Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden. Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Anteil stammähnlicher Zellen innerhalb einer Krebszelllinie oder Tumorgewebeprobe abzuschätzen und ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung über aufeinanderfolgende Passagen zu bewerten. Zu diesem Zweck wird eine Krebszelllinie oder ein Tumorgewebe aufbereitet, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, die dann sortiert wird, um CD 44 positive und CD 24 negative zelluläre Untergruppen zu isolieren. Die Zellen werden auf niedrige Anhaftungsplatten ausgesät, haben Zeit zum Wachstum und werden dann mit einer lichtmikroskopischen Kugel untersucht.

Die Umformeffizienz wird quantifiziert, indem die Anzahl der Kugeln, die sich gebildet haben, im Verhältnis zur Anzahl der ursprünglich ausgesäten Zellen bestimmt wird. Der Prozess der Erzeugung einer Einzelzellsuspension, die Zeit für das Wachstum und die Bestimmung der Effizienz der Kugelbildung bietet, wird über aufeinanderfolgende Passagen wiederholt und liefert schließlich ein Maß für die Fähigkeit der Zellen zur Selbsterneuerung im Laufe der Zeit. Diese Methode bietet einen einfachen perspektivischen Assay zur Identifizierung von Zellen, die funktionelle Eigenschaften von Stammzellen aufweisen, wie z. B. Selbsterneuerung, sowie eine quantitative Schätzung der Anzahl von Stammzellen, die aus in vivo Tumoren stammen.

Ein zentraler Grundsatz von kugelbildenden Assays ist, dass jede Kugel von einer einzigen Zelle abgeleitet ist, die für klonal da ist. Aus diesen Gründen ist die Zelldichte der wichtigste Parameter dieses Assays, da sie einen entscheidenden Einfluss auf die Realität hat. Beginnen Sie diesen Vorgang mit MCF sieben oder MDA MB 2 3 1 Zellen, die zu 70 bis 80 % kofluent sind.

Das Medium wird aus dem Kolben abgesaugt, die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen. Geben Sie dann Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei bis sechs Minuten nach der Ablösung der Winde, indem Sie Mammos-Kugelmedium mit 10 % FBS hinzufügen. Sobald sich die Zellen gelöst haben, geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und drehen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur um 200 μg.

Nach der Zentrifugation die Senna dekantieren. Dann reanimation die Zellen in ein bis fünf Millilitern Manosphärenmedium und pipettieren Sie 10 Mal auf und ab, um das Zellpellet aufzubrechen. Führen Sie als nächstes die Zellsuspension weiter zu einem 40-Mikron-Zelltrainingskappenfilter und sammeln Sie den Durchfluss in dem beigefügten Schlauch.

Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, lege ich ein 20-Mikroliter-Aliquot der resuspendierten Zellen auf ein Hämozytometer und untersuche es mit einem Mikroskop. Wenn Zellcluster beobachtet werden, wie hier zu sehen, verwenden Sie eine Spritze, um die Suspension ein- oder zweimal in eine 25-Gauge-Nadel hinein- und herauszumassieren. Sobald die Zellen wie hier gezeigt in eine Einzelzellsuspension dispergiert wurden, ziehen Sie sich zurück, um CD 44-positive CD 24-negative zelluläre Untergruppen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellbeschaffung oder magnetisch aktivierte Zellquelle zu isolieren.

Verwenden Sie eine LS-Spalte, um die positiven Zellen der CD 44 positiv auszuwählen. Da die gewünschten Zellen an den Wänden der LS-Säule befestigt sind, verwerfen Sie den Durchfluss und entfernen Sie dann die Zellen aus der Säule. Tragen Sie fünf Milliliter Puffer auf und setzen Sie den mit der Säule gelieferten Kolben auf und drücken Sie ihn, um die gewünschten Zellen auszuspülen.

Verwenden Sie als Nächstes eine LD-Säule, um die Population durch Negativselektion weiter zu reinigen. Hier sind die CD 24 positiven Zellen an den LD-Säulen befestigt. Sammeln Sie den Fluss, durch den die CD 24 negative Zellen enthält.

Bestätigen Sie anschließend mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Phänotypen aller isolierten Zellen. Berechnen Sie mit der Trian-Blau-Ausschlussmethode die Dichte lebensfähiger Zellen nach entsprechender Verdünnung der Zellsuspension. Besiedeln Sie jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit ultraniedrigem Aufsatz mit 500 bis 4.000 Zellen im Quadratzentimeter in zwei Millilitern vollständiger Mammos-Kugel. Mittel.

Inkubieren Sie die Platten fünf bis 10 Tage lang und achten Sie darauf, sie nicht zu stören, bis Kugeln beobachtet werden. Kultivieren Sie weiter, bis die Kugeln einen Durchmesser von mindestens 40 Mikrometern haben, sich aber noch nicht zu drehen begonnen haben. Apoptotisch. Gewinnung von menschlichem Brustkrebsgewebe von Patientinnen, die sich einer Operation zur Entfernung von Brusttumoren unterziehen.

