Name: Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Erfahren Sie die systembiologische Analyse der Stoffwechselregulation durch ER Alpha bei Brustkrebs mittels Multi-Omics-Datenintegration. Diese Methode ermöglicht globale Einblicke in genetische und metabolische Regulationsmechanismen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Nationalen Institut für Ernährung und Landwirtschaft, US Department of Agriculture, preis ILLU-698-909 (ZME) und Pfizer, Inc (ZME) unterstützt. Sein Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht zwangsläufig die offizielle Einstellung der US-Landwirtschaftsministerium vertreten.

1. Herstellung von RNA-Proben Seq <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Kultur die MCF7 - Zellen in einer verbesserten MEM (IMEM) und Phenol-rot - Medium mit 10% Hitze inaktiv FBS, 1% Penicillin / Streptomycin bei 37 ° C in befeuchteten 5% CO 2 -Atmosphäre. Hinweis: Der gleiche Zelllinie und Zellkulturbedingung wird während der gesamten Studie verwendet. </li><li> Seed 100.000 MCF7-Zellen pro Well in 6-Well-Platten. Haben Sie für jede Behandlung Triplikaten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 2 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platten für 24 h in 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre. </li><li> Um die Zellen zu ernten, 1 ml RNA-Isolierung Reagenz (Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform) in jede Vertiefung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Dann sammeln Sie die Zelle Lysatreagens durch Pipettieren und Ablagerung in 1,5-ml-Röhrchen </li></ol></li><li> RNA-Isolierung <ol><li> In 200 ul chloroform in 1 ml Zelllysat Reagenz (1.1.3) und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation übertragen die wßrige Phase (oben) in ein neues Röhrchen, ohne die anderen Phasen zu stören. </li><li> Hinzufügen, 500 &amp; mgr; l 100% Isopropanol in ein neues Röhrchen mit der übertragenen wässrigen Phase und durch Invertieren mischen. Inkubieren bei -20 ° C über Nacht. Zentrifugiere die Proben bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Beobachten ein Pellet am Boden des Röhrchens. Überstand verwerfen und waschen Sie das Pellet mit 750 &amp; mgr; l RNase-freiem 70% Ethanol durch kurze Wirbel. </li><li> Zentrifuge Proben bei 6.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Zentrifugieren der Probe bei 16.000 × g für 1 min bei 4 ° C die gesamte verbleibende Ethanol zu sammeln. Entfernen Sie die verbleibende Ethanol mit einer Pipette mit einem Gel-Ladespitze und legen Sie die Rohre nach oben Seite nach unten an der Luft trocknen für 10 min. Man löst das Pellet in 20-50 ul DEPC behandeltem Wasser DEPENding von der Größe der Pellets. </li></ol></li><li> Reinige die RNA unter Verwendung von RNA clean-up - Kit nach dem Protokoll 4. Messen Sie die RNA - Konzentration einen Fluorometrie basierten Assay - Kit nach dem Protokoll 9. HINWEIS: OD bei 260 nm wird getroffen, um die RNA-Konzentration und das Verhältnis von OD bei 260 nm und 280 nm werden verwendet, um zu bestimmen, um die Reinheit der Probe zu bestimmen. Es wird empfohlen, die RNA-Qualitätsprüfung Bio-Analysator Assay. </li><li> Nehmen Sie etwa 0,5 bis 1 ug gereinigte RNA für die Sequenzierung. HINWEIS: Biotech - Center bereitet die Sequenzierungsbibliotheken und führt Paired-End - Sequenzierung lesen Methoden bisher 2 detailliert mit. </li></ol> 2. Herstellung von ChIP-Seq Probe <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Seed 500.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium. HINWEIS: Bei allen Pull-Down-16 Platten verwendet wurden. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu jeTeller. Behandlung der Zellen für 45 min (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre). </li></ol></li><li> Cross und Zellernte <ol><li> In 250 ul 37% Formaldehyd in 5 ml Medium Chromatin zu vernetzen, Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Vernetzung von Zellen mit 5 ml eiskaltem 1x MEM Waschen. </li><li> Ernte der Zellen in 250 ul Zelllyse-Puffer (10 mM EDTA, 50 mM Tri-HCl, 1% SDS, 0,5% N, N-dimethyldodecan-1-Aminoxid) pro Platte. </li></ol></li><li> Fragmentation von Chromatin <ol><li> Beschallen die Zellen für 30 sec x 8 bei amp von 30 bis erforderlichen Chromatin Größen erreichen. Kühlen Sie jede Probe auf Eis nach einer Beschallung von 30 sec. </li><li> Zentrifuge bei 16 000 xg für 10 min bei 4 ° C, und den Überstand vorsichtig pipettieren, ohne an der Unterseite des Pellets zu stören. </li><li> Nehmen Sie ein 5 - ul - Aliquot des Überstandes, und überprüfen Sie die DNA - Größe durch Elektrophorese durch 1,5% Agarose - Gel , wie zuvor 10 beschrieben. Die ideale Größevon DNA sollte zwischen 200-500 bp sein. </li></ol></li><li> Chromatin Immunopräzipitation <ol><li> Sparen Sie 25 ul Zelllysat als Eingabe. In einem 50-ml-Röhrchen, mischen 4 ml Zelllysat mit 20 ml IP-Puffer (2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl und 0,5% Triton X), ERa-Antikörper (500 &amp; mgr; l F10 und 500 &amp; mgr; l HC- 20), und 500 &amp; mgr; l ProtA und protg Proteinbeschichtung magnetischen Kügelchen. Inkubieren der Mischung durch Rotation bei 4 ° C über Nacht, die Bildung von Chromatin- Antikörper-Komplexes zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Wäscht und Reverse-Vernetzung <ol><li> Verwenden Sie einen magnetischen stehen die magnetischen Kügelchen auf der magnetisierten Seite zu sammeln, um die Waschpuffer zu entfernen. </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer I (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 150 mM NaCl). Um gründlich die magnetischen Kügelchen waschen, ohne DNA-Protein-Komplexe zu stören, werden 25 ml Waschpuffer langsam auf das Rohr an der Seite dann die Rohre umkehren, bis alle magnetischen Kügelchen gemischt gut wi sindth die Waschpuffer ohne als Pellet erscheinen. Als Alternative verwenden Sie den Rotator das Rohr zu invertieren. Sie nicht die Proben verwirbeln. