Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle und zuverlässige automatisierte Einrichtung von QPCR-basierten Arrays zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Primer-Sets für das Array vorbereitet und die Sample-Mastermixe für das Screening eingerichtet werden. Anschließend wird entweder ein automatisiertes robotergestütztes PCR-Setup oder ein elektronisches Matrixpipettensystem verwendet, um den Eloqua-Proben-Mastermix und die Primer-Sets genau in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte zu setzen.

Nach der Vorbereitung werden die 384-Well-PCR-Reaktionen mit dem Light Cycler Four 80 cyber-basierten PCR-Programm durchgeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die QPCR-Daten zu analysieren und die relativen Expressionsniveaus für jedes getestete Primerpaar zu bestimmen, von denen jedes auf eine bestimmte mRNA abzielt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Expression großer Mengen von mRNAs zeigen.

Speziell entwickelte Arrays können daher durch QPCR-basiertes Profiling auf ganze Prä-Mikro-RNA-Profile, spezifische Signalwege oder Moleküle abzielen, die für eine Virusinfektion von entscheidender Bedeutung sind. Hallo, ich bin Dirk DMA vom Department of Microbiology and Immunology an der University of North Carolina at Chapel Hill. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie QQPC rra in Echtzeit einrichten, und wir zeigen Ihnen zwei Methoden.

Eine mit einer unregelmäßigen Pipette und eine mit einem Roboter. Wir verwenden diese Technologie, um prä-microRNAs und reife microRNAs in menschlichen Tumoren zu messen. Die heutige Demonstration wird von Pauline Chu und Kristen Bu durchgeführt.

Also lasst uns loslegen. Um diesen Vorgang zu starten, entnehmen Sie Primerplatten mit 186 Primerpaaren in einer 96. Well-Format bei 0,5 picaMol bei minus 20 Grad Celsius gelagert.

Nachdem Sie die Platten bei Raumtemperatur aufgetaut haben, vortexen und kurz zentrifugieren. Tauen Sie auch zweimal Cyber Green auf, PCR-Mix bei Raumtemperatur, für die Einrichtung jeder 96-Well-Primerplatte werden vier Mastermix-Röhrchen benötigt. Bereiten Sie den Mastermix vor, indem Sie vier Mikroliter Cyber Green Mix, drei Mikroliter Wasser in PCR-Qualität und 10 bis 20 Nanogramm Proben-DNA oder CDNA pro Reaktion in jeweils vier Einor-Röhrchen mit zwei Millilitern kombinieren.

Jedes Röhrchen sollte genügend Mastermix für ca. 100 Reaktionen enthalten, so dass überschüssiger Abfall zum Pipettieren verwendet werden kann. Wirbeln Sie die Einor-Röhren zum Mischen ein. Beginn der Einrichtung des Vorläufer-microRNA-Assays mit dem freedom Tecan EVO Roboter mit der Initialisierung des Roboters und dem Laden des EVO-Verschleißprogramms.

Spülen Sie den Roboter dann dreimal mit 30 Millilitern Systemflüssigkeit, um das System von Luftblasen zu befreien, die die Pipettiergenauigkeit beeinträchtigen. Richten Sie als Nächstes die Roboterplattform so ein, dass sie eine 384-Well-Platte und eine 96-Well-Primerplatte enthält. Der Master mischt einen Trog mit 2 % Bleichmittel, ein gefülltes System, einen Flüssigkeitsbehälter und einen leeren Abfallbehälter.

Starten Sie den automatisierten Roboterlauf, indem Sie am Ende des Programms zweimal Ausführen auswählen. Entfernen Sie die 384-Well-Platte und versiegeln Sie sie mit Light Cycler Four 80 Deckenfolie. Dann zentrifugieren Sie die Platte.

Platzieren Sie die versiegelte 384-Well-Platte kurz in Position eins des Hotels. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang für die zweite Grundierungsplatte mit neuen Mastermixen und einer neuen 384-Well-Platte. Platzieren Sie das resultierende versiegelte 384-Weltschild an Position zwei des Hotels.

Öffnen Sie ein neues EVO-Verschleißprogramm, um den Light Cycler aus dem Hotel zu laden und stellen Sie die Fahrradparameter ein. Wählen Sie dann zweimal ausführen aus. Freedom Evo legt jede Platte automatisch in den Light Cycler und führt das cyber green one HRM Cycling-Programm aus.

Sobald abgeschlossen. Überprüfen und analysieren Sie die Ergebnisse, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben, als Alternative zur Verwendung des Roboters. Eine elektronische Matrix-Mehrkanalpipette kann verwendet werden, um den Inhalt des Mastermix-Röhrchens eins in ein Reservoir zu geben.

Stellen Sie die elektronische Pipette so ein, dass 16 Mikroliter Mastermix mit zwei Acht-Mikroliter-Dispensierschritten aspiriert werden, gefolgt von einem Spülschritt. Nachdem Sie die Pipette eingestellt haben, aspirieren Sie 16 Mikroliter Mastermix und beginnen Sie mit der Abgabe in eine 384er Radplatte. Geben Sie die ersten acht Mikroliter in jede zweite Zeile der ersten Spalte mit den Zeilen A bis O ab und lassen Sie die nächste Spalte leer.

