Name: Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Einrichtung von QPCR-Arrays zur Analyse von Pre-microRNA- und microRNA-Expression in menschlichen Tumoren. Diese Methode ermöglicht präzise und effiziente molekularbiologische Untersuchungen.

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Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt DE018304, R01DE018281 unterstützt. KT wird durch T32 GM07092-34 und durch einen Zuschuss an die University of North Carolina at Chapel Hill vom Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die Med in Grad Initiative unterstützt. PC wird durch T32 CA009156 unterstützt.

Der qPCR pre-miRNA Profiling Arrays können so eingerichtet werden, wie voll ausgestattet mit einem Tecan Freedom EVO-Roboter (A) oder von Hand mit der Matrix elektronischen Mehrkanalpipette (B) automatisiert. 1) Vorbereiten des Master-Mix, Primer-Platten und Proben. <ol><li> Primer-Platten mit 186 Primerpaare in 96-well-Format (insgesamt 2 Platten) am 12.05 sollte bei -80 ° C gelagert werden Thaw Platten bei Raumtemperatur, vortexen, zentrifugieren kurz vor Gebrauch. </li><li> Zur Vorbereitung der Master-Mix, auftauen SYBR Green 2x PCR Mix bei Raumtemperatur. Jede Reaktion verwendet 8ul Master-Mix mit 2UL Primer. Die Zusammensetzung des Mastermix pro Reaktion ist 4ul SYBR-Mix, 3UL PCR-Wasser und 10-20 ng Proben-DNA oder cDNA. </li><li> Für die Einrichtung eines jeden 96-Well-Platte Primer werden vier Master-Mix Rohre benötigt werden. Die Proben können bis zu 4 Proben pro Platte (singlicate), 2 Proben pro Platte (doppelte) oder einer einzigen Probe in vierfacher Ausfertigung ausgeführt werden. </li><li> Bereiten Master-Mix durch die Kombination von SYBR-, Wasser-und Probe in jedem der 4-2ml Eppendorf-Röhrchen. Jedes Rohr sollte genug Mastermix für ca. 100 Reaktionen, so dass überschüssige zum Pipettieren Abfall. Vortex mischen. </li></ol> A. Aufbau der pre-miRNA-Assays unter Verwendung der Freedom Tecan Evo Roboter. <ol><li> Nach der Initialisierung des Roboters und das Laden des EVOware Programm, spülen dreimal mit 30mls je System von Luftblasen, die mit Pipettiergenauigkeit stören klar. </li><li> Richten Sie die Roboter-Plattform, die folgendes beinhalten: <ul><li> Labeled 384-Well-Platte </li><li> 96-well-Primer Platte (1) </li><li> Master-Mixes </li><li> Eine Wanne mit 2% Bleichmittel </li><li> Ein gefüllter System Fluidbehälter </li><li> Leere Abfallbehälter </li></ul></li><li> Begin automatisierten Roboter ausführen, indem Sie "Run" zweimal. </li><li> Am Ende des Programms, zu entfernen 384-Well-Platte und Dichtung mit LightCycler 480 Dichtfolie und kurz zentrifugieren. Ort versiegelt 384-Well-Platte in Position 1 des Hotels. </li><li> Gehe zu 2,2 Step &amp; Repeat für Primer 2 mit neuen Master-Mixes und ein neues 384-Well-Platte. <ol><li> Ort versiegelt Platte in Position 2 des Hotels. </li></ol></li><li> Öffnen Sie ein neues EVOware Programm für Laden der Lightcycler vom Hotel, und wählen Sie "Run" zweimal. <ol><li> Freedom Evo wird automatisch geladen jede Platte in den LightCycler und führen Sie den folgenden SYBR-Green I / HRM PCR-Programm: Pre (1 Zyklus): 50 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec 95 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec Amp (45 Zyklen): 95 ° für 15 Sekunden an der Rampe von 4,8 ° / sec 62 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 2,5 ° / sec (Single Datenerfassung während dieses Schritts) Schmelzkurve: 95 ° für 5 sec an der Rampe von 4,8 ° / sec 