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen die gleiche Methode in den folgenden Schritten. </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer II (2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl, 01% SDS, 1% Triton X, und 500 mM NaCl). </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml Waschpuffer III (1,6 mM EDTA, 10 mM Tris HCl, 1% NP-40, 1% Dexycholate und 250 mM LiCl). </li><li> Waschen der magnetischen Kügelchen in 25 ml 1x TE-Puffer (1 mM EDTA und 10 mM Tris HCl) zweimal. </li><li> Eluieren der DNA in 500 &amp; mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 10 mM NaHCO 3) und dann zuzuteilen , die 500 &amp; mgr; l DNA - Elution in 4 Röhrchen. Für die DNA von den Eingängen, DNA in 125 &amp; mgr; l Elutionspuffer eluiert. </li><li> Die Röhrchen bei 65 ° C über Nacht auf einem Heizblock. Decken Sie die Rohre auf dem Heizblock mit Aluminiumfolie die Wärme auch über alle Rohre zu halten. Legen Sie ein Gewicht auf den Rohren, damit sie nicht zu öffnen. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> DNA-Isolierung <ol><li> Kühlen Sie die Röhrchen bei RT für 5 min. Isolieren von DNA aus den Pull-Down-Proben unter Verwendung von ChIP DNA-Extraktions-Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. Hinzufügen, 625 &amp; mgr; l zu jedem Röhrchen Bindungspuffer. Wenn der Niederschlag bildet, fügen Sie eine weitere 250 &amp; mgr; l Bindungspuffer, bis die Lösung klar ist. </li><li> Legen Sie die Probe auf die Säule und Zentrifuge bei 16.000 × g für 30 Sekunden. Waschen Sie die Probe mit 250 ul Waschpuffer. Denken Sie daran, Ethanol zu dem Waschpuffer hinzuzufügen, wenn es erstmals zu verwenden. Wiederholen Sie die Wäsche. </li><li> Eluieren der DNA in 15 &amp; mgr; l Elutionspuffer. Kombinieren Sie die DNA von derselben nach unten ziehen von 4 Röhrchen etwa 55 &amp; mgr; l DNA zu erreichen. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die Input-DNA eine DNA Purification Kit. <ol><li> Erwärmen Sie den Elutionspuffer bei 65 ° C. In 625 &amp; mgr; l Bindungspuffer in jedes Röhrchen und Inkubation für 10 min. Legen Sie die Probe auf die Säule in einem 2 ml collectiauf dem Rohr. </li><li> Waschen Sie die Probe mit 750 &amp; mgr; l Waschpuffer, Zentrifuge bei 16.000 xg für 1 min. Wiederholen Zentrifugieren alle verbleibenden Puffer zu entfernen. Eluieren der DNA in 30 ul EB. </li></ol></li><li> Messen Sie die DNA - Konzentration unter Verwendung eines kommerziellen Fluorochrom Assay mit Modification 11. <ol><li> Verdünnen Sie den 20x TE-Puffer in 1x TE als Assay-Puffer zur Verdünnung der Reagenzien und DNA-Proben. Nehmen Sie 5 ul isolierte DNA und verdünnen Sie es in 50 &amp; mgr; l in 1x TE. </li><li> Von 2 ug / ml DNA-Stammlösung mit einer DNA-Standard von leer auf 1, 10, 100, 1000 &amp; mgr; g / ml bis hin zu machen. In einer 96-Well-Platte, weisen 25 ul jeder Standard sowie DNA-Verdünnung in zweifacher Ausfertigung. (Dreifacher Ausführung für Standard empfohlen.) </li><li> Bereiten Sie die Arbeits Reagenz durch eine 200-fache Verdünnung von dsDNA Reagenz in 1x TE-Puffer in Kunststoffrohr zu machen. Decken Sie die Arbeits Reagenzlösung mit Aluminiumfolie zu Licht zu vermeiden. In 200 ul Arbeits Reagenz in jeder Probe. Imcubate für 5 min bei Raumtemperatur. Die Platte mit Aluminiumfolie Licht vermeiden. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenz der Proben eines Fluoreszenzplattenleser (Anregung bei 480 nm, Emission 520 nm) verwendet wird. Generieren Sie die DNA-Standardkurve der Fluoreszenz im Vergleich zu DNA-Konzentration. Bestimmung der Konzentrationen der Proben auf der erzeugten DNA-Standardkurve berechnet. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfung von ChIP Experiment Mit qPCR <ol><li> Nehmen Sie 2 ul isolierte DNA und in 20 &amp; mgr; l in Wasser verdünnt. Stellen Sie die qPCR Reaktion in dreifacher Ausfertigung bis 2,5 &amp; mgr; l DNA-Verdünnung Mischen, 5 ul Green I PCR Master-Mix, 1 ul Primer und 1,5 ul Nuclease freies Wasser. </li><li> Führen Sie die qPCR mit dem Fast Real-Time-PCR-System mit dem folgenden Programm: Schritt 1: 95 ° C für 60 sec, Schritt 2: 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 60 Sekunden, wiederholen Sie Schritt 2 39 mal. </li></ol></li><li> Senden 10 ng DNA-Probe zu Biotech Zentrum für die Sequenzierung. HINWEIS: Die Biotech Zentrum bereitet die ChIP DNA in Bibliotheken nach Anweisung und führt Einzel lesen Sequenzierungsverfahren detailliert zuvor 2. </li></ol> 3. Metabolomics Assay Probenvorbereitung <ol><li> Zellkultur und Behandlung <ol><li> Seed 400.000 MCF7 Zellen pro 10 cm Platte in einem Wachstumsmedium. Für jede Behandlung vorbereiten drei Proben. Verwenden