Reproduzierbarer computerisiertes Verfahren zur Quantifizierung der Kapillardichte Verwendung nailfold Kapillaroskopie
27. Oktober 2015
Kapillaroskopie ist eine nicht-invasive, effiziente, relativ kostengünstige und leicht zu erlernende Methode zur direkten Visualisierung von Kapillaren in der Mikrozirkulation. Allerdings beschreibt bisher nur eine Veröffentlichung die Zuverlässigkeit eines komplexen Softwareprogramms zur Quantifizierung von Kapillaroskopie-Daten. Hier stellen wir ein einfaches, zuverlässiges Protokoll zur Quantifizierung von Kapillaren mit einem standardisierten Algorithmus vor.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anzahl der Kapillaren pro Quadratmillimeter in dem Hautareal direkt unterhalb des Nagelhauts zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Schwarz-Weiß-Bild des Nagelbetts unterhalb der Nagelhaut aufgenommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Bild in ein computergestütztes Bildbearbeitungsprogramm zu importieren.
Anschließend werden die Bilder bearbeitet, um die Kapillaren besser sichtbar zu machen. Im letzten Schritt werden alle Kapillaren innerhalb eines Quadratmillimeters identifiziert und gezählt. Letztendlich dient die Bildbearbeitung dazu, Anzahl und Morphologie der Kapillaren einer Person darzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im kardiovaskulären Bereich zu beantworten, beispielsweise wie Hypertonie, Diabetes und andere Erkrankungen die Mikrozirkulation beeinflussen können.
Erhalten Sie mithilfe einer monochromen Digitalkamera Kapillarbilder, wie zuvor beschrieben. Nehmen Sie anschließend Kalibrierungsbilder eines Lineals mit Millimetereinteilung unter denselben Kamera- und Vergrößerungsbedingungen auf, die auch zur Aufnahme der Kapillarbilder verwendet wurden. Importieren Sie das Bild des Lineals in das computergestützte Bildanalyseprogramm und messen Sie die Anzahl der Pixel in einer ein Millimeter langen Linie auf der Fotografie des Lineals.
Schreiben Sie diese Zahl auf und berechnen Sie die Anzahl der Pixel in einem Bereich von einem Millimeter mal einem Millimeter. Öffnen Sie anschließend eines der Kapillarbilder und verdunkeln Sie die Kapillaren sowie erhellen Sie den Hintergrund, indem Sie das Bild mithilfe einer optimal angepassten Histogrammverteilung justieren. Verwenden Sie danach den Befehl „ROI erstellen“ im Dropdown-Menü, um einen interessierenden Bereich von einem Millimeter mal einem Millimeter am oberen Bildschirmrand zu definieren.
Ziehen und positionieren Sie den Bereich von Interesse an die Stelle mit den klarsten Kapillarschleifen. Stellen Sie sicher, dass der Bereich von Interesse so platziert wird, dass die Spitzen der Kapillarschleifen sich ganz oben innerhalb des Bereichs befinden. Der Schlüssel zur Reproduzierbarkeit und Standardisierung dieses Schritts des Protokolls ist die korrekte Platzierung des quadratischen Bereichs von Interesse mit einer Größe von einem Quadratmillimeter.
Eine gute Faustregel zur Sicherstellung der Standardisierung besteht darin, das Feld an der Spitze oder am Ende der Kapillarschleifen des Bildes zu platzieren. Sobald es korrekt positioniert ist, klicken Sie auf die ROI und anschließend im erscheinenden Dropdown-Menü auf „Crop“. Danach wird das Bild vereinheitlicht, sodass alle zukünftigen Bildanpassungen gleichmäßig auf das gesamte Bild angewendet werden. Erhöhen Sie anschließend den Kontrast des Bildes auf 75, damit die Kapillaren optimal sichtbar werden.
