High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von Mikro-RNAs effizient, kostengünstig und mit minimalem Ausgangsmaterial durch Kombination einer multiplex Quantifizierenden RT-PCR mit einer mikrofluidischen Plattform zu charakterisieren. Zunächst erfolgt die Anreicherung der extrahierten RNA, gefolgt von einer multiplex Rückwärtstranskription und einer multiplex Vorverstärkung. Im nächsten Schritt werden überschüssige Primer abgetrennt.

Abschließend wird die Expression einzelner micro-RNAs mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Das Ergebnis sind genaue und hoch reproduzierbare micro-RNA-Expressionswerte über die untersuchten Proben hinweg. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass der zusätzliche Reinigungsschritt nach der Vervielfältigung mittels pre-EMP die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der multiplex Q-R-T-P-C-R-Methode verbessert.

Beginnen Sie mit RNA, die aus Serum extrahiert wurde. Unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits oder einer auf Phenol-Chloroform basierenden RNA-Methode aus homogenisiertem Gewebe, wie beispielsweise Triol, muss nach jeder Extraktion ein Waschschritt durchgeführt werden, und die Lagerung erfolgt stets bei minus 80 Grad Celsius. Konzentrieren Sie die RNA-Lösung.

Wenn mit einer begrenzten Menge an Probe begonnen wird, beispielsweise aus Serum, setzen Sie zunächst ein MicroCon-Probenreservoir in ein Gefäß ein und pipettieren Sie die RNA-Lösung vorsichtig in das Reservoir, wobei die Membran mit der Pipettenspitze nicht berührt werden darf. Positionieren Sie nun das Gefäß und den Filter im Zentrifugenrotor so, dass die Markierungslinie („crack band“) zum Rotor weist, und zentrifugieren Sie etwa drei Stunden lang. Nach drei Stunden wird die RNA vollständig auf der Membran angereichert sein, um anschließend eluiert zu werden.

Fügen Sie eine gewünschte Menge an RNA-freiem Wasser zur Membran hinzu, kehren Sie das Reservoir um und geben Sie es in ein neues Gefäß. Anschließend drei Minuten bei vier Grad Celsius mit maximal 3000 × g zentrifugieren. Lagern Sie die konzentrierte RNA bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Nach Durchführung einer RT-Reaktion an der RNA unter Verwendung von xpl Reverse-Stem-Loop-Primern, gefolgt von 12 bis 18 PCR-Zyklen, sind die Mikro-RNAs als CD-NA-Stränge repräsentiert.

Dies wird als das Prä-PCR-Produkt bezeichnet, bezogen auf die anschließende QPCR. Das Prä-PCR-Produkt muss in einem 10 %igen Polyacrylamidgel gereinigt werden, wobei jede Kammer mit 5,5 Mikrolitern Sechs-fach-Orange-G in Kombination mit 27,5 Mikrolitern Prä-PCR-Produkt beladen wird, zusammen mit einer 10 Basenpaare umfassenden DNA-Leiter.

Laufen Sie das Gel bei 150 Volt für 55 bis 60 Minuten. Romo-Phenolblau läuft in diesem Gel im Bereich von 20 Basenpaaren. Nach dem Laufen des Gels färben Sie es 25 Minuten lang mit Cyber-Gold, lichtgeschützt und auf einem Schüttler, ab.

Schneiden Sie das Vor-PCR-Produktband von 60 bis 80 Basenpaaren aus und überführen Sie den Gelblock in beschriftete Röhrchen. Falls die Produktkonzentration niedrig ist, kann es unsichtbar sein, befindet sich jedoch dennoch im Gel. Zerkleinern Sie nun das Gelband mittels Zentrifugation im Röhrchen-im-Röhrchen-Verfahren und geben Sie 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzu.

Die Puffer-Gele-Mischung vier Stunden bei 37 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Nach vier Stunden die Flüssigkeit in ein neues Röhrchen überführen und weitere 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzufügen. Diese Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren.

