Name: Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die Mammosphären-Bildungsanalyse zur Quantifizierung stammzellähnlicher Zellen in Brustkrebsproben. Diese Methode ermöglicht die Bewertung der Selbsterneuerungskapazität und tumorigenen Potenziale.

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Diese Arbeit wird von der kaiserlichen BRC, dem Nationalen Institut für Gesundheitsforschung und Krebsbekämpfung mit besonderer Erwähnung Hilary Craft und Sir Douglas Myers unterstützt.

Die Verfahren sind speziell ethisch von Imperial College, London zugelassen. 1. Erzeugung von Primär Mammospheres von menschlichen Brustkrebszelllinien HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter einer Sterilkultur Kapuze. <ol><li> Bereiten Mammosphere Medien DMEM / F12 mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 U / ml Streptomycin. Bereiten komplettem Medium unmittelbar vor der Verwendung durch Zugabe von 20 ng / ml rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF; Sigma), 10 ng / ml rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF; R &amp; D Systems) und 1x B27 Supplement. </li><li> Absaugen Medien aus Kolben mit adhärenten MCF-7 oder MDA-MB-231-Zellen (oder eine Brustkrebszelllinie Ihrer Wahl; 70-80% Konfluenz), waschen zweimal in 1x PBS und trypsinieren Zellen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 200 · g bei Raumtemperatur für 5 min. Dekantieren und resuspendieren Zellen in 5.1 ml mammosphere Medien. Pipettenach oben und unten und ggf. mit einer 40 um Zellsieb Kappe Filter auf Einzelzellsuspension zu erhalten. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um sicherzustellen, eine Einzelzellsuspension gebildet hat (wenn nicht, verwenden Sie eine 25 G Nadel, um die Zellsuspension bis 3 mal spritze). </li><li> Ggf. Isolat CD44 + CD24- Zellmenge über FACS unter Verwendung von Anti-CD24-Phycoerythrin (PE) und Anti-CD44-Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -Antikörper 9. Alternativ zu isolieren, wie Bevölkerung mit einem Magnetrührer aktivierte Zellsortierung (MACS) System mit Anti-CD44 und anti-CD24-Biotin kombinierten Mikroperlen nach Herstellerangaben. Führen Sie eine positive Selektion mit LS Spalten und negative Selektion mit LD Spalten und bestätigen Sie die Phänotypen aller isolierten Zellen mittels Durchflusszytometrie 17. </li><li> Berechnung der Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml unter Verwendung von Trypanblau. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen wird als die Anzahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Gitter geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen an der hemocy berechnetenMeter. Zellen, die bis zu Trypanblau gelten als nicht lebensfähig. Das folgende Verfahren wird verwendet, um genau zu bestimmen Anteil der lebensfähigen Zellen. <ol><li> Bereiten Sie eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau in PBS. Fügen Sie 0,1 ml Trypanblau-Stammlösung zu 1 ml der Zellen. Legen Sie eine Zählkammer und unverzüglich zu untersuchen unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung. Zählen die Anzahl der Gesamtzellen und der Anzahl der blauen Färbung Zellen. Lebensfähige Zellen = [1.00 - (Anzahl der blauen Zellen ÷ Anzahl der gesamten Zellen)] × 100. </li><li> Um die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur zu berechnen, verwenden Sie die folgende Formel. Denken Sie daran, für den Verdünnungsfaktor zu korrigieren. Anzahl der lebensfähigen Zellen × 10 4 × 1,1 = Zellen / ml Kultur </li></ol></li><li> Resuspendieren eine vorgegebene Menge an Zellen in 2 ml Komplett mammosphere Medien in jede Vertiefung einer 6-Well-Ultra-Low-adhärenten Platte. Die Aussaatdichte beträgt normalerweise 500-4000 Zellen / cm 2 Zelle pro Vertiefung. Optional Verwendung low Aufsatz 24-Well-Platten, während Impfen Zellen mit gleicher Dichte in 0,5 ml Medium. HINWEIS: Wir empfehlen, die Optimierung der Aussaatdichte und Zeit der Kultur für jeden Zelllinien von Interesse. </li><li> Für 