Name: High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie eine optimierte multiplex qRT-PCR-Methode zur hochdurchsatzfähigen microRNA-Profiling auf mikrofluidischen Plattformen. Diese Technik ermöglicht präzise und reproduzierbare Expressionsanalysen selbst bei minimalem Ausgangsmaterial.

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Wir möchten die Blelloch Labor zur Kommentierung des Textes danken. Diese Arbeit wurde vom Fonds zur RB von NIH (K08 NS48118 und R01 NS057221), California Institute of Regenerative Medicine (CIRM) (Seed Grants RS1-00161, New Faculty Award RN2-00906) und dem Pew Charitable Trust und FM aus den unterstützten Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

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Alan Mir ist ein Mitarbeiter von Fluidigm Corporation. Ansonsten haben wir keine finanziellen Interessen offen zu legen.

miRNAs sind kurze (18-24 Nukleotide), nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression post-transkriptionell reguliert sowohl destabilisierende Boten-RNAs (mRNA) und hemmt deren Übersetzung. 6 Die Tatsache, dass mindestens ein Drittel der menschlichen Gene enthalten konservierte miRNA binding-sites in ihrer 3&#39;UTR und die offenkundige Wechselwirkungen von miRNAs mit Genen für Pluripotenz, Proliferation und Apoptose schlägt einen entscheidenden Beitrag in Zellschicksal Entscheidungen Gewebshomöostase und Krankheiten wie Krebs. 6,7 Deshalb genaue microRNA Expression Profile sind breiter Interesse. Um zu testen, die veröffentlichten Multiplex qRT-PCR miRNA Expression Profiling Protokoll 2 verwendeten wir kleine RNA-defizienten MESC als negative Kontrollen. DGCR8 - / - Zellen sind mangelhaft aller kanonischen microRNAs, während Dicer - / -. Zellen sowohl kanonischen und nicht-canoncial micoRNAs mangelnde 8,9 Vergleicht man Ebenen in Wildtyp-MES-bis DGCR8 - / - Zellen, entdeckten wir einen Mangel an Genauigkeit, da mehrere ausgedrückt 10 microRNAs nicht in den Wildtyp-Zellen 11 erkannt. Einige zeigten sogar niedriger Expression relativ zu den Knockout-Zellen (Abbildung 3a). Wir vermuten, dass der Mangel an Genauigkeit durch die massive Grundierung Übertrag der beiden aufeinanderfolgenden Schritte Multiplex (RT und Pre-PCR) vor Singleplex RT-Quantifizierung verursacht werden könnte. Allerdings ist Multiplex Vorverstärkung notwendig, um die Signalstärke zu verbessern, besonders am Anfang Konzentration der RNA begrenzt ist. / - - Durch Reinigung entfernt pre-PCR-Produkte von Primern nach Größe Auswahl an nativen Polyacrylamidgelen (Abbildung 2), konnten wir eine deutliche Verbesserung der Genauigkeit durch die Erkennung mehr microRNAs und einen Verlust von falsch-positiven Signale in beide DGCR8 demonstrieren und Dicer - / - Hintergründe (Abbildungen 3a und 3b) Neben der modifizierten qRT-PCR-Ansatz für die ordnungsgemäße Zuordnung von seltenen DGCR8 unabhängige / Dicer abhängig kleinen RNAs (Abbildung 3b) 11 erlaubt. Deshalb ist ein zusätzlicher Schritt, um übermäßige Primer vom Prä-PCR-Produkt zu reinigen ist eindeutig von Vorteil, vor allem, wenn große Multiplex-Primer-Sets pro Probe. Die optimale Anzahl der Vor-Amplifikationszyklen wird durch die Eingabe RNA-Konzentrationen bestimmt. Der Restbetrag nicht unter-oder overamplify sollte durch die Angabe der spezifischen Experiment geführt werden. Mit mehr als tausend bekannten microRNAs, von Standard-Einsatz 384-well Platten möglicherweise nicht optimal für ausgedehnte microRNA Profiling, insbesondere beim Vergleich mehrerer Proben. Die Fluidigm Dynamic Array IFC ermöglicht, mit einer signifikanten Abnahme der Pipettierschritte und brauchte Chemie-, Prüf-bis zu 96 einzelnen Proben gegen 96 verschiedene Mikro-RNAs in einem einzigen Experiment (9216 Reaktionen) bei Nanoliter-Maßstab (6,7 nL). Für jeden Lauf der Analyse-Software bietet Amplifikationskurven, farbkodierte Heat Maps und radeln Schwellenwerten (CT). Die gleichzeitige großen Profilierung reduziert experimentellen Abweichungen und ermöglicht bedeuten Ausdruck Normalisierung, die aus-führt andere Normalisierung Strategien, die Verwendung von kleinen RNA Kontrollen machen. 12 Im Vergleich zu handelsüblichen 384-Well-Plattformen mit vorbelegt TaqMan-Sonden, bietet die Kombination aus einem High-Throughput-Profiling-Plattform mit maßgeschneiderten Primer setzt hohe experimentelle Flexibilität. Die optimierte Multiplex qRT-PCR-Ansatz in Kombination mit der Dynamic Array-Plattform erfolgreich konnten wir gleichzeitig Bildschirm 48 Prostatakrebs Patientenseren auf Veränderungen in Stufen von 384 miRNA (Abbildung 4) und die Daten ohne Dorn in der Kontrollgruppe (dh synthetische microRNAs) zu normalisieren. 11 Trotz der Zunahme der Schritte von Proben der Vorbereitung bis zur Profilierung ergibt, ist das beschriebene Vorgehen eine zeit-und kostengünstig mit hohem Durchsatz Methode, um große Sample-Sets für miRNA Expression Profil, auch mit begrenzten Ausgangsmaterial.