60 ° für 1 Minute bei Anstieg von 2,5 ° / sec 95 ° kontinuierlich an der Rampe Rate von .11 ° / sec mit 5 Akquisitionen pro ° C Cool: 50 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 25 ° / sec </li></ol></li></ol> B. Aufbau der pre-miRNA-Assays unter Verwendung der Matrix elektronischen Mehrkanalpipette: <ol><li> Legen Sie Inhalte des Master-Mix Röhre 1 in ein Reservoir. </li><li> Stellen Sie die elektronische Pipette absaugen 16ul des Master-Mix mit 2-8ul verzichten Schritte von einem Spülschritt gefolgt. </li><li> Für Master-Mix 1, verzichten 8ul in jeden anderen auch der 384-Well-Platte (Set auf 384-well Spitze Abstand), beginnend mit gut A1. (Dh Brunnen A1, C1, E1, etc.) Für das zweite 8ul verzichten, gehen Sie zu Spalte 3 (dh Brunnen A3, C3, E3, etc.), dann purge über einen Abfallbehälter und entsorgen Tipps. </li><li> Folgen Sie diesem Muster für die restlichen 5 Zyklen, bis Sie auch A23 zu erreichen. </li><li> Wiederholen Sie dies für Master-Mix 2, (beginnend mit gut A2, C2, E2, etc.); Master-Mix 3 (Anfang an gut B1, D1, F1, etc.); Master-Mix 4 (ab B2, D2, F2, usw. .). </li><li> Für Aliquotierung der Primer Platte, setzen elektronische Pipette absaugen und 2UL verzichten 2UL mit einem Spülschritt folgenden. Dispense 2UL von Primern aus Spalte 1 der 96-Well-Platte Primer (AH) in den 384-Well-Platte, Brunnen A1, C1, E1, etc. Purge über einen Abfallbehälter und entsorgen Tipps. Wiederholen Sie für Brunnen A2, C2, E2, B1, D1, F1, und B2, D2, F2, etc. </li><li> Wiederholen Sie für die Zeilen 2-12 der 96-Well-Primer, schwebte über alle 2 Spalten für jeden Primer Spalte bis zur vollständigen 384-Well-Platte wurden aliquotiert hat. </li><li> Seal-Platten mit einem LightCycler Dichtfolie und kurz zentrifugieren. </li><li> Legen Platten in eine LightCycler 480 und radeln die Platten nach der folgenden Einstellungen mit dem SYBR Green I / HRM Erkennung Format: Pre (1 Zyklus): 50 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec 95 ° für 5 Minuten an der Rampe von 4,8 ° / sec Amp (45 Zyklen): 95 ° für 15 sec bei Anstiegsgeschwindigkeitvon 4,8 ° / sec 62 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 2,5 ° / sec (Single Datenerfassung während dieses Schritts) Schmelzkurve: 95 ° für 5 sec an der Rampe von 4,8 ° / sec 60 ° für 1 Minute bei Anstieg von 2,5 ° / sec 95 ° kontinuierlich an der Rampe Rate von .11 ° / sec mit 5 Akquisitionen pro ° C Cool: 50 ° für 30 Sekunden an der Rampe von 25 ° / sec </li><li> Wiederholen Sie die Verwendung von Primer Platte 2, Aliquotierung in ein frisches 384-Well-Platte mit frisch zubereiteten Mastermixen. </li></ol> Geheimnisse zum Erfolg: Ein wichtiges Merkmal bei der Gestaltung PCR-Arrays ist, dass Alle 186 Primerpaare die gleiche Annealingtemperatur haben, so dass die Platte bei der gleichen optimalen PCR-Lauf-Programm-Einstellungen können ausgeführt werden. Jede neue Array sollte mithilfe drei Kontrollen vor dem Ausführen von Proben. Diese Kontrollen sind: 1 laufen alle Primer mit Wasser oder .1 x TE ausführen, um auszuschließen, Primer Kontamination. 1 von wechselnden Wasser / TE und der positiven Kontrolle laufen, keine Verschleppung zu gewährleisten. 