Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die absoluten Spiegel von Plasma-MicroRNAs mit Hilfe der quantitativen Real-time Reverse Transkriptions-PCR zu messen. Diese Methode kann helfen, die Menge an Plasma-microRNAs zu bestimmen, auch wenn ihr Expressionsniveau niedrig ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gemessenen Daten mit anderen aus verschiedenen Studien oder Labors verglichen werden können.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Proben anderer Spezies, da eine Standardkurve unter Verwendung der synthetischen RNA oder des Nukleotids erzeugt werden kann. Diese Methode kann Einblicke in die translationale Forschung geben, um vielversprechende Sicherheitsbiomarker zu untersuchen. Tauen Sie zunächst die gefrorenen Plasmaproben aus der Oberschenkelvene der Cynomolgus-Affen auf Eis auf.

Übertragen Sie das Lysereagenz in Chloroform auf Eis, um es vor der RNA-Extraktion zu kühlen. Geben Sie anschließend 1.000 Mikroliter Lysereagenz zu 200 Mikrolitern der Probe. Und eine Minute lang vortexen, um eine gute Mischung zu gewährleisten.

Geben Sie dann fünf Mikroliter fünf nanomolare synthetische Caenorhabditis elegans microRNA und 200 Mikroliter Chloroform in die Probe. Wirbeln Sie die Probe eine Minute lang vor, um sie richtig zu mischen. Legen Sie die Probe dann zwei bis drei Minuten lang auf Eis.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 g 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie anschließend vorsichtig 650 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Mikroröhrchen. Geben Sie dann 975 Mikroliter Ethanol in die wässrige Phase und pipettieren Sie mehrmals, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.

Übertragen Sie die Probe in die entsprechende Säule und den entsprechenden Adapter und trocknen Sie sie dann drei Minuten lang mit Vakuumverteilern. Geben Sie dann 200 Mikroliter Ethanol in die Säule und trocknen Sie es eine Minute lang vakuumtrocknen. Geben Sie nach dem Vakuumtrocknen 800 Mikroliter RWT-Puffer in die Säule und trocknen Sie erneut zwei Minuten lang vakuumtrocknen.

Geben Sie dann 800 Mikroliter RPE-Puffer in die Säule und trocknen Sie sie zwei Minuten lang vakuumtrocken. Fügen Sie den RPE-Puffer zweimal hinzu und trocknen Sie ihn anschließend vakuum. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter Ethanol in die Säule.

Nach der Zugabe von Ethanol eine Minute lang vakuumtrocknen. Übertragen Sie dann die Säule in ein neues Mikroröhrchen und zentrifugieren Sie dasselbe eine Minute lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur. Füllen Sie die Säule nach der Zentrifugation in ein neues Mikroröhrchen und fügen Sie 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu.

Lassen Sie die Säule drei Minuten lang bei Raumtemperatur stehen und zentrifugieren Sie sie dann eine Minute lang bei 8.000 g bei Raumtemperatur. Zum Schluss lagern Sie das Eluat bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Um eine synthetische RNA-Oligonukleotidkonzentration herzustellen, die der Ziel-microRNA entspricht, verdünnen Sie die Stammlösung um das 10-fache, um eine Arbeitslösung mit der höchsten Konzentration zu erhalten und die Standardkurven darzustellen.

Um einen Multiplex-Pool von reversen Transkriptionsprimern zu bilden, mischen Sie als nächstes gleiche Volumina der 20-Stärke-Primer für Ziel-microRNAs. Bereiten Sie dann die Reaktionsmischung für die reverse Transkription vor. Geben Sie dann 10 Mikroliter Reverse-Transkriptionsreaktionsmischung zu fünf Mikrolitern RNA-Probe.

Mischen Sie die beiden, indem Sie sie mehrmals pipettieren. Dann die Mischung fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Nachdem Sie die Probe in den Thermocycler gegeben haben, starten Sie den Zyklus.

Sobald das Programm beendet ist, lagern Sie die umgekehrt transkribierte Probe bei minus 80 Grad Celsius. Um den Multiplex-Assay-Primer-Pool zu bilden, geben Sie gleiche Volumina von fünf Mikrolitern Assay-Primern, die den Ziel-microRNAs entsprechen, in das Röhrchen mit dem Tris-EDTA-Puffer in dem Endvolumen von 1.000 Mikrolitern. Als nächstes wird das Reaktionsgemisch vor der Amplifikation konstituiert.