Am nächsten Tag überführen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes erneut und führen anschließend eine Ethanolfällung des Vorprodukts der PCR durch. Sobald ein Chip aus seiner Verpackung entnommen wird, muss er innerhalb von 24 Stunden geprimt und anschließend innerhalb von 60 Minuten nach dem Priming beladen werden. Beginnen Sie mit dem Priming des Arrays, indem Sie jeweils 150 Mikroliter Kontrollflüssigkeit in die Speicher des Chips injizieren.

Achten Sie darauf, keine Flüssigkeit auf den Chip oder die Zuleitungen zu verschütten, da der Chip sonst unbrauchbar wird. Danach platzieren Sie den Chip in der integrierten Fluidikkreisläufen oder IFC-Steuerung und führen das Entlüftungsskript der Steuerung aus. Sobald das Programm beginnt, bereiten Sie umgehend die Proben vor.

Beginnen Sie mit der Zubereitung der Pres-Proben-Mischung. Mischen Sie eine Kombination aus Tack Man, universeller Master-Mischung und Lade-Reagenzien. Kombinieren Sie anschließend im 96-Well-Ladeformat jeweils 2,25 Mikroliter jeder Probe mit 2,75 Mikrolitern der Pres-Proben-Mischung, um die beladene Flüssigkeit zu gewinnen. Vortexen Sie kurz und zentrifugieren Sie die Platte schnell bei vier Grad Celsius.

Die Probenplatte ist nun vorbereitet. Verwenden Sie nun eine neue 96-Well-Platte, um 13x-Konzentrationen des Assaygemischs vorzubereiten. Dies erfolgt, indem pro Bohrung ein universeller Primer, ein Vorwärtsprimer und eine genspezifische TaqMan-Sonde gemischt werden.

Die Endkonzentrationen betragen jeweils ein Mikromolar für den universellen und den Vorwärtsprimer sowie 0,2 Mikromolar für die TaqMan-Sonde. Anschließend so viel Tween zugeben, dass sich eine Endkonzentration von 0,25 % Tween in einem Endvolumen von fünf Mikrolitern ergibt. Gut mischen, dabei Blasen vermeiden, und die Platte kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.

Dies ist die Testplatte. Beginnen Sie die 96.96 Q-R-T-P-C-R, indem Sie den Chip beladen. Zuerst werden die Proben und anschließend die Assays mit einem Endvolumen von fünf Mikrolitern pro Zulauf zum IFC aufgegeben.

Zweitens führen Sie das Lademischungs-Skript aus, um die Proben und Assays in den Chip zu laden. Sobald das Skript abgeschlossen ist, ziehen Sie die Schutzfolie vom beladenen Chip ab und entfernen Sie Staubpartikel oder Rückstände von der Chipoberfläche mit Klebeband. Richten Sie nun das Verstärkungsprogramm des Biosystems ein.

Laden Sie den Chip in das System ein und führen Sie das Programm aus. Die Ergebnisse können mit der Fluid-Dime-Software analysiert werden, um Amplifikationskurven, Heatmaps des gesamten Chips und CT-Werte für jedes Experiment zu erhalten. Verwenden Sie prä-PCR-Produkte, die durch Größenseparation an nativen Polyacrylamidgelen gereinigt wurden, Wildtyp DG CR acht und ER-Nullmutante.

Die RNA wurde im Vergleich zu früheren Protokollen aufbereitet. Durch den Reinigungsschritt treten sowohl mehr Mikro-RNAs als auch eine Verringerung falsch-positiver Signale in beiden Hintergründen – DGCR8-defizient und ER-defizient – auf. Außerdem ermöglicht die modifizierte qRT-PCR-Methode eine korrekte Klassifizierung seltener, DGCR8-unabhängiger, Dicer-abhängiger kleiner RNAs.

Hier wurden 48 Cerumen-Proben von Patienten und Kontrollpersonen auf Expressionsänderungen von 384 verschiedenen Mikro-RNAs untersucht. Die Daten wurden für jede Probe normalisiert, indem der entsprechende Median abgezogen wurde, ohne Verwendung eines Spike-Ins in den Kontrollen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine multiplexe Q-R-T-P-C-R auf einer Flu-Line-Plattform verwendet werden kann, um Hunderte von Mikro-RNAs gleichzeitig in vielen Proben zu charakterisieren, selbst wenn die Ausgangsmenge an RNA sehr begrenzt ist.