3 läuft mit der gleichen positiven Kontrolle, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Läufen zu gewährleisten. Master-Mix sollte frisch zubereitet werden, und die Platten sollten innerhalb von 24 Stunden für optimale Ergebnisse ausgeführt werden Primer Platte Folie sollte langsam entfernt werden, um das Risiko von Kontaminationen zwischen den Wells zu reduzieren. Bei Verwendung eines Roboters mit festen Spitzen, 2% Bleichmittel waschen notwendig, um die Spitzen zwischen den einzelnen Pipettierschritt, durch eine Wasserspülung gefolgt waschen. Dies verhindert und beseitigt Verschleppung, die sonst kontaminieren könnten Daten und führen zu eindeutigen Ergebnisse. Nach einer Platte durch die Lightcycler ausgeführt wird, sollte es nicht wieder in die PCR Setup Raum geöffnet werden. Dies verhindert, dass PCR Kontamination. Repräsentative Ergebnisse: qPCR Ergebnisse sind in der Regel durch CT-Werte als von der Lightcycler Analyse-Software ermittelt vertreten. Ein erfolgreicher laufen in der Regel aus einer Reihe von CTs für Proben, in der Regel zwischen 20-35 für Proben, die positiv sind. Die Wasserproben in einem guten Lauf sind immer an einem CT von&gt; 40 und jedes Muster oder spezielle Vertiefungen mit einer CT über 37 sind als negativ oder nicht erkannt. In der Regel werden die Proben wodurch ein CT von &lt;10 auch unzuverlässig und werden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, qPCR-Daten und die Einbindung der internen Kontrollen in unserem Test zu analysieren hilft bei der Kontrolle für die Variation der Probe-Eingang. Die Pre-miR-Array enthält eine U6-Grundierung, die oft als Referenz-Gen auf CT-Werte von verschiedenen Proben zu normalisieren wird. Dieser normierte Wert wird als Delta-CT-Wert (DCT) bezeichnet. Die Ergebnisse werden oft als das rohe CT, die DCT-Wert graphisch dargestellt oder kann weiter auf standardisierte Werte analysiert werden. In Abbildung 1, die Analyse der volle Vor-microRNA Array von vier verschiedenen Proben aus einem Zeitverlauf Experiment ist in Heat Map-Format präsentiert. Die relative Expression jedes pre-miRNA wird gezeigt und drei große, unterschiedliche Cluster entstanden. Die Mehrheit der pre-Mirs analysiert unterzog kleine, unbedeutende Änderungen wie erwartet (Abbildung 1A). Allerdings waren ein kleiner Teil der Pre-microRNAs signifikant verringert (Abbildung 1B) oder dramatisch zugenommen (Abbildung 1C) in der gesamten Zeitverlauf zu experimentieren. Ebenen des Ausdrucks der einzelnen Vor-microRNA wurden die 0h Zeitpunkt (Probe 1) als Grundlage Niveau normalisiert. In einigen Fällen können Sie feststellen, dass einige der Cluster-pre-microRNAs auch Cluster zusammen in der Heatmap-Analyse (ex: let-7a, Abbildung 1B). Je nach Experiment, Cluster entstehen kann, dass abhängig sind Virusinfektion, Zelltyp spezifische Expression von pre-microRNAs oder Pre-Mirs, dass durch ein gemeinsames Molekül oder-Signalweg reguliert werden. Die pre-miRNA-Test, dass wir auch entwickelt haben, enthält eine Reihe von bekannten viralen pre-microRNAs und Gene, die durch das Kaposi-Sarkom assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) in Ergänzung zu den menschlichen Vor-Mirs kodiert. Diese können als positive oder negative Kontrollen verwendet werden, je nach Zelllinie und virale Status der Proben verwendet. In Abbildung 2 sind die durchschnittlichen CTs von einem KSHV-negative Probe in vierfacher Ausführung gezeigt. Wichtig ist, dass KSHV LANA nicht in diesem Beispiel durch die hochsensitive qPCR-Arrays detektiert. Allerdings U6 - unsere internen Kontroll-und let-7a - waren ein hoch exprimierten humanen Pre-microRNA, in nachweisbaren Mengen exprimiert. Schließlich, wie erwartet, hat die negative Kontrolle der PCR-grade Wasser nicht zu einem qPCR Produkt. Ein weiterer Indikator für eine erfolgreiche qPCR laufen ist ein guter