Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, drei verschiedene sondenbasierte real-time PCR-Methoden zu demonstrieren, die zur Quantifizierung von microRNA in Plasma- und Serumproben verwendet werden. Die sondenbasierte Echtzeit-PCR wird durch Hydrolyse und Detektion der fluoreszenzmarkierten Sonde erreicht, die einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher enthält. Wenn sich die Tack-Polymerase vom stromaufwärts gelegenen Primer bis zum fünfprimigen Ende der Sonde erstreckt, führt sie zu einer physikalischen Dissoziation des Fluoreszenzemitters vom Quencher.

Als nächstes wird ein einzelnes Molekül von Fluor vier freigesetzt, das vom Detektor aufgezeichnet und als inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals aus dieser Reaktion dargestellt wird. Letztendlich kann die Menge des erzeugten PCR-Produkts anhand des Anstiegs der Fluoreszenz gemessen werden, was eine genaue Quantifizierung der amplifizierten Zielamplifi ermöglicht. Diese Methode entwickelt sich zu einer vielversprechenden Methode, um neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und andere Krankheiten wie Diabetes zu entdecken.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Häufigkeit von microRNAs in Serum und Plasma geben kann, kann sie auch auf andere Proben wie periphere Zellen und Gewebe angewendet werden. Eine visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da einige der Schritte, die mit der Versiegelung des Nanofluidik-Array-Objektträgers verbunden sind, durch einfaches Lesen des Protokolls schwer zu erlernen sein können. Für den sondenbasierten quantitativen Echtzeit-PCR-Nachweis reifer Mikro-RNA bei 4,2 Mikrolitern der einzelnen QPCR-Reagenzienmischungen in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Platte, gefolgt von 0,8 Mikrolitern der geeigneten, frisch zubereiteten CDNA-Reaktionslösung. Versiegeln Sie die Platte mit der entsprechenden optischen Abdeckung und starten Sie dann die QPCR auf dem real-time PCR-System.

Um eine Mikrofluidik-Array-Karte mit einem bis 1000 Nanogramm Gesamt-RNA zu erstellen, tauen Sie zunächst die Primer von Pool A und B auf: Puffer, Desoxynukleotidphosphate, Magnesiumchlorid und RNAs-Inhibitor auf Eis. Um dann eine reverse Transkription durchzuführen, aliquotieren Sie 100 Nanogramm jeder RNA-Probe in ein Röhrchen von Pool A oder Pool B, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Volumens an nukleasefreiem Wasser, um das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen auf drei Mikroliter zu bringen. Als nächstes aliquotieren Sie 4,5 Mikroliter des entsprechenden reversen Transkriptionsreagenzes und mischen es in die entsprechenden Röhrchen.

Geben Sie dann die Proben in den Thermocycler und starten Sie die reverse Transkription. Während die reverse Transkription voranschreitet. Für die Gesamt-RNA-Probeneingabe zwischen einem und 350 Nanogramm tauen Sie den vordefinierten Pool an Voramplifikationsprimern auf Eis auf, wenn die Proben fertig sind, aliquotieren Sie 22,5 Mikroliter des entsprechenden Vorverstärkerreagenzes.

Mischen Sie es in die Röhrchen von Pool A und Pool B und geben Sie jeweils 2,5 Mikroliter der rückseitig transkribierten CDNA-Probe hinein. Laden Sie dann die Samples in den Thermocycler und starten Sie den Vorverstärkerzyklus. Am Ende des Zyklus fügen Sie 75 Mikroliter 0,1 x Tris EDTA-Puffer zum vorverstärkten CDNA hinzu, um die Mikrofluidikkarte zu laden.

Als nächstes fügen Sie 450 Mikroliter QPCR-Reagenzmischung zu neun Mikrolitern des verdünnten PREPL-amplifizierten CDNA für Karte A hinzu, verwenden Sie das mit dem Primerpool A hergestellte PREPL-amplifizierte Produkt und fügen Sie 441 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 900 Mikrolitern hinzu. Sobald sie Raumtemperatur erreicht hat, nehmen Sie die Tack Man Low Density Array-Karte aus der Verpackung und legen Sie sie mit der Folienseite nach unten auf eine saubere Stelle. Fügen Sie 100 Mikroliter PCR-Reaktion hinzu.

In jede der acht Füllöffnungen auf der Karte mischen. Drehen Sie die Karte eine Minute lang bei 331 GS und Raumtemperatur. Schieben Sie dann den Schlitten in einem langsamen, gleichmäßigen und gleichmäßigen Zug über die Krempel, bis er den Endpunkt des Versiegelungsgeräts erreicht.

Entfernen Sie die versiegelte Array-Karte, und schneiden Sie die Reservoirs ab. Vergewissern Sie sich dann, dass der richtige beheizte Blockdeckel und der Probenträger im Echtzeit-PCR-System des Mikrofluidik-Arrays installiert sind. Um die nanofluidischen Arrays zu laden, tauen Sie das verdünnte Prepl, das amplifizierte CDNA auf und heften Sie das Echtzeit-QPCR-Reagenz an.

Mischen und mischen Sie die QPCR-Reagenzflasche durch Schwenken. Als nächstes fügen Sie 22,5 Mikroliter QPCR-Reagenzmischung zu 22,5 Mikrolitern verdünntem Prepl, amplifiziertem CDNA hinzu. Geben Sie dann fünf Mikroliter jeder Probe in acht Vertiefungen der 384-Well-Probenplatte des Nanofluidik-Array-Workflows und achten Sie darauf, dass Pool A und Pool B jeder Probe platziert werden.