zwei Platten in jeder Probe genug Zellen zum Nachweis zu erhalten. Am Tag 3 , das Medium zu entfernen und 5 ml frisches Medium hinzu , mit oder ohne 10 -8 M E2 zu den Zellen. Behandlung der Zellen für 24 h (37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 -Atmosphäre). </li></ol></li><li> Beispielsammlung <ol><li> 5 ml eiskaltem 1x PBS an die Platte absaugen PBS nachdem die Platte mehrmals kurz zu kippen. Wiederholen Sie zweimal, und entfernen Sie so viel PBS wie möglich nach der letzten Wäsche. </li><li> In 750 ul vorge kaltem Aceton zu jeder Platte und die Zellen kratzen. Kombinieren der Zellen in Aceton aus zwei Platten inin ein 2-ml-Röhrchen auf Eis. </li><li> Zellzahl für die Normalisierung <ol><li> Für jede Behandlung, verwenden Sie zwei zusätzliche Platten für die Zell Quantifizierung. DE-befestigen Sie die Zellen von der Platte, 2 ml HE - Puffer (1x HBSS, 10 mM HEPES, 0,075% NaHCO 3 und 1 mM EDTA) in jeder Platte und Inkubation für 5 min. </li><li> Sammeln und gut mischen die Zellen durch Zellen in der HE-Puffer pipettiert. Verwenden Sie insgesamt 20 ul Zell-Lösung die Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer zu zählen. </li></ol></li></ol></li><li> Lagern Sie die Proben bei -80 ° C vor zum Metabolomics Zentrum schicken zu identifizieren und zu quantifizieren, die Metaboliten Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse. </li></ol> 4. Integrative Analyse <ol><li> RNA-Seq Datenanalyse: <ol><li> Führen Sie Qualitätsprüfung von fastq Dateien mit FastQC: Lesen QC (http://galaxy.illinois.edu) <ol><li> Wählen Sie FastQC: Lesen unter dem Werkzeug von NGS: QC und Manipulation. Laden Sie die Rohdatendatei von der aktuellen history. HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Titel zu geben, für die Ausgabedatei Sie daran zu erinnern, was der Job für war, da es möglicherweise mehrere Ausgänge sein. </li></ol></li><li> Ausführen und die Ausgabedatei unter der Geschichte erscheinen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Sequenz-Datei. Trim-Adapter mit Clip unter NGS: FastX Toolkit. </li><li> Richten Sie liest hg19 Tophat2 Verwendung mit RefSeq Genom Referenz Anmerkung 12 (Standardwerte). <ol><li> Wählen Sie Tophat2 unter Werkzeug von NGS: RNA-Analyse. Geben Sie die Bibliothek gepaart Typ (Single-End vs Paired-End). </li><li> Laden Sie die Eingabe fastq Datei aus der aktuellen Geschichte. Wählen Sie das Referenzgenom. Wählen Sie Standardeinstellungen. Oder Sie verwenden die Vollparameterliste zu ändern. </li><li> Führen und es wird zwei Ausgabedateien erzeugen: Die eine ist UCSC Planum von Kreuzungen; eine andere ist eine Liste von Leseausrichtungen in BAM-Format. </li></ol></li><li> Laden Sie BAM-Dateien Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool. Berechnen Expressionswerte mit Quantifizierung Werkzeug. </li><li> Identifizieren unterschiedlich up-regulierte Gene mithilfe von Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung&gt; 2 und p-Wert &lt;0,05. Ebenso identifizieren differentiell nach unten reguliert Gene Expression Analysis Tool mit Standardwerten und mehrfache Änderung &lt;0,5 und p-Wert &lt;0,05. </li></ol></li><li> ChIP-Seq Datenanalyse: <ol><li> Richten Sie fastq Liest zu hg19 mit Bowtie2 13 (Standardwerte) in der Galaxie. <ol><li> Wählen Sie Bowtie2 unter dem Werkzeug von NSC: Mapping. Überprüfen Sie, ob die Bibliothek Mate-paarigen (Single-End vs Paired-End). Laden Sie die fastq Datei aus der aktuellen Geschichte. </li><li> Wählen Sie das Referenzgenom. Verwenden Sie die Standard-Parametereinstellungen. Ausführen und es wird die Ausgabedatei erzeugen mit zugeordneten Sequenz als BAM-Datei liest. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Folge-Datei. </li></ol></li><li> Identifizieren Peaks unter Verwendung von MACS 14 ein p-Wert Cutoff von 6.0e-7 und FDR von 0,01, wie zuvor 2 beschrieben. </li></ol&gt; </li><li> Metabolomics Datenanalyse: <ol><li> Konvertieren chemischen Namen von Metaboliten KEGG_IDs. </li><li> Identifizieren unterschiedlich reguliert Metaboliten von Ebenen erfasst Fahrzeug Vergleich vs. E2 behandelten Proben (eine 2 - fach cut-off in dieser Studie verwendet wurde). </li></ol></li><li> Integrative Analyse: <ol><li> Identifizieren Gene, die ERa-Bindungsstellen mit Sequenzierungsdaten-Analyse-Tool haben. Übersetzen Regions Gene Funktion unter Verwendung von 20 kb als Abstands cut-off. </li><li> Identifizieren differentiell Up- und Down-regulierte Gene von RNA-Seq - Daten - Analyse unter Verwendung fache Änderung&gt; 2 und mehrfache Änderung &lt;0,5, jeweils mit dem p-Wert &lt;0,05 als abgeschnitten. Vergleichen Sie die Liste der ERa-Bindungsstelle enthält Gene mit Venn-Diagramm Vergleich. </li><li> Mit Metscape 15 Modul von Cytoscape Verwenden Sie diese Liste E2 moduliert Stoffwechselwege zu identifizieren. <ol><li> Metscape Modul von Anwendungen Durch die Auswahl, wählen Sie Netzwerk aufbauen und dann bas-Weged Option. </li><li> Wählen Sie den Organismus (Mensch). Wählen Sie Datendatei von E2 ungeregelte Verbindung Liste (KEGG ID) und E2 hochreguliert Gen-Liste. </li><li> Wählen Sie -Reaktion -Enzym-Gene als Netzwerk-Typ-Verbindung. Wählen Sie Verbindung / Gene wie die Abfrage. </li><li> Bauen Netzwerk. Wiederholen Sie die E2 herunterreguliert Verbindung und Gene verwendet. </li></ol></li></ol></li></ol>