Schmelzkurvenanalyse, die Einblick in die mögliche Kontamination in den Proben geben kann. Um eine Schmelztemperatur wird die Platte langsam nach der PCR ist komplett beheizt. Da die DNA-Stränge zu trennen, wird SYBR green veröffentlicht und Fluoreszenz-Signal abnimmt. Die Temperatur, bei der diese drop auftritt, ist grafisch dargestellt, und ist als die Schmelztemperatur der Probe bekannt. Abhängig von der DNA-Sequenz, Proben bei verschiedenen Temperaturen voneinander und aus dem Wasser negative Kontrolle, die nicht über eine Schmelztemperatur, da keine DNA vorhanden ist, zu schmelzen. Die PCR-Produkte von jedem Primerpaar sollte bei ähnlichen Temperaturen schmelzen. Zum Beispiel zeigt Abbildung 3 a Schmelzkurvenanalyse für zwei verschiedene Primer mit der gleichen Probe in zweifacher Ausfertigung. Es ist klar, dass die Schmelztemperatur für die beiden Primerpaare ist aber die Probe auf die exakt gleiche Temperatur schmelzenden für jede Wiederholung. Anzeichen für eine schlechte oder potenziell kontaminierten Probe kann mehrere Schmelzpeaks, was auf die Anwesenheit von zwei verschiedenen Quellen der Eingabe. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Pre-microRNA Signaturen entstehen durch Profilierung mit einem neuartigen qPCR-basierte Arrays. Die durchschnittliche deltaCTU6 wurde berechnet und standardisierte Werte wurden in ArrayMinerTM Software geladen, was zu 3 verschiedene Cluster als Heatmaps angezeigt. (A) Pre-microRNAs mit kleinen Veränderungen in der Expression gezeigt werden. Pre-microRNAs, deren Pegel deutlich zurückgegangen (B) oder erhöht (C) sind ebenfalls dargestellt. Blau entspricht unteren Ebenen des Ausdrucks, während rote Expression erhöht ist. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Einbeziehung der internen Kontrollen in der qPCR-basierte Pre-microRNA Array. Die rohen CT-Werte für 3 verschiedene Gene und keine Vorlage Kontrolle angezeigt. U6 wird als interne positive Kontrolle verwendet, während PCR H2O dient uns als negative Kontrolle. Let-7a-1-1 ist eine microRNA normalerweise in vielen verschiedenen Zelltypen exprimiert, während KSHV LANA entweder eine positive oder negative Kontrolle, auf die virale Status der Zelllinie oder Gewebe verwendet Basis verwendet werden können. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Schmelzpeak Analyse der Vor-microRNA Primer und der Mangel an Probenkontamination. Schmelzkurven wurden mit dem Tm Aufruf Analyse in der LightCycler-Software. Zwei verschiedene Primer (Primer A und B) für die gleiche Probe in zweifacher Ausführung gezeigt. Die Schmelztemperatur für jedes Primerpaar unterscheidet. Allerdings hat die Probe nur einen Peak, was die mangelnde Probenkontamination.

<ol><li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chem%22%5BJournal%5D)">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Frégeau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li>
<li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li>
</ol>

QPCR ist ein hochempfindliches Verfahren, die zur Genexpression zwischen den Proben vergleichen in einer Studie werden können, sowie Positivität im Falle von Viren zu bestimmen. Der Vorteil der Verwendung von qPCR-Arrays ist die Fähigkeit, viele Primer (in unserem Fall, 186 Primerpaare) für jede Probe laufen in einem kurzen Zeitraum. Mit einem Pipettierroboter wie die Tecan Freedom EVO, der viel Zeit benötigt, um ein Experiment zu weiter reduziert werden kann, festgelegt, und die Genauigkeit und Konsistenz des Roboters ...