5-10 Tage (abhängig von der Zelllinie und der Größe mammospheres) Inkubieren ultra low-Anlage 6-Well-Platten bei 37 ° C und 5% CO 2, ohne die Platten zu stören, insbesondere während der Wachstumsphase der ersten 5 Tage . </li></ol> 2. Erzeugung von Primär Mammospheres von Human Breast Cancer klinischen Proben HINWEIS: Menschliche Brustkrebsgewebe von Patienten einer Operation zur Entfernung von Brusttumoren erhalten werden. Speicher Gewebe auf Eis für bis zu 24 h in 50 ml sterile Röhrchen in Kulturmedien, die 100 U / ml Penicillin und 100 U / ml Streptomycin. Führen Sie folgende Schritte im Rahmen einer Sterilkultur Kapuze. <ol><li> Übertragen der Probe in eine 100 mm Gewebepetrischale mit einem kleinen Volumen von Medien. Remove das Fettgewebe mit Hilfe einer sterilen Schere, Skalpell und Pinzette. </li><li> Fügen Sie 2-3 ml DMEM / F12 und Blatt vor der Probe in 1 mm 3 Stück mit einem sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge, bis keine großen Stücke bleiben. </li><li> Resuspendieren der Gewebestücke in vorgewärmter 10 ml DMEM mit proteolytischen Enzymen (3.000 U / ml Kollagenase und 1.000 U / ml Hyaluronidase) und bei 37 ° C in einem Rotationsschüttler, bis alle Gewebefragmenten verdaut werden. In der Regel vollständige Verdauung dauert 1-3 Stunden. Stellen Sie die Kochzeit nach pathologischen Zeichen von Tumoren. (Zum Beispiel Brust-Adenokarzinom ist in der Regel schwerer zu verdauen, verglichen mit muzinösen Karzinomen, die empfindlicher ist und benötigt kürzere Aufschlusszeit). Bewerten Sie den Grad der Verdauung jede halbe Stunde durch die Beobachtung 20 ul Suspension unter Zählkammer. </li><li> Ermöglichen die Fragmente für 5 min sedimentieren, dann den Überstand in einem 15 ml konischen Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 10 min bei Raum temtur. Dekantieren Sie vorsichtig von den Überstand und resuspendieren Zellen in 1-5 ml mammosphere Medien. </li><li> Folgen Sie den oben für Zelllinien zu erhalten und plattenEinzelZellSuspensionen beschriebenen Schritte 1,1-1,4. Pass-Zellen durch die Spritze 25 G für bis zu 2-mal, wenn notwendig, schädlichen Zellen zu begrenzen. </li></ol> 3. Mammosphere Forming Wirkungsgrad (%) Berechnung <ol><li> Nach der Kulturzeit, zählen die mammospheres (größer als 40 um) Durchmesser unter einem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Digital Bild 5 zufälligen Feldern mit einer Digitalkamera auf einem Lichtmikroskop und bestimmen den mammospheres Größe mit der Erfassungssoftware. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Software. </li><li> Berechnen Mammosphere Bildungseffizienz (MFE%) mittels der folgenden Gleichung: MFE (%) = (Anzahl der mammospheres pro Vertiefung) / (Anzahl der Zellen pro Vertiefung ausgesät) x 100 </li></ol> 4. Serien Passagieren von Mammospheres zur Bewertung der Selbsterneuerung <ol><li&gt; Pipette die Medien, die die mammospheres aus jeder Vertiefung in eine 15-ml-Tube. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und fügen Sie den gesammelten Medien. Zentrifuge bei 115 × g für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 500 ul vorgewärmtem 0,5% Trypsin / 0,2% EDTA. Inkubationszeit von 2-3 min. </li><li> Fügen Sie 500 ul FCS Trypsin zu neutralisieren. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet in 100 ul mammospheres Medien, Auf- und Abpipettieren zu Kugeln zu zerlegen. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hämozytometer und festzustellen, ob Zellen in Einzelzellsuspension. Wenn nicht durch eine 25 G passieren Spritze bis zu 3 mal, um Einzelzellen zu erhalten. Samen, die Zellen in eine neue Ultra Low-Befestigung 6-Well-Platte mit der gleichen Dichte im Primärerzeugung verwendet. </li><li> Nach 5-10 Tagen rechnen Bereichen&gt; 40 &amp; mgr; m und berechnen Sphäre Bildungseffizienz mit Hilfe der Formel bereits berichtet. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt, der als Beeinträchtigung der Unparteilichkeit dieses Artikels angesehen werden könnte.