Lagern Sie das Taschentuch bis zu 24 Stunden in 50 Millilitern auf Eis. Sterile Röhrchen aus DMEM mit 100 Einheiten pro Milliliter, Penicillin und 100 Einheiten pro Milliliter. Streptomycin bei der Arbeit unter einer sterilen Gewebekulturhaube.

Die Probe wird mit einer sterilen Schere, einem Skalpell und einer Pinzette in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit einem kleinen Volumen des Mediums überführt. Entfernen Sie das Fettgewebe. Geben Sie zwei bis drei Milliliter D-M-E-M-F 12 hinzu und zerkleinern Sie die Probe mit einem sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge, bis keine großen Stücke mehr übrig sind.

Reeses biegen die Gewebestücke und 10 Milliliter vorwarmes DMEM, das proteolytische Enzyme enthält, und inkubieren es ein bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Rotationsschüttler. Wenn lebensfähige Primatentumorzellen mit Verdauungsenzymen gestapelt werden, besteht ein kritischer Kompromiss zwischen Zelltod und ausreichender Extraktion aus der zellulären Matrix zu ins. Stellen Sie sicher, dass der Erfolg entscheidend ist, um diese Verdauung regelmäßig zu überwachen Pipettieren Sie alle halbe Stunde 20 Mikroliter Suspension auf ein Hämozytometer und verwenden Sie ein Mikroskop, um den Grad der Verdauung zu beurteilen.

Sobald die Verdauung abgeschlossen ist. Lassen Sie die Fragmente fünf Minuten lang sedimentieren. Übertragen Sie dann das Supinat in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen.

Zentrifugieren Sie Ihre 200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Schleudern das Rückenlagemittel vorsichtig dekantieren und die Zellen in ein bis fünf Milliliter Mammos-Kugelmedium resuspendieren. Bereiten Sie dann einzellige Suspensionen vor und plattieren Sie sie, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.

Bitten Sie in diesem Video die Zellen maximal zweimal durch eine 25-Gauge-Spritze auf und ab, um die Zellen bei Bedarf zu dispergieren. Beobachten Sie die Zellen nach der Kulturperiode bei 40-facher Vergrößerung unter einem Mikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Erfassen Sie Bilder von fünf zufälligen Feldern.

Sobald alle Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie die Erfassungssoftware, um die Anzahl der Mikrokugeln zu bestimmen, die einen Durchmesser von mehr als 40 Mikrometern haben. Berechnen Sie schließlich die Effizienz der Metasphärenbildung. Indem ich die Anzahl der Mamos-Kugeln in jeder Vertiefung durch die Anzahl der in jeder Vertiefung ausgesäten Zellen multipliziere, wette ich das Medium, das die Mamos-Kugeln aus jeder Vertiefung enthält, in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie jede gut mit PBS und geben Sie es in das gesammelte Medium.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 115-facher G-Temperatur für 10 Minuten Raumtemperatur. Nach dem Spin die supinaten Andries ablegen. Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern vorwarmem Tryin EDTA für zwei bis drei Minuten.

Nach der Inkubation fügen Sie 500 Mikroliter FBS hinzu, um das Tryin zu neutralisieren, und zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei 500 mal G. Sobald die Drehung abgeschlossen ist, entsorgen Sie das Supinat und drehen Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Mammoskugel mit mittlerer Pipette auf und ab, um alle Kugeln zu disaggregieren. Zählen Sie erneut mit einem Hämozytometer die Zellen und stellen Sie fest, ob sie sich in einer Einzelzellsuspension dispergiert haben.

Wenn nicht, führen Sie sie bis zu zweimal durch eine 25-Gauge-Spritze, um einzelne Zellen zu erhalten, und säen Sie die Zellen in ein neues Ultralow aus. Anlage sechs, Well-Platte mit der gleichen Dichte, die in der Primärgeneration nach fünf bis 10 Tagen verwendet wurde, Kugeln größer als 40 Mikrometer und Berechnung der Angstbildungseffizienz wie zuvor, um die Kugelbildungseffizienz zu schätzen. Atmosphären wurden aus einer epithelialen Östrogen-positiven CF 7 und einer mesenchymalen triple negativen MDA 2 3 1 Zelllinie gezüchtet, wie in diesem Video beschrieben. Die Anzahl der Mammossphären größer als 40 Mikrometer liefert eine Schätzung der Effizienz der Kugelbildung für jede Zelllinie.

Es ist zu beachten, dass die hier gezeigte minimale Zellfusionsaggregation durch eine Beschichtung mit geringer Dichte bei 500 Zellen pro Quadratzentimeter für MCF sieben und 1000 Zellen pro Quadratzentimeter für MDA 2, 3, 1 erreicht wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mammosphären züchtet und zählt, die aus einer anderen Zelllinie oder aus chirurgischen Tumorproben stammen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Zellen mit geringer Dichte zu säen, um die Klonalität zu gewährleisten und sicherzustellen, dass ein hoher Anteil der Zellen lebensfähig ist, wenn Zellen aus chirurgischen Proben

Zusätzlich zu diesem Verfahren sollten andere Methoden wie das Xenotransplantat von Zellpopulationen in immungeschwächte Mäuse durchgeführt werden, um in vivo die Generizität von Tumoren von Interesse zu bestimmen.