<table><tbody><tr><td>Freedom Evo 150</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>30017587</td><td></td></tr><tr><td>Matrix elektronische Mehrkanalpipette</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2001-MTX</td><td>(oder vergleichbare Thermo Scientific Mehrkanalpipette, die die oben beschriebenen Volumina pipettieren kann)</td></tr><tr><td>Matrix Integrity Filter-Spitzen, steril</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>7435</td><td>(oder vergleichbare Spitzen für die verwendete Mehrkanalpipette)</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td><td>Roche Group</td><td>04 707 516 001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Instrument II</td><td>Roche Group</td><td>05015243001</td><td>384-Well-Version</td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Multiwell-Platte 384, weiß</td><td>Roche Group</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Versiegelungsfolie</td><td>Roche Group</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td><td>Roche Group</td><td>05075122001</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase Dekontaminationsmittel</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-31</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling von pre-micro rnas und micrornas mittels quantitativer real-time pcr (qpcr) arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (qPCR) ist als eine genaue und wertvolle Hilfe in der Profilierung der Genexpression Ebenen entstanden. Einer der vielen Vorteile ist eine untere Nachweisgrenze im Vergleich zu anderen Methoden der Genexpressions-Profiling bei der Verwendung kleiner Mengen von Input für jeden Test. Automatisierte qPCR Setup hat auf diesem Gebiet, indem sie für höhere Reproduzierbarkeit verbessert. Dank der günstigen und schnellen Aufbau ermöglicht Hochdurchsatz-Experimenten, so dass die Profilierung von vielen verschiedenen Genen gleichzeitig in jedem Experiment. Diese Methode zusammen mit internen Platte steuert reduziert auch experimentelle Variablen gemeinsam mit anderen Techniken. Wir haben vor kurzem entwickelte eine qPCR-Assay für die Profilierung von pre-microRNAs (pre-miRNAs) mit einem Satz von 186 Primerpaare. MicroRNAs haben als eine neue Klasse von kleinen, nicht-kodierende RNAs mit der Fähigkeit, viele mRNA-Ziele in der post-transkriptioneller Ebene regulieren entstanden. Diese kleinen RNAs werden zunächst durch RNA-Polymerase II als primäres miRNA (pri-miRNA) Transkript, die dann in die Vorläufer miRNA (pre-miRNA) gespalten wird transkribiert. Pre-miRNAs sind in das Zytoplasma, wo Dicer spaltet die Haarnadelschleife zu reifen miRNAs Ertrag exportiert. Erhöht in miRNA Ebenen können sowohl die Vorstufe und reifen miRNA Ebenen und Profilierung der beiden Formen beobachtet werden kann sinnvoll sein. Es gibt mehrere kommerziell erhältliche Assays für die reife miRNAs, aber ihre hohen Kosten können die Forscher von diesem Profiling-Technik abzuschrecken. Hier diskutieren wir eine kostengünstige, zuverlässige und SYBR-basierte qPCR-Methode des Profiling pre-miRNAs. Änderungen in pre-miRNA Ebenen spiegeln oft reife miRNA Änderungen und kann ein nützlicher Indikator für reife miRNA-Ausdruck sein. Allerdings kann die gleichzeitige Profilierung sowohl pre-miRNAs und reifen miRNAs optimal sein, da sie nicht-redundanten Informationen können dazu beitragen und geben Einblick in microRNA Verarbeitung. Darüber hinaus kann die hier beschriebene Technik erweitert, um die Profilierung der anderen Bibliothek Sets für spezifische Signalwege oder Krankheitserreger umfassen.

Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Die quantitative Real-Time-PCR (qPCR) hat sich als präzises und wertvolles Instrument zur Profilierung von Genexpressionsniveaus etabliert. Einer ihrer vielen Vorteile ist eine geringere ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine schnelle und zuverlässige automatisierte Einrichtung von auf QPCR basierenden Arrays zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Primer-Sets für das Array vorbereitet und die zu untersuchenden Proben-Master-Mischungen hergestellt werden. Anschließend wird entweder ein automatisiertes robotisches PCR-Setup oder ein Matrix-Elektronikpipettensystem verwendet, um die Proben-Master-Mischung und die Primer-Sets präzise in jede Vertiefung einer 384-Loch-Platte einzubringen.Nach der Vorbereitung werden die PCR-Reaktionen in 384-Well-Platten mit dem Light Cycler Four 80 cyberbasierten PCR-Programm durchgeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht in der Analyse der QPCR-Daten und der Bestimmung der relativen Expressionsniveaus für jedes getestete Primerpaar, von denen jedes eine spezifische mRNA gezielt anspricht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen in der Expression großer Mengen von mRNAs zeigen.Spezifisch entwickelte Arrays können daher ganze Prä-micro-RNA-Profile, bestimmte Signalwege oder für virale Infektionen entscheidende Moleküle mittels QPCR-basierter Profilerstellung gezielt ansprechen. Hallo, ich bin Dirk DMA vom Department für Mikrobiologie und Immunologie an der University of North Carolina in Chapel Hill. Heute zeigen wir Ihnen, wie man eine Echtzeit-QQPC rra aufbaut, und stellen Ihnen zwei Methoden vor.Eine Methode unter Verwendung einer manuellen Pipette und eine unter Verwendung eines Roboters. Wir nutzen diese Technologie, um prä-mikroRNAs und reife mikroRNAs in menschlichen Tumoren zu messen. Die heutige Demonstration wird von Pauline Chu und Kristen bu durchgeführt.Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, entnehmen Sie Primer-Platten, die 186 Primer-Paare im 96-Well-Format mit einer Konzentration von 0,5 pM bei minus 20 Grad Celsius gelagert enthalten.Nach dem Auftauen der Platten bei Raumtemperatur schwenken und kurz zentrifugieren. Außerdem zweimal den Cyber Green PCR-Mix bei Raumtemperatur auftauen. Für die Vorbereitung jeder 96-Loch-Primer-Platte werden vier Master-Mix-Röhrchen benötigt. Den Master-Mix herstellen, indem je nach Reaktion in jedem der vier 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen 4 Mikroliter Cyber Green-Mix, 3 Mikroliter PCR-Grad-Wasser und 10 bis 20 Nanogramm an Proben-DNA oder cDNA kombiniert werden. Jeder Tube sollte genügend Master-Mix für etwa 100 Reaktionen enthalten, um Pipettierabfälle auszugleichen. Die Eppendorf-Röhrchen vortexen, um sie zu mischen. Beginnen Sie mit dem Aufbau des Precursor-micro-RNA-Assays unter Verwendung des Freedom-Tecan-EVO-Roboters, indem Sie den Roboter initialisieren und das EVO-Wear-Programm laden.Spülen Sie den Roboter anschließend dreimal mit je 30 Milliliter Systemflüssigkeit, um Luftblasen aus dem System zu entfernen, die die Pipettiergenauigkeit beeinträchtigen würden. Richten Sie danach die Roboterplattform so ein, dass sie eine 384-Loch-Platte und eine 96-Loch-Primer-Platte enthält. Der Master mischt einen Trog, der 2 % Bleiche enthält, einen gefüllten Systemflüssigkeitsbehälter und einen leeren Abfallbehälter.Starten Sie den automatisierten Roboterdurchlauf, indem Sie am Ende des Programms zweimal „Ausführen“ auswählen. Entfernen Sie die 384-Well-Platte und versiegeln Sie sie mit Light-Cycler-Vier-80-Deckelfolie. Zentrifugieren Sie anschließend die Platte.Bringen Sie die verschlossene 384-Well-Platte kurzfristig in Position eins des Hotels an. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend für Primer-Platte zwei mit neuen Master-Mixes und einer neuen 384-Well-Platte. Stellen Sie die resultierende verschlossene 384-Well-Platte in Position zwei des Hotels.Öffnen Sie ein neues EVO-Bedienprogramm, um den Light Cycler vom Hotel aus zu beladen, und stellen Sie die Zyklenparameter ein. Wählen Sie anschließend zweimal „Ausführen“. Der Freedom Evo lädt automatisch jede Platte in den Light Cycler und führt das Cyber-Green-One-HRM-Zyklenprogramm durch.Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, überprüfen und analysieren Sie die Ergebnisse gemäß der schriftlichen Anleitung als Alternative zur Verwendung des Roboters. Eine Matrix-elektronische Mehrkanalpipette kann verwendet werden, um den Inhalt des Master-Mix-Röhrchens nacheinander in ein Reservoir zu übertragen.Stellen Sie die elektronische Pipette so ein, dass sie 16 Mikroliter Master-Mix mit zwei Abgabeschritten à acht Mikroliter und anschließendem Spülschritt ansaugt. Nach dem Einstellen der Pipette 16 Mikroliter Master-Mix ansaugen und mit der Abgabe in eine 384-Rad-Platte beginnen. Die ersten acht Mikroliter in jede zweite Zeile der Spalte eins abgeben, wobei die Zeilen A bis O verwendet werden, und die nächste Spalte frei lassen.Geben Sie die zweiten acht Mikroliter in dieselben Reihen der Spalte drei. Spülen Sie dann über einen Abfallbehälter und entsorgen Sie die Spitzen nach diesem Muster, bei dem abwechselnd Reihen und Spalten freigelassen werden. Geben Sie fünf weitere Zyklen lang quer über die Platte, um den Master-Mix zwei zu pipettieren.Verwenden Sie dieselben Reihen wie bei Mastermix eins, beginnen Sie jedoch mit Spalte zwei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Mastermischungen drei und vier, wobei Sie jeweils mit Spalte eins und zwei beginnen, diesmal jedoch Rose B bis P.Her unter Zitierung der Primerplatte verwenden. Stellen Sie eine elektronische Pipette so ein, dass sie zwei Mikroliter ansaugt und zwei Mikroliter abgibt, gefolgt von einem Spülschritt.Übertragen Sie zwei Mikroliter Primer von Spalte eins, Reihe A bis H einer 96-Loch-Primerplatte auf jede zweite Spalte in Reihe eins der 384-Loch-Platte; entsorgen Sie die Spitzen nach dem Abstoßen über einen Abfallbehälter. Wiederholen Sie dieses Muster für den nächsten Primer für die drei verbleibenden Master-Mixes der Spalten eins und zwei. Fahren Sie anschließend mit den Spalten zwei bis zwölf der 96-Loch-Primerplatte fort, wobei jeweils alle zwei Spalten in der 384-Loch-Platte pro Primer-Spalte übersprungen werden.Als Nächstes versiegeln Sie die Platten mit einem Light-Cycler-Deckel, Aluminiumfolie und zentrifugieren. Kurz nach der Zentrifugation stellen Sie die Platten in einen Light Cycler 480 und führen die Platten mit dem CybrGreen-I-HRM-Nachweissystem durch.Unter Verwendung der gleichen Zyklierungsbedingungen wie zuvor wird dieses Verfahren unter Einsatz der Primer-Platte zwei Eloqua in einer neuen 384-Loch-Platte mit frisch hergestellten Master-Mixen wiederholt. Vorläufer-mikro-RNA-Signaturen werden durch Profilierung mittels eines neuartigen qPCR-basierten Arrays sichtbar. Der mittlere Delta-CT-Wert, normiert auf U sechs, wurde berechnet, und die standardisierten Werte wurden in das Array eingetragen.Kleinere Software zeigt drei unterschiedliche Cluster als Wärmekarten an. Die relative Expression jedes Vorläufer-microRNA ist dargestellt, wobei Rot eine Zunahme und Blau eine Abnahme der relativen Expression anzeigt. Die Farbintensität kennzeichnet das