Erfolgreiche Bewertung der primären und sekundären mammospheres stützt sich auf Zellen, die bei ausreichend niedrigen Dichten, die Form mammospheres von Einzelklonen, mit minimalen Bereich Aggregation überzogen. Jedoch bei Dichten, die zu niedrig sind, können zu wenige mammospheres bilden, um die Auswirkungen der Behandlungen statistisch unterscheiden. Für jede Zelllinie verwendet, da sie erheblich in ihrer Sphäre bildet Effizienz variieren können, sollten Aussaatdichte optimiert werden (die niedrigen E-Cadherin exprimi...

Die Existenz von Tumorzelllinien durch stielartigen Krebsstammzellen geleitet hat wesentlich zum Verständnis der Tumorheterogenität aufgenommen. Während einige phänotypische Vielfalt in Tumoren nicht aus der klonalen Auswuchs von genetisch unterschiedlichen Klone entstehen, wird ein wesentlicher Bestandteil von epigenetischen Unterschiede ergeben: Krebszellen zwischen Stammzellen, Vorläufer und differenzierte Staaten über die Aktivierung oder Unterdrückung der spezifischen Gens (manchmal auch reversibel) übergehen kann Ausdruck Programme 1-3. Dies kann Zelle intrinsische oder extrinsische Faktoren widerspiegeln, was die Genexpression Programm, das gerade in einer Zelle mit ihrer resultierenden autokrine Signalisierung in Verbindung mit parakrinen Signalisierung von benachbarten Krebs, Stromazellen oder Immunzellen liefert modulierende Faktoren exprimiert und microenviromental Bedingungen, wie der Grad der Hypoxie 2,4,5. Obwohl innovative Linie Tracing Ansätzeavancieren unsere Fähigkeit, vermeintliche Krebsstammzellen in ihrer in vivo Nische 6 studieren - 8, bleiben Kugel bildenden Tests zu einem beliebten und bequemen Umgang mit potenziellen Brustkrebszellen &#39;schätzen, wie Stammzellen zumindest unter den Testbedingungen verwendet verhalten. Es wird häufig neben retrospektiven Verfahren zur Reinigung von Krebsstammzellen verwendet wird, durch ihre Expression von Membranmarker CD44 und CD24 9 und Aktivität des Enzyms ALDH (Aldehyd Dehydrogenase) 10, Marker, die vorgeschlagen wurden, um entsprechen mehr mesenchymal- und epithelialen -ähnliche Krebsstammzellen bzw. 11. Die Kugelbildung Ansatz wurde zuerst als Neurosphäre Assay entwickelt, um somit das Wachstum von putativen Stammzellen aus einzelnen Klonen in nichthaftenden, serumfreien Bedingungen mit der Zugabe von epithelialen Wachstumsfaktor (EGF) 12, wobei später nutzbringend auf normalen und kanzerösen angewendet Brustgewebe. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Identität der Kugel bildenden Gründerzelle, und die gemischten Zelltypen, aus denen die Kugel Masse, sind für die Folgerungen, die sich aus Mammographie oder andere Kugel bilden Tests gemacht werden können relevant. Langfristige Ruheknochen fide Stammzellen, gedacht, um in G0-Phase ruhen, nicht die genaue Kombination von Faktoren, die Aktivierung in vivo begünstigen würde zu erleben. Die mammosphere Assay ermöglicht stattdessen das Wachstum von Zellen entweder balanciert für mitotische Teilung oder bereits Division 13. Diese Vorläuferzellen, die aber nicht eine wirklich ruhende Zelle kann die Zell-Stadium, die mit den im Test verwendeten EGF und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) Mitogene vermehrt sein. Trotzdem enthalten sie eine Reihe von aktivierten Stammzellen-assoziierten Signalwege 14. Darüber hinaus ist die Geschwindigkeit ihrer Entstehung betrifft die Tumorigenität der Gewebe sie abgenommen hat, wenn sie durch ihre Wirksamkeit in begrenzter Verdünnung Assays in Maus-Xenotransplantaten 2,15,16 gemessen &lt;/ Sup&gt;. Hier stellen wir ausführliche Protokolle um einzelne Zellen zu isolieren, und zum Generieren von Primär mammospheres sowohl von menschlichen Brustkrebs-Zelllinien und klinischer Proben von Brusttumoren. Wir beschreiben auch, wie serielle Passagen von Primär mammospheres durchführen, um die Selbsterneuerung zu bewerten und wie zu berechnen Sphäre Bildungseffizienz, die einen Vergleich zwischen verschiedenen Einsaatdichten (siehe Schema in Abbildung 1) ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Penicillin & Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Rekombinanter humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin/0,2 % EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit geringem Aufsatz</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Rasierklingen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Skalpell</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mikrodissektion Schere</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