Sie die zweiten acht Mikroliter in die gleichen Reihen der dritten Spalte. Spülen Sie dann einen Abfallbehälter und entsorgen Sie die Tipps nach diesem Muster, bei dem abwechselnde Zeilen und abwechselnde Spalten übrig bleiben. Geben Sie für weitere fünf Zyklen auf die Platte, um den Mastermix zwei zu pipettieren.

Verwenden Sie die gleichen Zeilen wie beim ersten Master-Mix, beginnen Sie jedoch mit Spalte zwei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Master-Mixe drei und vier, beginnend mit den Spalten eins bzw. zwei, aber diesmal mit Rose B bis P.Her-Zitat der Grundierungsplatte. Stellen Sie eine elektronische Pipette so ein, dass sie zwei Mikroliter aspiriert, und geben Sie zwei Mikroliter ab, wobei ein Spülschritt folgt.

Übertragen Sie zwei Mikroliter Primer von Spalte eins Reihe A nach H einer 96-Well-Primerplatte auf jede zweite Rudersäule, spülen Sie eine der 384-Well-Platten über einen Abfallbehälter und entsorgen Sie die Spitzen. Wiederholen Sie dieses Muster für die Quatt-Grundierung für die drei verbleibenden Mastermixe der Spalten eins und zwei. Setzen Sie diesen Vorgang dann für die Spalten zwei bis 12 der 96-Well-Primerplatte fort und bewegen Sie sich für jede Primersäule über alle zwei Säulen in der 384-Well-Platte.

Versiegeln Sie anschließend die Platten mit einer leichten Cyclerdecke, Folie und Zentrifuge. Kurz nach der Zentrifugation. Legen Sie die Platten in einen Light Cycler four 80 und schalten Sie die Platten im cyber green one HRM-Erkennungsformat ein.

Wiederholen Sie diesen Vorgang unter den gleichen Zyklusbedingungen wie zuvor, indem Sie die Primerplatte zwei Eloqua mit frisch zubereiteten Mastermixen in eine frische 384-Well-Platte einfüllen. Vorläufer-Mikro-RNA-Signaturen entstehen durch Profiling unter Verwendung eines neuartigen QPCR-basierten Arrays. Die durchschnittliche Delta-CT normalisiert auf U sechs wurde berechnet und die standardisierten Werte wurden in das Array geladen.

Kleinere Software, die drei verschiedene Cluster liefert, die als Heatmaps angezeigt werden. Die relative Expression jeder Vorläufer-microRNA ist dargestellt, rot und blau stellen eine Zunahme bzw. Abnahme der relativen Expression dar. Die Farbintensität gibt den Grad der Ausdrucksänderung an.

Die Mehrzahl der Vorläufer-microRNAs erfuhr erwartungsgemäß kleine, unbedeutende Veränderungen. Ein kleiner Teil der Vorläufer-microRNAs nahm jedoch im Laufe des Zeitverlaufs des Experiments signifikant zu. Darüber hinaus nahm der relative Spiegel einiger Vorläufer-microRNAs dramatisch ab.

In einigen Fällen. Sie werden auch in der Heatmap-Analyse geclustert. Je nach Experiment können Cluster entstehen, die von der Virusinfektion, der zelltypspezifischen Expression von Vorläufer-microRNAs oder Vorläufer-microRNAs, die durch ein gemeinsames Molekül oder einen gemeinsamen Signalweg reguliert werden, abhängig sind.

Die durchschnittlichen Zyklusschwellenwerte oder cts einer Posey-Sarkom-assoziierten Herpesvirus-negativen Probe mit Quad-Duplikat sind dargestellt. Wichtig ist, dass das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus-Latenz-assoziierte nukleare Antigen oder KSHV Lana in dieser Probe mit dem hochempfindlichen QPCR-Array nicht nachgewiesen werden konnte. Sowohl die interne Kontrolle U sechs als auch die Siebte, eine stark exprimierte humane Vorläufer-Mikro-RNA, wurden jedoch in nachweisbaren Mengen exprimiert.

Schließlich ergab die Negativkontrolle von Wasser in PCR-Qualität erwartungsgemäß kein A-Q-P-C-R-Produkt. Eine Schmelzkurvenanalyse für zwei verschiedene Primer. Bei Verwendung desselben Stichprobendukats wird ein Duplikat angezeigt.

Es ist klar, dass die Schmelztemperatur für die beiden Primerpaare unterschiedlich ist, aber die Probe schmilzt für jedes Replikat bei genau der gleichen Temperatur. Anzeichen für eine schlechte oder potenziell kontaminierte Probe können mehrere Schmelzspitzen sein, die auf das Vorhandensein von zwei verschiedenen Eintragsquellen hindeuten. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie ein Echtzeit-QPCR-Experiment mit einem Roboter einrichten können.

Es ist wichtig, dass Sie alle Kontrollen und so viele Haushaltsgene wie möglich einbeziehen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.