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Die breite Beteiligung von miRNAs in kritischen Prozesse der Gehirnentwicklung, Gewebe Homöostase und Krankheit hat zu einem steigenden Interesse bei den Forschungs-und Pharma-Gemeinden geführt. Zur Untersuchung miRNAs, ist es unerlässlich, dass die Quantifizierung von microRNA Ebenen präzise und robust ist. Durch den Vergleich Wildtyp zu kleinen RNA defizienten embryonalen Stammzellen der Maus (MESC), zeigte uns einen Mangel an Genauigkeit und Robustheit, die in früheren Multiplex qRT-PCR-Techniken. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren, einschließlich Reinigung entfernt übermäßige Primer aus früheren Multiplex Schritte vor Singleplex Echtzeit-Erkennung, die dramatisch erhöht die Genauigkeit und Robustheit der Technik. Darüber hinaus erklären wir, wie die Durchführung der Technik auf einem Mikrofluidik-Chip bei Nanoliterbereich reduziert Kosten für Reagenzien und ermöglicht Zeit effektiv mit hohem Durchsatz miRNA Expression Profiling.

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Die weitreichende Beteiligung von miRNAs an kritischen Prozessen, die der Entwicklung, der Gewebehomöostase und Krankheiten zugrunde liegen, hat zu einem stark steigenden Interesse unter den ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von Mikro-RNAs effizient, kostengünstig und mit minimalem Ausgangsmaterial durch Kombination einer multiplex Quantifizierenden RT-PCR mit einer mikrofluidischen Plattform zu charakterisieren. Zunächst erfolgt die Anreicherung der extrahierten RNA, gefolgt von einer multiplex Rückwärtstranskription und einer multiplex Vorverstärkung. Im nächsten Schritt werden überschüssige Primer abgetrennt.Abschließend wird die Expression einzelner micro-RNAs mithilfe einer mikrofluidischen Plattform analysiert. Das Ergebnis sind genaue und hoch reproduzierbare micro-RNA-Expressionswerte über die untersuchten Proben hinweg. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass der zusätzliche Reinigungsschritt nach der Vervielfältigung mittels pre-EMP die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der multiplex Q-R-T-P-C-R-Methode verbessert.Beginnen Sie mit RNA, die aus Serum extrahiert wurde. Unter Verwendung eines RNA-Reinigungs-Kits oder einer auf Phenol-Chloroform basierenden RNA-Methode aus homogenisiertem Gewebe, wie beispielsweise Triol, muss nach jeder Extraktion ein Waschschritt durchgeführt werden, und die Lagerung erfolgt stets bei minus 80 Grad Celsius. Konzentrieren Sie die RNA-Lösung.Wenn mit einer begrenzten Menge an Probe begonnen wird, beispielsweise aus Serum, setzen Sie zunächst ein MicroCon-Probenreservoir in ein Gefäß ein und pipettieren Sie die RNA-Lösung vorsichtig in das Reservoir, wobei die Membran mit der Pipettenspitze nicht berührt werden darf. Positionieren Sie nun das Gefäß und den Filter im Zentrifugenrotor so, dass die Markierungslinie („crack band“) zum Rotor weist, und zentrifugieren Sie etwa drei Stunden lang. Nach drei Stunden wird die RNA vollständig auf der Membran angereichert sein, um anschließend eluiert zu werden.Fügen Sie eine gewünschte Menge an RNA-freiem Wasser zur Membran hinzu, kehren Sie das Reservoir um und geben Sie es in ein neues Gefäß. Anschließend drei Minuten bei vier Grad Celsius mit maximal 3000 × g zentrifugieren. Lagern Sie die konzentrierte RNA bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Nach Durchführung einer RT-Reaktion an der RNA unter Verwendung von xpl Reverse-Stem-Loop-Primern, gefolgt von 12 bis 18 PCR-Zyklen, sind die Mikro-RNAs als CD-NA-Stränge repräsentiert.Dies wird als das Prä-PCR-Produkt bezeichnet, bezogen auf die anschließende QPCR. Das Prä-PCR-Produkt muss in einem 10 %igen Polyacrylamidgel gereinigt werden, wobei jede Kammer mit 5,5 Mikrolitern Sechs-fach-Orange-G in Kombination mit 27,5 Mikrolitern Prä-PCR-Produkt beladen wird, zusammen mit einer 10 Basenpaare umfassenden DNA-Leiter.Laufen Sie das Gel bei 150 Volt für 55 bis 60 Minuten. Romo-Phenolblau läuft in diesem Gel im Bereich von 20 Basenpaaren. Nach dem Laufen des Gels färben Sie es 25 Minuten lang mit Cyber-Gold, lichtgeschützt und auf einem Schüttler, ab.Schneiden Sie das Vor-PCR-Produktband von 60 bis 80 Basenpaaren aus und überführen Sie den Gelblock in