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University of Illinois erhielt einen Investigator Initiated Zuschuss von Pfizer Inc. ZME und YCZ erhielt Gehalts Unterstützung von diesen Zuschuss.

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, Erzeugungs- und integrative Analyse von RNA-Seq, ChIP-Seq und metabolomics Daten von MCF-7-Zellen, die mit E2 behandelt werden. Wir entwickelten eine Reihe von Protokollen, die effizientesten Methoden und benutzerfreundlichen Soft-Ware zu verwenden strategizing, die biologisch relevante Entdeckung produzieren. Um unser Wissen, unsere ist die erste Studie -omics Daten aus drei verschiedenen Analysen und identifiziert neue Stoffwechselwege, die ERa direkt geregelt in Brustkrebszelle...

Östrogene sind wichtige Regulatoren von vielen physiologischen Prozessen in beiden Frauen und Männern einschließlich der reproduktiven Gewebe, metabolischen Gewebe, Gehirn und Knochen 1. Neben positiven Auswirkungen in diesen Geweben, treiben Östrogene auch Krebserkrankungen, die aus Brust und reproduktive Gewebe entstehen. Östrogene vor allem durch ERs arbeiten zelltypspezifische Effekte zu induzieren. Tief Sequenzierung von Transkripten von ERa geregelt unter Verwendung von RNA-Seq und genomweite ERa DNA-Bindungsstellen-Analyse ChIP-Seq Verwendung erwies sich als nützlich, um zu verstehen, wie ERa in verschiedenen Geweben und Krebsarten arbeitet, die aus ihnen entstehen. Wir und andere haben Profile veröffentlicht Genexpression assoziiert mit verschiedenen Rezeptoren (ER &amp; agr; vs ER &amp; bgr;) 2,3, verschiedene Liganden 3-5 und verschiedene Koregulatoren 2,4,6,7. RNA-Seq ist die wichtigste Methode, um die Transkriptom zu untersuchen, bietet eine höhere Präzision und Effizienz im Vergleich zu Microarray-based Genexpressionsanalyse 8. RNA , die aus Zelllinien 2-4,7, Geweben oder Tumorproben werden sequenziert, abgebildet erhältlich genomischen Baugruppen und unterschiedlich regulierte Gene identifiziert werden. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) verwendet, um den Transkriptionsfaktor und coregulator Chromatin Bindung an bekannten regulatorischen Bindungsstellen zu sezieren. ChIP-Seq (ChIP durch hohe Durchsatzsequenzierung gefolgt) bietet unvoreingenommene Erfassung des globalen Bindungsstellen. Metabolomics ist ein weiterer zunehmend verbreitetes System biologischen Ansatz, der quantitativ Maßnahmen, dynamische multiparametrischer Reaktion lebender Systeme auf verschiedene Reize einschließlich Chemikalien und genetischen Störungen. Durch globale metabolischen Profils durchgeführt wird, kann eine funktionelle Auslesen aus Zellen, Geweben und Blut erhalten werden. Darüber hinaus werden Informationen von Transkriptom Experimente spiegeln nicht immer tatsächlichen Veränderungen in der Höhe von Enzymen, die auf biochemischen Wege beitragen. KombinierteAnalyse von Daten Transkriptom und Metabolom ermöglicht es uns, mit den tatsächlichen Metaboliten Veränderungen Veränderungen in der Genexpression zu identifizieren und zu korrelieren. Die Nutzung der Informationen aus all diesen großen Maßstab Datensätze die mechanistischen Details liefern die Rolle von Transkriptionsfaktoren regulieren komplexer biologischer Systeme, vor allem diejenigen, die beziehen sich auf die menschliche Entwicklung und Krankheiten wie Krebs und Diabetes zu verstehen. Die komplexe Natur des Säugetiergenoms macht es schwierig, zu integrieren und zu interpretieren, in vollem Umfang die von den Transkriptom erhaltenen Daten, cistrome und Metabolom Experimente. Identifizieren funktionelle Bindungsereignisse, die, weil, sobald Bindungsstellen funktionell sind identifiziert Veränderungen in der Expression von Zielgenen ist wichtig, führen würde; anschließenden Analyse, einschließlich Transkriptionsbindungs ​​(TF) Motivanalyse, konnte mit einer höheren Genauigkeit durchgeführt werden. Dies führt zur Identifizierung von biologisch sinnvoll TF Kaskaden und Mechanismen. Auch direkte comparisauf der RNA-Seq und ChIP-Seq Versuche sind nicht immer möglich, da die Daten von jedem Experiment unterschiedlichen Skalen und Geräusche haben, und in einigen Fällen sinnvolle Signale werden von Bevölkerungs Rauschen verdeckt. Wir sind keine Kenntnis von einer Studie, die Informationen aus diesen drei unabhängigen, aber miteinander verbundene Ansätze integriert, um die direkte Stoffwechselregulation durch ERa bei Brustkrebs zu verstehen. Deshalb ist unser übergeordnetes Ziel in dieser Arbeit ist produktive Bindungsereignisse zu Genexpression und Metaboliten Veränderungen zu beziehen. Um dieses Ziel zu erreichen, integriert wir Daten von RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und identifiziert jene Östrogen ERa Bindungsereignisse induziert, die zu Veränderungen der Genexpression in Stoffwechselwege führen würde. Zum ersten Mal bieten wir einen kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1) zur Erzeugung von ChIP-Seq, RNA-Seq und Metabolomik Profilierung und Durchführung integrative Analyse der Daten neue Gen - Schaltungen aufzudecken Stoffwechsel der Brust RegulierungKrebszelllinien.

<table><tbody><tr><td>Triglycerid-Mix</td><td>Sigma</td><td>17810-1AMP-S</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O1257-10MG</td><td>Ölsäure-wasserlösliches Pulver&nbsp;</td></tr><tr><td>TRIzol Technologien für die Lebensdauer von Reagenzien</td><td>&nbsp;</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Lebenstechnologien&nbsp;</td><td>10006D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Lebenstechnologien&nbsp;</td><td>10007D</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td>DNA-Isolierung der Eingangsprobe</td></tr><tr><td>ZYMO ChIP-DNA-Isolationskit&nbsp;</td><td>Zymo Forschung&nbsp;</td><td>D5205</td><td>ChIP DNA Reinigen & Konzentrator</td></tr><tr><td>Quant-iT&ordf; PicoGreen&uml; dsDNA-Assay-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Set</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>RNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>DEPC-behandeltes Wasser</td><td>LIFE TECH</td> 462224 <td>Dnase/RNASE-freies</td><td></td></tr><tr><td>Modell 120 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB120110</td><td>Mit 1/8 Sonde&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Fisher Scientific Schallgehäuse</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB-432-A</td><td>Zur Schalldämmung</td></tr><tr><td> Eppendorf Tuben 5,0 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 119.401</td><td>200 Tuben (2 Beutel à 100 Stück)</td></tr><tr><td>Zufällige Grundierungsmischung&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>DNTP MIX</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transkriptase</td><td>NEB</td><td>M0253S</td><td></td></tr><tr><td>FastStart SYBR Green Master</td><td>ROCHE</td><td>4673484001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP160100</td><td>1,5 % Agarosegel;</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Technologien für die Lebensdauer&nbsp;</td><td>Q32852</td><td>RNA-Quantifizierung (100 Assays)&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4693116001</td><td>Jede Tablette reicht für 10 ml Lysepuffer</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatasehemmer Cocktail Tabletten</td><td>Roche&nbsp;</td><td>4906845001</td><td>Jede Tablette reicht für 10 ml Lysepuffer</td></tr><tr><td>Qubit Assay Kits</td><td>Lebenstechnologien&nbsp;</td><td>Q32850</td><td>Für 100 Assays</td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>ORFLO</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen-Rotator&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5 Multilple Plattenlesegerät&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td></td></tr><tr><td>Magnetstativ</td><td>Diagenode</td><td>B04000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schnelles Real-Time-PCR-System</td><td>Angewandte Wissenschaft&nbsp;</td><td></td><td></td>4351405</tr></tbody></table>