mammosphere formation assay von menschen brustkrebs geweben und zelllinien

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Ähnlich wie bei gesunden Geweben, viele Blut und solide Tumore sind jetzt vermutlich hierarchisch organisiert werden, mit einer Teilmenge der stielartigen Krebszellen, die selbst zu erneuern, während, die zu differenzierteren Nachkommen. Das Verständnis und die Ausrichtung dieser Krebsstammzellen bei Brustkrebs, die verstärkt Chemo- und Strahlenresistenz im Vergleich zu den nicht-Stammtumormasse besitzen kann, ist zu einem wichtigen Forschungsgebiet. Die mammosphere Assay wurde auch bekannt durch ihre Fähigkeit, im Nachhinein zu ermitteln kugel- verwendet: Markierungen einschließlich CD44, CD24 und ALDH-Aktivität kann unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) prospektiv isolieren Zellen, die eine verbesserte Tumorigenität anzuzeigen, wenn in immunsupprimierten Mäusen implantiert beurteilen bildenden Zellen, die aus einzelnen Stammzellen wie Klone zu entwickeln. Hier beschreiben wir Ansätze für die entsprechende Kultivierung mammospheres von Zelllinien oder primären Patientenproben, ihren Passagieren und Berechnungen zur Sphäre f schätzenorming Effizienz (SFE). Zuerst diskutieren wir wichtige Überlegungen und Fallstricke in der entsprechenden Planung und Auslegung von mammosphere Experimente.

Verschiedene Proben oder Personen unterschiedlichen Behandlungen unterworfen wird, kann die Anzahl der mammospheres&gt; 40 um, die nach der Normalisierung für Ausgangszellen ausgesät bilden variieren. Berechnen mammosphere Bildungseffizienz (MFE) für jede Behandlung in drei Exemplaren gezüchtet. Dies ermöglicht Experimente mit verschiedenen Einsaatdichten verglichen werden. Die Daten werden am besten auf einem Balkendiagramm dargestellt, idealerweise mit Positiv- und Negativkontrollen, und die Anzeige der Standardabweic...

Schwimmende Mammosphären-Assays können die Untergruppe von stammähnlichen Brustkrebszellen untersuchen, die unter Suspensionsbedingungen überleben und eine erhöhte Tumorgenese zeigen, wenn sie in Mäuse implantiert werden. Dieses Protokoll bietet eine bequeme in vitro Messung der kugelbildenden Fähigkeit, einen Proxy für die in vivo Tumorgenese, und erleichtert gleichzeitig die Analyse der stammassoziierten Transkriptionslandschaft.

Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Anteil stammzellähnlicher Zellen innerhalb einer Krebszelllinie oder einer Tumorgewebeprobe abzuschätzen und ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung über mehrere Passagen hinweg zu bewerten. Dazu wird eine Krebszelllinie oder ein Tumorgewebe verarbeitet, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen, die anschließend sortiert wird, um CD44-positive und CD24-negative Zellsubpopulationen zu isolieren. Die Zellen werden in Platten mit niedriger Anheftung ausgesät, es wird Wachstumszeit eingeräumt und danach mittels Lichtmikroskopie auf Kugelbildung untersucht.Die Bildungseffizienz wird quantifiziert, indem die Anzahl der gebildeten Sphäroide im Verhältnis zur ursprünglich ausgesäten Zellanzahl bestimmt wird. Der Prozess der Erzeugung einer Einzelzell-Suspension, der Gewährung von Zeit für das Wachstum und der Bestimmung der Sphäroid-Bildungseffizienz wird über aufeinanderfolgende Passagen hinweg wiederholt und liefert letztlich ein Maß für die Fähigkeit der Zellen zur Selbsterneuerung im Zeitverlauf. Diese Methode bietet einen einfachen funktionellen Test, um Zellen zu identifizieren, die Eigenschaften von Stammzellen wie die Selbsterneuerung aufweisen, sowie eine quantitative Abschätzung der Anzahl von Stammzellen, die aus in-vivo-Tumoren stammen.Ein zentrales Prinzip von Sphere-Formations-Assays besteht darin, dass jede Sphere von einer einzelnen Zelle abstammt und somit klonal ist. Aus diesem Grund ist die Zelldichte der wichtigste Parameter dieses Assays, da sie einen entscheidenden Einfluss auf die Vitalität hat. Arbeiten Sie unter einem sterilen Gewebekulturhauben. Beginnen Sie dieses Verfahren mit MCF seven- oder MDA MB 2 3 1-Zellen, die 70 bis 80 % konfluent sind.Entfernen Sie das Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Geben Sie dann Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie für zwei bis sechs Minuten, gefolgt von der Ablösung mit Mammosphärenmedium, das 10 % FBS enthält. Sobald sich die Zellen gelöst haben, überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-konisches Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie mit 200 × g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.Nach der Zentrifugation dekantieren Sie die Senna ab. Suspendieren Sie die Zellen anschließend in ein bis fünf Milliliter Manosphärenmedium und pipettieren Sie zehnmal auf und ab, um den Zellpellet aufzulösen. Danach geben Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb und sammeln das Durchflussvolumen im angeschlossenen Röhrchen.Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, pipettieren Sie ein 20-Mikroliter-Aliquot der resuspendierten Zellen auf ein Hämozytometer und untersuchen diese mithilfe eines Mikroskops. Wenn Zellklumpen beobachtet werden, wie hier gezeigt, massieren Sie die Suspension ein- oder zweimal mit einer Spritze durch eine 25-Gauge-Nadel. Sobald die Zellen, wie hier dargestellt, in eine Einzelzell-Suspension dispergiert sind, fahren Sie fort, um CD44-positive und CD24-negative Zellsubpopulationen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder magnetisch aktivierter Zellsortierung zu isolieren.Verwenden Sie eine LS-Säule, um die CD44-positiven Zellen positiv zu selektieren. Da die gewünschten Zellen an den Wänden der LS-Säule haften, entsorgen Sie das Durchflussvolumen und gewinnen Sie anschließend die Zellen aus der Säule. Geben Sie fünf Milliliter Puffer auf und verwenden Sie den mitgelieferten Kolben, um die gewünschten Zellen aus der Säule zu eluieren, indem Sie diesen nach unten drücken.Als Nächstes verwenden Sie eine LD-Säule, um die Population durch negative Selektion weiter zu reinigen. Hier binden die CD24-positiven Zellen an die LD-Säulen. Sammeln Sie den Durchlauf, der die CD24-negativen Zellen enthält.Als Nächstes bestätigen Sie mithilfe der Durchflusszytometrie die Phänotypen aller isolierten Zellen. Berechnen Sie anhand der Trypanblau-Ausschlussmethode die Dichte vitaler Zellen, nachdem die Zellsuspension angemessen verdünnt wurde. Säen Sie jeweils 500 bis 4.000 Zellen pro Quadratzentimeter in zwei Milliliter vollständigem Mammosphären-Medium in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte mit ultraniedriger Anhaftung aus.Inkubieren Sie die Platten vorsichtig, ohne sie zu stören, für fünf bis 10 Tage, bis Sphären beobachtet werden. Setzen Sie die Kultivierung fort, bis die Sphären mindestens 40 Mikrometer im Durchmesser aufweisen, sich aber noch nicht beginnen abzulösen. Apoptotisch. Gewinnen Sie menschliches Brustkrebsgewebe von Patientinnen, die sich einer Operation zur Entfernung von Brusttumoren unterziehen.Bewahren Sie das Gewebe bis zu 24 Stunden lang auf Eis in 50 Milliliter sterilen Röhrchen in DMEM auf, das 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Einheiten pro Milliliter Streptomycin enthält, unter Arbeit in einer sterilen Zellkulturhaube.