Entfernen Sie außerdem die Bildrauschen, um die Kanten der Kapillaren zu glätten. Stellen Sie den Bildkontrast endgültig ein, indem Sie das Histogramm an das bestmögliche Modell anpassen, sodass die Kapillaren schwarz und der Hintergrund weiß erscheinen. Wählen Sie auf jedem Bild manuell einen Teil einer gut definierten Kapillare mithilfe der Zielobjektfunktion aus, damit diese als zu zählende Objekte vom Programm erkannt werden.
Danach mithilfe der Hintergrundfunktion einen kleinen Teil des Hintergrunds auswählen, um als Referenz für Bereiche zu dienen, die vom Zählalgorithmus ignoriert werden sollen. Stellen Sie den Mindestdurchmesser der zu zählenden Objekte auf fünf Pixel ein, um Hintergrundrauschen nicht als Kapillaren zu zählen. Verwenden Sie anschließend die Zählfunktion, um alle Kapillaren im Bild für jede Einzelperson sofort zu zählen.
Zählen Sie den Durchschnitt aus drei bis vier Bildern, um eine zuverlässigere Bewertung zu erhalten. Um Zeit zu sparen, erstellen Sie ein Makro, das automatisch eine bestimmte Abfolge von Prozessen auf einem oder mehreren Bildern ausführt, indem Sie zunächst „Makro aufzeichnen“ auswählen und das Makro basierend auf den in diesem Video durchgeführten und beschriebenen Schritten und Prozessen benennen. Führen Sie dann die Bildbearbeitungsschritte durch, während das Makro aufzeichnet.
Wenn das Makro bei zukünftigen Aufnahmen verwendet wird, klicken Sie einfach auf „Makro ausführen“, und das Programm wendet die aufgezeichneten Verbesserungen automatisch auf die gewünschten Bilder an. Der einzige Schritt, der eine Benutzereingabe erfordert, ist die Auswahl des Ausschnitts für den Bildausschnitt. Ein optimal verarbeitetes Bild kann innerhalb von 30 Sekunden ausgewertet werden und unterscheidet deutlich Kapillaren vom Hintergrund sowie einzelne Kapillaren voneinander.
Das endgültige verbesserte Bild ist hier dargestellt. Die für dieses Bild bestimmte Gesamtanzahl betrug 54 Kapillaren pro Quadratmillimeter. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um 12 Bilder innerhalb von 20 Minuten zu quantifizieren und zu bearbeiten.
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Übersicht
Die Kapillaroskopie ist eine nichtinvasive Methode zur Visualisierung von Kapillaren in der Mikrozirkulation. Dieser Artikel stellt einen zuverlässigen Protokollansatz zur Quantifizierung von Kapillaren mithilfe eines standardisierten Algorithmus vor.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrozirkulation
- Kapillarsichtbarmachung
- Kardiovaskuläre Forschung
Hintergrund
- Mittels Kapillaroskopie lässt sich eine direkte Beobachtung der Kapillaren ermöglichen.
- Bisherige Studien weisen begrenzte Zuverlässigkeitsdaten zu Software zur quantitativen Auswertung von Kapillaren auf.
- Diese Methode ist entscheidend für das Verständnis der Mikrozirkulation bei verschiedenen Erkrankungen.
- Die Quantifizierung von Kapillaren kann Einblicke in Zustände wie Hypertonie und Diabetes liefern.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Protokolls zur Kapillarenquantifizierung.
- Verbesserung des Verständnisses der Kapillarenmorphologie und -menge.
- Schließung von Lücken in bestehenden Methoden zur Kapillar-Analyse.
Verwendete Methoden
- Erfassen Sie ein monochromes Bild des Nagelbetts unterhalb der Nagelhaut.
- Importieren Sie das Bild in ein computergestütztes Bildbearbeitungsprogramm.
- Bearbeiten Sie das Bild, um die Kapillaren besser sichtbar zu machen.
- Identifizieren und zählen Sie die Kapillaren innerhalb eines definierten Bereichs (1 mm²).
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Kapillaren.
- Die Bildbearbeitung verbessert die Sichtbarkeit der Kapillarmorphologie.