Ausmaß der Expressionsänderung.Die Mehrheit der präkursorischen microRNAs zeigte, wie erwartet, geringfügige, statistisch nicht signifikante Veränderungen. Ein kleiner Teil der präkursorischen microRNAs nahm jedoch im Verlauf des Zeitreihenexperiments signifikant zu. Zusätzlich sank das relative Niveau einiger präkursorischer microRNAs drastisch.In einigen Fällen gruppieren sie sich auch gemeinsam in der Heatmap-Analyse. Je nach Experiment können Cluster auftreten, die von einer Virusinfektion abhängen, zelltypspezifische Expression von precursor-microRNAs aufweisen oder precursor-microRNAs, die durch ein gemeinsames Molekül oder einen gemeinsamen Signalweg reguliert werden.Die durchschnittlichen Zyklenschwellenwerte oder cts aus einer Posey-Sarkom-assoziierten Herpesvirus-negativen Probe, die in vierfacher Duplikatmessung durchgeführt wurde, sind dargestellt. Wichtig ist, dass das mit dem Kaposi-Sarkom assoziierte Herpesvirus-Latens-assoziierte nukleäre Antigen oder KSHV Lana in dieser Probe mittels des hochsensitiven QPCR-Arrays nicht nachgewiesen wurde. Sowohl die interne Kontrolle U sechs als auch let sieben a, ein stark exprimiertes menschliches präkursorisches Mikro-RNA, waren jedoch in nachweisbaren Mengen exprimiert.Schließlich ergab die negative Kontrolle mit PCR-Reinstwasser, wie erwartet, kein A-Q-P-C-R-Produkt. Eine Schmelzkurvenanalyse für zwei verschiedene Primer unter Verwendung derselben Proben-Duplikate ist dargestellt.Es ist ersichtlich, dass die Schmelztemperatur für die beiden Primer-Paare unterschiedlich ist, jedoch schmilzt die Probe bei jeder Wiederholung exakt bei derselben Temperatur. Anzeichen für eine schlechte oder möglicherweise kontaminierte Probe können mehrere Schmelzpeaks sein, die auf das Vorhandensein zweier verschiedener Eingangsquellen hindeuten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen Echtzeit-QPCR-Versuch mithilfe eines Roboters einrichtet.Es ist wichtig, dass Sie alle Kontrollen und so viele Housekeeping-Gene wie möglich einbeziehen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Ein einfaches Verfahren zur Durchführung benutzerdefinierte microRNA Microarray-Experimenten beschrieben. Die Schritte umfassen Isolierung von RNA, die Kennzeichnung RNA und DNA-, Hybridisierung der Proben auf Microarrays, Scannen der Microarrays, Quantifizierung und Analyse Hybridisierungssignale.

Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Das Vorhandensein von stabilen microRNAs (miRNAs) in exosomes hat immense Interesse als neue Art der interzellulären Kommunikation erzeugt, für ihre potenziellen Nutzen als Biomarker und als Weg für eine therapeutische Intervention. Hier zeigen wir exosome Reinigung von Blut und Kulturmedien durch quantitative PCR gefolgt, um miRNAs transportiert identifizieren.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.

Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

Hier wird ein quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsprotokoll zur Bestimmung des nativen Mikro-RNA-Gehalts (absolute/relativ) von Lipoprotein-Partikeln vorgestellt. Darüber hinaus wird eine Methode zur Erhöhung des Mikro-RNA-Niveaus sowie eine Methode zur Bestimmung der zellulären Aufnahmevorrate von Lipoprotein-Partikeln demonstriert.

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Lernen Sie die automatisierte Einrichtung von QPCR-Arrays zur Analyse von Pre-microRNA- und microRNA-Expression in menschlichen Tumoren. Diese Methode ermöglicht präzise und effiziente molekularbiologische Untersuchungen.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

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