beschriftete Röhrchen. Falls die Produktkonzentration niedrig ist, kann es unsichtbar sein, befindet sich jedoch dennoch im Gel. Zerkleinern Sie nun das Gelband mittels Zentrifugation im Röhrchen-im-Röhrchen-Verfahren und geben Sie 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzu.Die Puffer-Gele-Mischung vier Stunden bei 37 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Nach vier Stunden die Flüssigkeit in ein neues Röhrchen überführen und weitere 300 Mikroliter TEN-Puffer hinzufügen. Diese Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren.Am nächsten Tag überführen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes erneut und führen anschließend eine Ethanolfällung des Vorprodukts der PCR durch. Sobald ein Chip aus seiner Verpackung entnommen wird, muss er innerhalb von 24 Stunden geprimt und anschließend innerhalb von 60 Minuten nach dem Priming beladen werden. Beginnen Sie mit dem Priming des Arrays, indem Sie jeweils 150 Mikroliter Kontrollflüssigkeit in die Speicher des Chips injizieren.Achten Sie darauf, keine Flüssigkeit auf den Chip oder die Zuleitungen zu verschütten, da der Chip sonst unbrauchbar wird. Danach platzieren Sie den Chip in der integrierten Fluidikkreisläufen oder IFC-Steuerung und führen das Entlüftungsskript der Steuerung aus. Sobald das Programm beginnt, bereiten Sie umgehend die Proben vor.Beginnen Sie mit der Zubereitung der Pres-Proben-Mischung. Mischen Sie eine Kombination aus Tack Man, universeller Master-Mischung und Lade-Reagenzien. Kombinieren Sie anschließend im 96-Well-Ladeformat jeweils 2,25 Mikroliter jeder Probe mit 2,75 Mikrolitern der Pres-Proben-Mischung, um die beladene Flüssigkeit zu gewinnen. Vortexen Sie kurz und zentrifugieren Sie die Platte schnell bei vier Grad Celsius.Die Probenplatte ist nun vorbereitet. Verwenden Sie nun eine neue 96-Well-Platte, um 13x-Konzentrationen des Assaygemischs vorzubereiten. Dies erfolgt, indem pro Bohrung ein universeller Primer, ein Vorwärtsprimer und eine genspezifische TaqMan-Sonde gemischt werden.Die Endkonzentrationen betragen jeweils ein Mikromolar für den universellen und den Vorwärtsprimer sowie 0,2 Mikromolar für die TaqMan-Sonde. Anschließend so viel Tween zugeben, dass sich eine Endkonzentration von 0,25 % Tween in einem Endvolumen von fünf Mikrolitern ergibt. Gut mischen, dabei Blasen vermeiden, und die Platte kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.Dies ist die Testplatte. Beginnen Sie die 96.96 Q-R-T-P-C-R, indem Sie den Chip beladen. Zuerst werden die Proben und anschließend die Assays mit einem Endvolumen von fünf Mikrolitern pro Zulauf zum IFC aufgegeben.Zweitens führen Sie das Lademischungs-Skript aus, um die Proben und Assays in den Chip zu laden. Sobald das Skript abgeschlossen ist, ziehen Sie die Schutzfolie vom beladenen Chip ab und entfernen Sie Staubpartikel oder Rückstände von der Chipoberfläche mit Klebeband. Richten Sie nun das Verstärkungsprogramm des Biosystems ein.Laden Sie den Chip in das System ein und führen Sie das Programm aus. Die Ergebnisse können mit der Fluid-Dime-Software analysiert werden, um Amplifikationskurven, Heatmaps des gesamten Chips und CT-Werte für jedes Experiment zu erhalten. Verwenden Sie prä-PCR-Produkte, die durch Größenseparation an nativen Polyacrylamidgelen gereinigt wurden, Wildtyp DG CR acht und ER-Nullmutante.Die RNA wurde im Vergleich zu früheren Protokollen aufbereitet. Durch den Reinigungsschritt treten sowohl mehr Mikro-RNAs als auch eine Verringerung falsch-positiver Signale in beiden Hintergründen – DGCR8-defizient und ER-defizient – auf. Außerdem ermöglicht die modifizierte qRT-PCR-Methode eine korrekte Klassifizierung seltener, DGCR8-unabhängiger, Dicer-abhängiger kleiner RNAs.Hier wurden 48 Cerumen-Proben von Patienten und Kontrollpersonen auf Expressionsänderungen von 384 verschiedenen Mikro-RNAs untersucht. Die Daten wurden für jede Probe normalisiert, indem der entsprechende Median abgezogen wurde, ohne Verwendung eines Spike-Ins in den Kontrollen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine multiplexe Q-R-T-P-C-R auf einer Flu-Line-Plattform verwendet werden kann, um Hunderte von Mikro-RNAs gleichzeitig in vielen Proben zu charakterisieren, selbst wenn die Ausgangsmenge an RNA sehr begrenzt ist.