systembiologie der stoffwechselregulation von estrogen receptor signaling bei brustkrebs

Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer

Mit dem Aufkommen der -omics nähert sich unser Verständnis der chronischen Krankheiten wie Krebs und metabolische Syndrom hat sich verbessert. Allerdings effektive Abbau von den Informationen in den großen Datenmengen, die von Genexpression Microarrays, deep sequencing Experimente oder metabolischen Profils erhalten werden ist wichtig, zu entdecken und dann effektiv die kritischen Regulatoren der erkrankten Zelle Phänotypen Ziel. Estrogen Receptor α (ERa) ist einer der Master-Transkriptionsfaktoren, die Gen-Programme regulieren, die für Östrogen-responsiven Brustkrebs wichtig sind. Um Rolle von ERa Signalisierung bei Brustkrebs Stoffwechsel zu verstehen, verwendeten wir transkriptomischen, cistromic und Metabolom-Daten aus MCF-7 mit Östradiol behandelten Zellen. In diesem Bericht beschrieben wir Generation von Proben für die RNA-Seq, ChIP-Seq und Metabolomik Experimente und die integrative Computeranalyse der erhaltenen Daten. Dieser Ansatz ist nützlich bei der Abgrenzung Roman Maulwurfdere Mechanismen und genregulatorischen Schaltungen, die durch einen bestimmten Transkriptionsfaktor, der Auswirkungen auf den Stoffwechsel von normalen oder erkrankten Zellen reguliert werden.

Transcriptomics Zur Analyse differentiell exprimierten Gene durch E2-Behandlung, wählten wir einen RNA-Seq-Experiment durchzuführen. Darüber hinaus Ebenen Informationen über mRNA zur Bereitstellung, RNA-Seq-Daten können auch in nicht-kodierende RNA (lange nicht-kodierenden RNAs, microRNAs) und alternative Spleißen Ereignisse zu überwachen Änderungen verwendet werden. Wir haben keine Informationen über die Analyse von nicht-kodierenden RNAs oder alternativ Gene transkribiert, da Ra...

Die Integration von Daten aus genomweiten Sequenzierungsexperimenten und Metabolomik-Experimenten ist eine Herausforderung. In dieser Arbeit berichten wir zum ersten Mal über die Generierung, Analyse und Integration von Transkriptom-, Cistrom- und Metabolomdaten von Brustkrebszellen, die mit Östradiol behandelt wurden.

Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

With the advent of the -omics approaches our understanding of the chronic diseases like cancer and metabolic syndrome has improved. However, effective ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die direkte metabolische Regulation des ER-Alpha bei Brustkrebs anhand genomweiter Transkriptom-, Systrom- und Metabolomdaten zu verstehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Nukleorezeptor- und Krebsbiologie zu beantworten, beispielsweise welche Rolle bestimmte Transkriptionsfaktoren bei der Regulation des Stoffwechsels zur Förderung der Zellaggressivität spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein umfassendes Bild der feinen Regulation von Genen und dem daraus resultierenden Stoffwechsel bietet.Die Durchführung des Verfahrens wird Yiru Chen, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, zeigen. Nachdem die MCF7-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, die Zellen durch Zugabe von einem Milliliter RNA-Isolationsreagenz pro Mulde geerntet und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Mit einer Pipette das Zelllysat sammeln und in 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.Um die RNA zu isolieren, geben Sie 200 Mikroliter Chloroform zu einem Milliliter Zelllysat hinzu und wirbeln Sie 10 Sekunden lang im Vortex. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 × g und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Nach der Zentrifugation überführen Sie vorsichtig die wässrige obere Phase in ein neues Gefäß.Fügen Sie 500 µL 100 % Isopropanol zur wässrigen Phase hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen. Inkubieren Sie dann über Nacht bei minus 20 °C. Am folgenden Morgen zentrifugieren Sie die Proben bei 1600 × g und 4 °C für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 750 µL RNase-freies 70%iges Ethanol hinzu. Vortexen Sie kurz. Zentrifugieren Sie die Proben bei 6.000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie anschließend den Überstand und zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 × g und vier Grad Celsius für eine Minute.Entfernen Sie mit einer Gel-Ladepipettenspitze den restlichen Ethanol durch Pipettieren. Stellen Sie die Röhrchen anschließend zum Trocknen für 10 Minuten kopfüber. Geben Sie dann 20 bis 50 Mikroliter DEPC-Wasser zu, um das Pellet aufzulösen, und reinigen und quantifizieren Sie die RNA gemäß dem Textprotokoll.Nachdem MCF7-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, geben Sie 250 Mikroliter 16 % Formaldehyd in fünf Milliliter Medium zu den Zellen, um die Chromatin-Quervernetzung durchzuführen, und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Zellen mit fünf Milliliter eiskaltem 1X-Puffer, um die Quervernetzungsreaktion zu stoppen. Gewinnen Sie die Zellen in 250 Mikrolitern Zelllysepuffer pro Platte.Danach die Chromatin-Fragmentierung auf die gewünschten Größen durchführen, indem die Zellen achtmal für jeweils 30 Sekunden bei einer Amplitude von 30 beschallt werden. Nach jeder 30-sekündigen Beschallung die Proben auf Eis abkühlen. Anschließend, nach einer Zentrifugation der Proben bei 16.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten, vorsichtig den Überstand abpipettieren, ohne das Pellet am Boden zu stören.Geben Sie eine fünf Mikroliter umfassende Aliquot der Überstand auf ein 1 % Agarosegel und führen Sie die Elektrophorese durch, um die DNA-Größe zu bestimmen. Die ideale Fragmentlänge sollte zwischen 200 und 500 Basenpaaren liegen. Um die Immunpräzipitation des Chromatins durchzuführen, bewahren Sie 25 Mikroliter des Zelllysats als Input auf.Dann in einem 50-Milliliter-Röhrchen 4 Milliliter des Zelllysats mit 20 Milliliter IP-Puffer, ER-Alpha-Antikörper sowie protein A- und protein G-kodierten magnetischen Perlen mischen. Die Mischung unter Rotation bei 4 °C über Nacht inkubieren, um die Bildung von Chromatin-Antikörper-Komplexen zu ermöglichen. Nach dem Waschen der Perlen mit den entsprechenden Waschpuffern gemäß dem Textprotokoll 500 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen hinzufügen und die DNA in vier Röhrchen eluieren.Für die DNA-Eingabeproben in 125 Mikroliter Elutionspuffer eluieren. Anschließend die Röhrchen in ein Heizblock stellen, mit Aluminiumfolie abdecken und ein Gewicht darauflegen, um ein Öffnen zu verhindern. Die Röhrchen über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren.Um die DNA aus den Pulldown-Proben mithilfe eines ChIP-DNA-Isolationskits zu isolieren, kühlen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ab. In