- Diese Methode kann angewendet werden, um die Auswirkungen von Krankheiten auf die Mikrozirkulation zu untersuchen.
- Die Ergebnisse können die kardiovaskuläre Forschung und klinische Praxis beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist zuverlässig und einfach zu implementieren.
- Es liefert wertvolle Daten zum Verständnis der Mikrozirkulation.
- Diese Methode kann bei der Beurteilung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen helfen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Quantifizierung der Kapillardichte mittels computergestützter Nagelfalzkapillarmikroskopie beantwortet die dringende Notwendigkeit einer reproduzierbaren Beurteilung des Mikrogefäßsystems im frühen Entdeckungs- und translationsmedizinischen Forschungsbereich. Diese Methode verringert Subjektivität und Benutzerermüdung und ermöglicht eine zuverlässige, quantitative Bewertung der Mikrozirkulation, die für die Krankheitsmodellierung und Zielstrukturvalidierung von Bedeutung ist. Ihre Reproduzierbarkeit und Effizienz unterstützt fundierte Entscheidungen an entscheidenden Wendepunkten in der Forschung zu kardiovaskulären und Stoffwechselerkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die objektive Quantifizierung mikrovaskulärer Veränderungen zur Hypothesenprüfung in Krankheitsmodellen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem standardisierte Messgrößen der Mikrozirkulation bereitgestellt werden.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem die vom Bediener ausgehende Verzerrung bei der Beurteilung der Kapillardichte verringert wird.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die frühe Portfolioauswahl in der vaskulären und metabolischen Forschung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte, reproduzierbare bildbasierte Assays für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor.
- Standardisiert die Messung der Kapillardichte und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit des Assays.
- Liefert quantitative Ergebnisse, die für den Vergleich zwischen Studien und Standorten geeignet sind.
- Ermöglicht eine schnelle, halbautomatisierte Analyse zur Unterstützung der Bereitschaft für Hochdurchsatz-Screening.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft die Quantifizierung mikrovaskulärer Parameter mit krankheitsrelevanten Endpunkten zur Entwicklung translationaler Biomarker.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem konsistente Messprotokolle ermöglicht werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Basis robuster Mikrozirkulationsdaten.
- Verringert die translatorische Mehrdeutigkeit, indem quantitative Kapillarmetriken mit Krankheitsphänotypen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese computerisierte Kapillaroskopiemethode ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert und unterstützt sowohl die frühe Hypothesenprüfung als auch die translationale Abstimmung von Biomarkern.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht reproduzierbare Hypothesenprüfungen und die Klärung von Signalwegen in der Mikrogefäßforschung.
- Screening: Bietet standardisierte, quantitative Angaben zur Kapillardichte für die Entwicklung von Assays und die Bewertung von Substanzen.
- Analytik: Ermöglicht objektive, statistische Vergleiche mikrovaskulärer Veränderungen über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern und die Kontinuität von in-vitro- zu in-vivo-Modellen, wenn die Mikrozirkulation ein relevanter Endpunkt ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen skalierbaren, halbautomatisierten Workflow, der auf verschiedene Krankheitsmodelle und Forschungsteams übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in mikrovaskulären Studien.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und schnelle Quantifizierung mit minimalem Schulungsaufwand.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste, quantitative Endpunkte bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen zu vaskulären und Stoffwechselerkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Fachkenntnisse in der digitalen Bildgebung und der Interpretation von Kapillaroskopiebildern.
- Benötigt Zugang zu monochromen digitalen Kameras und kompatibler Software zur Bildanalyse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Bildaufnahme und der Platzierung der interessierenden Regionen (ROI) über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Kann auf verschiedene Krankheitsmodelle angewendet werden, bei denen die Mikrozirkulation ein relevanter Endpunkt darstellt.
- Die manuelle Auswahl der interessierenden Regionen (ROI) bleibt eine potenzielle Variabilitätsquelle und erfordert sorgfältige Einhaltung des Protokolls.
