High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Mikro-RNA-Expression effizient, kostengünstig und mit minimalem Ausgangsmaterial zu profilieren, indem das quantitative Multiplex-R-T-P-C-R mit einer mikrofluidischen Plattform kombiniert wird. Dies beginnt mit der Konzentration der extrahierten RNA, gefolgt von der Multiplex-Reverse-Transkription und der Multiplex-Präamplifikation. Der nächste Schritt besteht darin, überschüssige Primer zu entfernen.

Schließlich wird die Singleplex-Mikro-RNA-Expression mit Hilfe einer mikrofluidischen Plattform profiliert. Das Ergebnis sind genaue und hochgradig reproduzierbare Mikro-RNA-Expressionswerte über die interessierenden Proben hinweg. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass der zusätzliche Reinigungsschritt nach der Prä-EMP-Amplifikation die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Multiplex-Q-R-T-P-C-R-Methode verbessert.

Beginnen Sie mit RNA, die aus dem Serum extrahiert wurde. Bei Verwendung eines RNA-Aufreinigungskits oder einer RNA-Methode auf Phenolchloroform-Basis aus homogenisiertem Gewebe wie Triol müssen alle Extraktionen mit einem Waschschritt durchgeführt werden und die gesamte Lagerung erfolgt bei minus 80 Grad Celsius. Konzentrieren Sie die RNA-Lösung.

Wenn Sie mit einer begrenzten Probenmenge, z. B. zuerst aus dem Serum, beginnen, setzen Sie ein MicroCon-Probenreservoir in ein Fläschchen ein und pipettieren Sie dann die RNA-Lösung in das Reservoir, wobei Sie sehr darauf achten sollten, die Membran nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. Positionieren Sie nun das Fläschchen und den Filter in der Zentrifuge mit dem Rissband in Richtung Rotor und lassen Sie die Zentrifugation etwa drei Stunden lang laufen. Nach drei Stunden wird die RNA vollständig auf der Membran konzentriert, um die RNA zu eluieren.

Geben Sie eine gewünschte Menge an freiem RNA-Wasser in die Membran, drehen Sie das Reservoir um und geben Sie es in ein neues Fläschchen. Dann drei Minuten lang bei vier Grad Celsius mit maximal 3000-facher G.Store die konzentrierte RNA bei minus 80 Grad Celsius drehen, bis sie benötigt wird Nach Durchführung einer RT-Reaktion auf der RNA mit xpl-Reverse-Stem-Loop-Primern, gefolgt von 12 bis 18 Runden PCR-Zyklen. Die microRNAs werden durch CD-NA-Stränge repräsentiert.

Dies wird als Prä-PCR-Produkt bezeichnet. Bezogen auf die bevorstehende QPCR. Das Prä-PCR-Produkt muss auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel aufgereinigt werden, zusammen mit einer 10-Basen-gepaarten DNA-Leiterladung pro Spur mit 5,5 Mikrolitern sechs x orangefarbenem G in Kombination mit 27,5 Mikrolitern Prä-PCR-Produkt.

Lassen Sie das Gel 55 bis 60 Minuten lang bei 150 Volt laufen. Romo Phenol Blue läuft auf diesem Gel im Bereich von 20 Basenpaaren. Nachdem das Gel gelaufen ist, färben Sie es 25 Minuten lang mit Cybergold, ohne Licht und auf einem Shaker aus dem gefärbten Gel.

Schneiden Sie die Pre-PCR-Produktbande von 60 bis 80 Basenpaaren aus und übertragen Sie den Gelblock auf markierte Röhrchen. Wenn die Produktkonzentration niedrig ist, ist sie möglicherweise nicht sichtbar, befindet sich aber immer noch im Gel. Zerkleinern Sie nun das Gelband mit Hilfe einer Röhrchen-in-Röhrchen-Zentrifugation und fügen Sie 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzu.

Inkubieren Sie den Puffer-Gel-Mix vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Füllen Sie die Flüssigkeit nach vier Stunden in ein neues Röhrchen um und fügen Sie weitere 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzu. Inkubieren Sie diese Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren.