Sobald die Reaktionsmischung fertig ist, werden 22,5 Mikroliter der Reaktionsmischung vor der Amplifikation auf zwei Komma fünf Mikroliter einer umgekehrt transkribierten Probe übertragen. Mischen Sie dann die Probe und den Mastermix vor der Amplifikation gründlich und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang auf Eis, lassen Sie dann die PCR-Röhrchen im Thermocycler und starten Sie den Lauf. Sobald das Programm beendet ist, werden alle Proben bei minus 80 Grad Celsius übertragen.

Nach dem Auftauen der voramplifizierten oder nicht voramplifizierten Proben wird sie mit sterilem Wasser fünffach verdünnt. Um die Standardkurve zu erzeugen, führen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der Proben durch, die aus synthetischen RNA-Oligonukleotiden gewonnen wurden. Stellen Sie dann die quantitative PCR-Reaktionsmischung in einem auf Eis aufbewahrten Röhrchen her.

Geben Sie dann 18 Mikroliter aus dem quantitativen PCR-Reaktionsmix auf die Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatten. Geben Sie dann zwei Mikroliter der verdünnten Proben in die Vertiefungen. Nachdem Sie die Platte mit Klebefolie versiegelt haben, zentrifugieren Sie die Probe kurz bei 500 G für 15 Sekunden.

Starten Sie dann das Echtzeit-Thermocycler-Programm. Verwenden Sie eine SDS-Software Version 2.4, die mit dem entsprechenden Echtzeit-Thermocycler zusammenarbeitet, um die Rohkopienzahl jeder Probe zu berechnen. Berechnen Sie dann mit der Excel-Software die absolute Kopienzahl aus der Rohkopiennummer.

Die Amplifikationseffizienz von miR-122, miR-192 und miR-133a wurde durch das Plotten von Standardkurven analysiert, was die Beziehung zwischen der logarithmischen Konzentration und dem Quantifizierungszyklus für die nicht voramplifizierten Proben erklärt. Die Standardkurven für miR-122, miR-192 und miR-133a zeigen eine lineare Beziehung zwischen Quantifizierungszyklen und logarithmischer Konzentration der Proben. Als nächstes wurde die Amplifikationseffizienz von miR-1, miR-499a und miR-206 analysiert, indem Standardkurven für voramplifizierte Proben aufgetragen wurden.

Um die Verstärkungseffizienz zu analysieren, wurde die Steigung mit Hilfe der linearen Regression berechnet. Die Steigung in der Standardkurve A zeigt das Fehlen spezifischer Amplikons bei einer Konzentration von 1.000 Kopien pro Mikroliter für miR-499a und miR-206. Die unspezifischen Amplikons wurden jedoch bei 1.000 Kopien pro Mikroliter für miR-1 erhalten.

Hier wurden nicht voramplifizierte und voramplifizierte miR-206-Proben in Duplikaten verwendet, um die Amplifikationsdiagramme abzuleiten. Die Werte des Quantifizierungszyklus für nicht voramplifiziertes und voramplifiziertes miR-206 wurden auf 39,9 geschätzt, plus oder minus eins neun bzw. 27,0 plus oder minus zwei komma zwei, was fast ähnliche Werte zwischen den Duplikaten darstellt, wie sie in den Diagrammen gezeigt werden. Als nächstes wurden Plasma-microRNAs, die von Cynomolgus-Affen gewonnen wurden, einem Profiling unterzogen, um ihre absoluten Werte zu berechnen.

Die Dot Plots, die aus microRNA-Profilen gewonnen wurden und ihre Expressionsniveaus darstellen, zeigen, dass miR-122, miR-133a und miR-192 ohne Voramplifikation nachweisbar sind. miR-1, miR-206 und miR-499a hingegen erfordern aufgrund der geringen Expressionsniveaus eine Vorverstärkung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die absoluten Spiegel von Plasma-microRNA mit Hilfe der RT-qPCR messen können.

Und Pre-Amplification; Es ist nützlich, um den Nachweis mit kleinen Mengen von microRNAs zu verbessern.