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Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Wir beschreiben die Verwendung einer Multiplex-Hochdurchsatz-Genexpressionsplattform, die die Genexpression durch Barcoding und Zählen von Molekülen in biologischen Substraten quantifiziert, ohne dass eine Amplifikation erforderlich ist. Wir nutzten die Plattform, um die Expression von microRNA (miRNA) im Vollblut bei Probanden mit und ohne Reizdarmsyndrom zu quantifizieren.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Wir beschreiben eine Methode, um einzelne Säugetierzellen zu sortieren und die Expression von bis zu 96 Zielgenen von Interesse in jeder Zelle zu quantifizieren. Diese Methode beinhaltet die Verwendung interner qPCR-Standards, um die Schätzung der absoluten Transkriptzahlen zu ermöglichen.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Hier präsentieren wir Ihnen die detaillierten Protokolls in die BioMILD screening-Verfahren zur Durchführung des zirkulierenden MicroRNA Signatur Klassifikator Tests zur Früherkennung von Lungenkrebs Krebs.

MicroRNA Based Flüssigbiopsie: Die Erfahrung der Plasma MiRNA Signatur Klassifikator (MSC) für Lung Cancer Screening

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

In diesem Artikel wird ein Hochdurchsatzprotokoll zur schnellen und zuverlässigen Bestimmung der Genexpressionsniveaus in einzelnen oder massenhaften C. elegans Proben beschrieben. Dieses Protokoll erfordert keine RNA-Isolierung und erzeugt cDNA direkt aus Proben. Es kann zusammen mit hochdurchsatzigen multiplexed nanofluidischen Echtzeit-qPCR-Plattformen verwendet werden.

Quantitative RT-PCR mit hohem Durchsatz in Einzel- und Bulk-C. elegans Proben mit Nanofluidic-Technologie

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