Wenn in benachbarten Blöcken mit acht Vertiefungen alle Proben übertragen wurden, decken Sie jeden Abschnitt der Platte mit Stücken des offenen Probenplattenversiegelungsmittels ab. Tauen Sie dann den ersten Nanofluidik-Array-Objektträger nach ca. 15 Minuten auf Raumtemperatur auf. Es wurde bestätigt, dass der richtige Blockbearbeitungsdeckel und der Probenträger in das Nanofluidik-Array-System eingebaut sind, und dann den Kolben der Immersionsflüssigkeitsspritze durch leichtes Ziehen lösen.

Entfernen Sie die Kappe, setzen Sie die Spitze auf und spülen Sie die Luft aus der Spitze. Platzieren Sie dann die Spitzen des Ladesystems innerhalb des Ladesystems. Öffnen Sie den Deckel und setzen Sie die Probenplatte in das Ladesystem ein.

Ziehen Sie nun ein Paar eng anliegende Handschuhe an. Öffnen Sie vorsichtig die Objektträgerverpackung und kippen Sie den Objektträger langsam aus der Verpackung, ohne die Oberseite zu berühren. Legen Sie die Folie mit dem Barcode auf der linken Seite in das Ladesystem.

Entfernen Sie dann die Versiegelung von dem Teil der Probenplatte, der zum Laden vorgesehen ist, und verwenden Sie die Software des Ladesystems, um die Position des Objektträger-Barcodes, die Position des Probenträgers und die Spitzenkonfiguration einzugeben. Entfernen Sie während des Ladens der Folie den durchsichtigen und roten Kunststoff von der Unterseite des Schiebedeckels. Entfernen und verschließen Sie den Objektträger dann vorsichtig innerhalb von 90 Sekunden nach Ende des Ladevorgangs.

Platzieren Sie den Objektträger in der Plattenklemme und den Objektdeckel 30 Sekunden lang auf dem Objektträger und vergewissern Sie sich, dass der Deckel so positioniert ist, dass der Barcode korrekt angezeigt wird. Positionieren Sie dann die Tauchflüssigkeitsspritze so im Objektträger, dass die Spitze gegen den Deckel drückt, und füllen Sie den Objektträger langsam mit Tauchflüssigkeit, wobei Sie darauf achten, dass die Flüssigkeit am Deckel entlang läuft. Sobald der Schieber voll ist, verschließen Sie ihn mit dem Dübel und drehen Sie die Schraube, bis der Griff abbricht.

Entfernen Sie abschließend die Kunststoffabdeckung auf der Oberseite des Objektträgerdeckels und legen Sie den Objektträger vorsichtig in den Objektträgerträger des Real-Time-PCR-Systems. Achten Sie darauf, die Unterseite der Rutsche beim Absenken zu stützen, ohne die Oberseite der Rutsche zu berühren. Initialisieren Sie dann das PCR-System und starten Sie das quantitative PCR-Programm innerhalb einer Stunde nach dem Laden der Proben.

Mit diesem Verfahren kann ein Reaktionsvolumen von fünf Mikrolitern zu ähnlichen Ergebnissen führen wie mit einem Volumen von 20 Mikrolitern mit einer starken Korrelation. Bis zu 39 Zyklen werden hier fade Altman- und Korrelationsdiagramme für alle 754 micro RN gezeigt, die an derselben Probe mit Mikrofluidik-Array-Karten getestet wurden, da gerade gezeigte microRNAs, die CT-Werte zwischen null und 19,99 in beiden Trails aufweisen, auch ähnliche Expressionen mit einem Bestimmungskoeffizienten von 98% aufweisen. Darüber hinaus nimmt die Anzahl der microRNAs mit signifikanten Unterschieden, die zwischen den Versuchen beobachtet wurden, zu, wenn CT-Werte zwischen 30 und 40 ausgewählt werden. In dieser Grafik sind die Daten der Nanofluidik-Array-Plattform für alle 754 microRNAs dargestellt.

Es ist wichtig, die Amplifikationskurven zu untersuchen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse auf eine echte Amplifikation hinweisen. Auch microRNAs für die Haushaltsführung, wie z. B. U six, sollten auf Variabilität untersucht werden. In diesem Diagramm ist z. B. ein typisches Clustering von sechs Replikaten mit geringer Standardabweichung dargestellt, was auf die Zuverlässigkeit der Daten hinweist.

Schließlich verdeutlichen diese Daten die erhöhte Variabilität von U sechs Replikaten in einer zweiten Stichprobe. Hochdurchsatz-Sonden-basierte Technologien wie die Mikrofluidik- und Nana-Fluidik-Arrays bieten die Möglichkeit, die Häufigkeit mehrerer microRNAs in einer großen Anzahl von Proben in sehr kurzer Zeit reproduzierbar und effizient zu detektieren. Jeder der Workflows ist so konzipiert, dass er je nach Anzahl der microRNA-Ziele und der Anzahl der zu analysierenden Proben unterschiedliche Durchsätze ermöglicht.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie verschiedene sondenbasierte Echtzeit-PCR-Techniken zur Bestimmung der Mikro-NA-Häufigkeit durchführen können.