der Zwischenzeit erwärmen Sie den Elutionspuffer auf 65 Grad Celsius. Geben Sie 625 Mikroliter Bindungspuffer zu jedem Röhrchen hinzu.Falls ein Präzipitat entsteht, weitere 250 Mikroliter Bindungspuffer hinzufügen, bis die Lösung klar ist. Die Probe auf die Säule auftragen und 30 Sekunden bei 16.000 × g zentrifugieren. Anschließend die Säule zweimal mit jeweils 250 Mikrolitern Waschpuffer waschen.Eluieren Sie die DNA mit 15 Mikrolitern Elutionspuffer. Kombinieren Sie die DNA aus den vier Röhrchen desselben Pulldowns, um 55 Mikroliter DNA zu erhalten. Messen Sie die DNA-Konzentration und führen Sie eine QPCR gemäß dem Textprotokoll durch.Unter Verwendung von MCF7-Zellen, die gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, geben Sie fünf Milliliter kalte 1X PBS auf die Platte. Schwenken Sie die Platte anschließend mehrmals, bevor Sie die PBS entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal und entfernen Sie nach dem letzten Waschschritt so viel PBS wie möglich.Geben Sie 750 Mikroliter vorab gekühltes Aceton zu jeder Platte hinzu und schaben Sie die Zellen ab. Kombinieren Sie anschließend die Zellen aus zwei Platten in einem zwei Milliliter fassenden Reaktionsgefäß auf Eis. Um die Zellen zur Normalisierung zu zählen, verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten zur Zellquantifizierung.Als Nächstes, um die Zellen von den Platten zu lösen, zwei Milliliter HE-Puffer hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Die Zellen gründlich durch Pipettieren im HE-Puffer mischen. Anschließend 20 Mikroliter der Zellsuspension in einem Hämozytometer verwenden, um die Zellzahl unter dem Mikroskop zu bestimmen.Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie eine Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse durchführen, um die Metaboliten zu identifizieren und zu quantifizieren. Führen Sie die integrative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt die Integrität und die Gesamtqualität der für ein RNA-Seq-Experiment gereinigten RNA-Proben.Die Analyse zeigt, dass alle Proben scharfe und saubere Banden der 18S- und 28S-rRNAs aufweisen, was auf die Integrität und Reinheit der Proben hinweist. Eine RNA-Integritätszahl (RIN) von 10 weist auf intakte RNA hin. Eine Sechs steht für teilweise degradierte RNA, und eine Drei weist auf eine stark degradierte Probe hin.In diesen Experimenten erhielten alle RNA-Proben RIN-Werte zwischen 9,6 und 9,9. Die Durchführung einer ultraschnellen Hochdurchsatzsequenzierung führte zu etwa 18 Millionen qualitativ hochwertigen Sequenzierungsreads pro Probe. Ein repräsentativer Fast-QC-Bericht, der die Gesamtqualität der Rohdaten analysiert, ist hier dargestellt.Für jeden Read lag der Qualitätswert bei den ersten fünf Basenpaaren zwischen 32 und 34 und zwischen 36 und 38 von der sechsten bis zur 100. Base. Unter den 17.990.863 Reads, die aus dieser Probe generiert wurden, wiesen die meisten einen Qualitätswert über 34 auf. Diese Abbildung zeigt einen Überblick über etwa 100 Metaboliten, die durch Peaks dargestellt werden und Veränderungen in MCF7-Zellen nach Behandlung mit Estradiol anzeigen.Die 10 wichtigsten Metaboliten mit signifikanten Veränderungen nach E2-Behandlung sind in dieser Tabelle dargestellt. Diese Tabelle listet die Signalwege auf, die nach E2-Behandlung hoch- und herunterreguliert wurden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die Zellgesundheit und die Qualität der analysierten Proben zu achten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Exomsequenzierung oder GRO-Seq, die auf Sequenzierungsdaten basieren, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der Identität weiterer mRNAs, Enhancer-mRNAs oder langer nicht-kodierender RNAs, deren Transkription durch Behandlungen induziert wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der nuklearen Rezeptoren den Weg, um die metabolische Regulation durch nukleare Rezeptoren in Zellkultursystemen oder in Mäusen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Daten aus mehreren Omics-Ansätzen analysiert und integriert werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Trizol, Formaldehyd und Methanol äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung, beispielsweise Handschuhen und Laborkitteln, sollten stets während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Vorbereitung von Brustkrebszellproben für die Erstellung von Metabolitenprofilen. Brustkrebszellen werden mit Östradiol behandelt, das an den Östrogenrezeptor alpha bindet und eine Veränderung der Metabolitenzusammensetzung bewirkt.