Überführen Sie die Probe mit sterilen Scheren, einem Skalpell und einer Pinzette in eine 100 Millimeter große Zellkultur-Schale, die eine kleine Menge Medium enthält. Entfernen Sie das Fettgewebe. Geben Sie zwei bis drei Milliliter D-M-E-M-F 12 hinzu und zerkleinern Sie die Probe mit einem sterilen Skalpell oder einer Rasierklinge, bis keine größeren Stücke mehr vorhanden sind.Reesen biegen die Gewebestücke und 10 Milliliter vorgewärmtes DMEM, das proteolytische Enzyme enthält, und inkubieren sie 37 Grad Celsius in einem rotierenden Schüttler für eine bis drei Stunden. Wenn lebensfähige primatentumorzellen mittels Verdauungsenzymen isoliert werden, besteht ein kritischer Kompromiss zwischen Zelltod und ausreichender Gewinnung aus der zellulären Matrix. Um Erfolg sicherzustellen, ist es unerlässlich, diese Verdauung regelmäßig zu überwachen. Alle halbe Stunde pipettieren Sie 20 Mikroliter der Suspension auf ein Hämozytometer und bewerten mithilfe eines Mikroskops den Grad der Verdauung.Nach Abschluss der Verdauung die Fragmente fünf Minuten sedimentieren lassen. Anschließend den Überstand in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Polypropylenrohr überführen.Zentrifugieren Sie Ihre Probe 10 Minuten lang mit 200 × g bei Raumtemperatur. Nach dem Zentrifugieren entsorgen Sie vorsichtig das Überstandsmittel und resuspendieren die Zellen in ein bis fünf Milliliter Mammosphärenmedium. Bereiten Sie anschließend Einzelzell-Suspensionen vor und geben Sie sie auf die Platte, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben.Bei diesem Video pipettieren Sie die Zellen bei Bedarf maximal zweimal auf und ab durch eine 25-Gauge-Spritze, um die Zellen zu dispergieren. Nach der Kultivierungszeit beobachten Sie die Zellen unter einem Mikroskop mit digitaler Kamera bei 40-facher Vergrößerung. Nehmen Sie Bilder von fünf zufälligen Feldern auf.Nachdem alle Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie die Aufnahmesoftware, um die Anzahl der Mikrosphären zu bestimmen, deren Durchmesser größer als 40 Mikrometer ist. Berechnen Sie abschließend die Effizienz der Metasphärenbildung, indem Sie die Anzahl der Mamosphären in jedem Wells durch die Anzahl der in jedem Well ausgesäten Zellen teilen und mit 100 multiplizieren. Sammeln Sie das Medium, das die Mamosphären aus jedem Well enthält, in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie jedes Well mit PBS und geben Sie die Waschflüssigkeit zum gesammelten Medium hinzu.Anschließend die Zellen bei 115 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen. Den Pellet in 500 µL vorgewärmter Trypsin-EDTA-Lösung suspendieren und für zwei bis drei Minuten inkubieren.Nach der Inkubation 500 Mikroliter FBS hinzufügen, um die Trypsin-Aktivität zu neutralisieren, anschließend bei 500 × g fünf Minuten lang zentrifugieren. Sobald der Zentrifugiergang abgeschlossen ist, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 Mikrolitern Mammosphären-Medium resuspendieren, dabei mehrmals auf- und abpipettieren, um eventuelle Sphären aufzulösen. Anschließend die Zellen erneut mit einem Hämozytometer zählen und überprüfen, ob sie sich in eine Einzelzell-Suspension aufgelöst haben.Falls erforderlich, führen Sie sie bis zu zwei Mal durch eine 25-Gauge-Spritze, um Einzelzellen zu erhalten, und säen Sie die Zellen in eine neue ultraniedrig-bindende 6-Well-Platte mit der gleichen Dichte aus, die bei der primären Generierung verwendet wurde. Zählen Sie nach fünf bis zehn Tagen Sphäroide, die größer als 40 Mikrometer sind, und berechnen Sie die Sphäroidbildungs-Effizienz wie zuvor, um die Sphäroidbildungs-Effizienz abzuschätzen. Sphäroide wurden aus einer epithelialen, östrogenrezeptorpositiven CF7- und einer mesenchymalen, triple-negativen MDA-MB-231-Zelllinie gezüchtet, wie in diesem Video beschrieben. Die Zählung von Mammosphäroiden, die größer als 40 Mikrometer sind, liefert eine Schätzung der Sphäroidbildungs-Effizienz für jede Zelllinie.Beachten Sie, dass die hier beobachtete minimale Zellfusion-Aggregation durch eine dünnere Zellaussaat mit 500 Zellen pro Quadratzentimeter für MCF7 und 1000 Zellen pro Quadratzentimeter für MDA 231 erreicht wurde. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mammosphären kultiviert und zählt, die von verschiedenen Zelllinien oder von chirurgischen Tumorproben stammen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Zellen in niedriger Dichte auszusäen, um Klonalität sicherzustellen, und darauf zu achten, dass ein hoher Anteil der Zellen lebensfähig ist, wenn Zellen aus chirurgischen Proben isoliert werden.Zusätzlich zu diesem Verfahren sollten andere Methoden, wie die Xenotransplantation von Zellpopulationen in immundefiziente Mäuse, durchgeführt werden, um die in-vivo-Tumorgenität der interessierenden Gewebe zu bestimmen.

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Mammosphere Formation Assay von Menschen Brustkrebs Geweben und Zelllinien

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