Barcode korrekt angezeigt wird. Positionieren Sie dann die Tauchflüssigkeitsspritze so im Objektträger, dass die Spitze gegen den Deckel drückt, und füllen Sie den Objektträger langsam mit Tauchflüssigkeit, wobei Sie darauf achten, dass die Flüssigkeit am Deckel entlang läuft. Sobald der Schieber voll ist, verschließen Sie ihn mit dem Dübel und drehen Sie die Schraube, bis der Griff abbricht.Entfernen Sie abschließend die Kunststoffabdeckung auf der Oberseite des Objektträgerdeckels und legen Sie den Objektträger vorsichtig in den Objektträgerträger des Real-Time-PCR-Systems. Achten Sie darauf, die Unterseite der Rutsche beim Absenken zu stützen, ohne die Oberseite der Rutsche zu berühren. Initialisieren Sie dann das PCR-System und starten Sie das quantitative PCR-Programm innerhalb einer Stunde nach dem Laden der Proben.Mit diesem Verfahren kann ein Reaktionsvolumen von fünf Mikrolitern zu ähnlichen Ergebnissen führen wie mit einem Volumen von 20 Mikrolitern mit einer starken Korrelation. Bis zu 39 Zyklen werden hier fade Altman- und Korrelationsdiagramme für alle 754 micro RN gezeigt, die an derselben Probe mit Mikrofluidik-Array-Karten getestet wurden, da gerade gezeigte microRNAs, die CT-Werte zwischen null und 19,99 in beiden Trails aufweisen, auch ähnliche Expressionen mit einem Bestimmungskoeffizienten von 98% aufweisen. Darüber hinaus nimmt die Anzahl der microRNAs mit signifikanten Unterschieden, die zwischen den Versuchen beobachtet wurden, zu, wenn CT-Werte zwischen 30 und 40 ausgewählt werden. In dieser Grafik sind die Daten der Nanofluidik-Array-Plattform für alle 754 microRNAs dargestellt.Es ist wichtig, die Amplifikationskurven zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse auf eine echte Amplifikation hinweisen. Auch microRNAs für die Haushaltsführung, wie z. B. U six, sollten auf Variabilität untersucht werden. In diesem Diagramm ist z. B. ein typisches Clustering von sechs Replikaten mit geringer Standardabweichung dargestellt, was auf die Zuverlässigkeit der Daten hinweist.Schließlich verdeutlichen diese Daten die erhöhte Variabilität von U sechs Replikaten in einer zweiten Stichprobe. Hochdurchsatz-Sonden-basierte Technologien wie die Mikrofluidik- und Nana-Fluidik-Arrays bieten die Möglichkeit, die Häufigkeit mehrerer microRNAs in einer großen Anzahl von Proben in sehr kurzer Zeit reproduzierbar und effizient zu detektieren. Jeder der Workflows ist so konzipiert, dass er je nach Anzahl der microRNA-Ziele und der Anzahl der zu analysierenden Proben unterschiedliche Durchsätze ermöglicht.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene sondenbasierte Echtzeit-PCR-Techniken zur Bestimmung der Mikro-NA-Häufigkeit durchführen können.

probe-based-real-time-pcr-approaches-for-quantitative-measurement

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Dieses Protokoll verwendet eine sondenbasierte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Sulforhodamin-B-Assay (SRB), 3' unübersetztes Klonen (3' UTR) und einen Luziferase-Assay, um die Zielgene einer miRNA von Interesse zu verifizieren und die Funktionen von miRNAs zu verstehen.

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Lernen Sie sondenbasierte Echtzeit-PCR zur quantitativen Messung von microRNAs in Plasma- und Serumproben. Diese Methode ermöglicht die Entdeckung neuer Biomarker für Krebs und Diabetes.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Weitere Videos entdecken