Probenvorbereitung für die Metabolomik: Eine Methode zur Vorbereitung von Zellproben für das Metaboliten-Profiling

Dieses Video beschreibt einen zellbasierten Reporter-Assay zur Bestimmung der östrogenen Aktivität von pflanzlichen Verbindungen. Eine Verbindung mit östrogenähnlicher Aktivität ahmt ihre Bindung an Östrogenrezeptoren nach und treibt die nachgeschaltete Transkription von Reporterenzym-Genen voran. Das Reporterenzym erzeugt in einer Reaktion Biolumineszenz, was auf die östrogene Aktivität der Verbindung hinweist.

Östrogenrezeptor-Reporter-Aktivitätsassay zum Screening der östrogenen Aktivität von Phytoöstrogen

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Wir haben eine neue Ex-vivo-Modell, um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust zu studieren entwickelt. Es wird auf das Gewebe Mikrostrukturen von chirurgischen Brustgewebeproben, die Gewebearchitektur, interzellulären Wechselwirkungen und parakrine Signal bewahren isoliert basiert.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell um die Hormonwirkung in der menschlichen Brust Studieren

Klinisch, Östrogenmangel bei Frauen in der Wechseljahre kann die Inzidenz von Lipidstörungen und Arteriosklerose verschlimmern. Wir etablierten ein In-vivo-Östrogen-Mangelmodell durch bilaterale Ovariektomie über einen doppelten dorsal-lateralen Schnitt bei ApoE-/- Mäusen. Das Mausmodell ist für das Screening exogener Östrogenbehandlungen von kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren anwendbar.

Ein In Vivo Östrogen-Mangel-Maus-Modell zum Screening exogener Östrogen-Behandlungen von Kardiovaskulärer Dysfunktion nach den Wechseljahren

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Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines mikrophysiologischen In-vitro-Systems zur Untersuchung von Brustkrebs unter Verwendung von primärem menschlichem Brustgewebe mit Handelsmaterialien.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine umfassende Strategie zur Bewertung der pharmakologischen Wirkung und des Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen.

Erforschung der pharmakologischen Wirkung und des molekularen Mechanismus von Salidrosid bei der Hemmung der Proliferation und Migration von MCF-7-Zellen

In der Pathogenese von Knochenmetastasen ist die Angiogenese ein entscheidender Prozess und stellt somit ein Ziel für die Bildgebung und Therapie. Hier präsentieren wir ein Rattenmodell der ortsspezifischen Brustkrebs und Knochenmetastasen beschreiben Strategien, um nicht-invasiv Bild...

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