Am nächsten Tag wird der Röhrcheninhalt erneut umgefüllt und mit einer Ethanolfällung des Prä-PCR-Produkts fortgefahren. Wenn ein Chip aus seiner Verpackung geöffnet wird, muss er innerhalb von 24 Stunden grundiert und dann innerhalb von 60 Minuten nach dem Ansaugen geladen werden. Beginnen Sie mit der Grundierung des Arrays, indem Sie 150 Mikroliter Steuerleitungsflüssigkeit in jeden der Akkumulatoren auf dem Chip injizieren.

Achten Sie darauf, keine Flüssigkeit auf den Chip oder die Einlässe zu verschütten, da der Chip sonst unbrauchbar wird. Platzieren Sie dann den Chip in der integrierten Fluidik-Schaltung oder IFC-Steuerung und führen Sie das Priming-Skript der Steuerung aus. Sobald das Programm startet, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Proben.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Pres-Sample-Mixes, einer Kombination aus Tackman, Universal-Mastermix und Ladereagenzien. Kombinieren Sie dann mit dem 96-Well-Ladeformat 2,25 Mikroliter jeder Probe mit 2,75 Mikrolitern Pres-Probenmischung, um die geladene Flüssigkeit zu sammeln. Die Platte kurz vortexen und schnell bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Die Probenplatte wird nun vorbereitet. Verwenden Sie nun eine neue 96-Well-Platte, um 13 x Konzentrationen der Assay-Mischung herzustellen. Dies geschieht durch Mischen eines Universal-Primers, eines Forward-Primers und einer genspezifischen Tac-Man-Sonde pro Well.

Die Konzentrationen von einem X betragen ein Mikromolar für den Universal- und Forward-Primer und 0,2 Mikromolar für die Tac-Man-Sonde. Fügen Sie dann genügend Tween für eine Endkonzentration von 0,25 % Tween in einem endgültigen Well-Volumen von fünf Mikrolitern hinzu. Gut mischen, Blasen vermeiden und den Teller kurz drehen, um die Flüssigkeit aufzufangen.

Dies ist die Assay-Platte. Beginnen Sie den 96.96 Q-R-T-P-C-R, indem Sie den Chip laden. Laden Sie zuerst die Proben und dann die Assays mit dem endgültigen Volumen von fünf Mikrolitern pro Einlass in das IFC.

Führen Sie anschließend das Load-Mix-Skript aus, um die Proben und Assays in den Chip zu laden. Wenn das Skript beendet ist, ziehen Sie die Schutzfolie vom geladenen Chip ab und entfernen Sie mit Klebeband Staubpartikel oder Ablagerungen von der Chipoberfläche. Richten Sie nun das Biosystem-Amplifikationsprogramm ein.

Laden Sie den Chip in das System und führen Sie das Programm aus. Die Ergebnisse können mit Fluid-Dime-Software analysiert werden, um Amplifikationskurven, Heatmaps für ganze Chips und CT-Werte für jeden zu erstellen. Gut unter Verwendung von Prä-PCR-Produkten, die durch Größentrennung auf nativen Polyacrylamid-Gelen, Wildtyp-DG CR 8 und ER-Null-Mutanten gereinigt wurden.

Die RNA wurde im Vergleich zu früheren Protokollen hergestellt. Dank des Aufreinigungsschritts treten mehr microRNAs und ein Verlust falsch positiver Signale sowohl im DGCR 8-Null- als auch im ER-Null-Hintergrund auf. Darüber hinaus ermöglicht der modifizierte QR TPCR R-Ansatz die korrekte Kategorisierung seltener D gcr Eight unabhängiger Dicer-abhängiger kleiner RNAs.

Hier wurden 48 Cera von Patienten und Kontrollen auf Expressionsänderungen von 384 verschiedenen microRNAs untersucht. Die Daten wurden für jede Stichprobe normalisiert, indem der entsprechende Median subtrahiert wurde und ohne einen Anstieg in den Kontrollen zu verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Multiplex Q-R-T-P-C-R auf einer Grippeleitungsplattform verwendet werden kann, um gleichzeitig ein Profil von Hunderten von Mikronasen in vielen Proben zu erstellen, selbst wenn Sie mit einem sehr begrenzten Input, RNA, beginnen.