Systembiologie der Stoffwechselregulation von Estrogen Receptor Signaling bei Brustkrebs

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die direkte metabolische Regulation von ER Alpha bei Brustkrebs unter Verwendung genomweiter Transkriptom-, Systrom- und Metabolomdaten zu verstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Nukleorezeptor- und Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Rolle bestimmter Transkriptionsfaktoren bei der Regulierung des Stoffwechsels, um zur Aggressivität der Zellen beizutragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein globales Bild der Nuancen der Gene und der daraus resultierenden Stoffwechselregulation liefert.

Verfahren wird von Yiru Chen, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie MCF7-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert haben, ernten Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter RNA-Isolationsreagenz in jede Vertiefung geben und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie eine Pipette, um das Zelllysat zu sammeln und in 1,5-Milliliter-Röhrchen zu überführen.

Um die RNA zu isolieren, fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform zu einem Milliliter Zelllysat hinzu und wirbeln Sie es 10 Sekunden lang. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 16.000 x g und vier Grad Celsius. Nach dem Zentrifugieren wird die wässrige obere Phase vorsichtig in ein neues Röhrchen überführt.

Geben Sie 500 Mikroliter 100%iges Isopropanol in die wässrige Phase und mischen Sie durch Invertieren. Dann über Nacht bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie die Proben bei 1600 x g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 750 Mikroliter RNase-freies 70%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie ihn kurz ein. Zentrifugieren Sie die Proben bei 6.000 x g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 16.000 x g und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie mit einer Gelladespitze das restliche Ethanol durch Pipettieren. Und stellen Sie die Schläuche auf den Kopf, um sie 10 Minuten lang an der Luft trocknen zu lassen. Fügen Sie dann 20 bis 50 Mikroliter DEPC-Wasser hinzu, um das Pellet aufzulösen, und reinigen und quantifizieren Sie die RNA gemäß dem Textprotokoll.

Sobald MCF7-Zellen gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, fügen Sie den Zellen 250 Mikroliter 16%iges Formaldehyd in fünf Milliliter Medium zu, um das Chromatin zu vernetzen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Verwenden Sie dann fünf Milliliter eiskaltes 1X, um die Zellen zu waschen und die Vernetzungsreaktion zu stoppen. Ernten Sie die Zellen in 250 Mikrolitern Zelllysepuffer pro Platte.

Um das Chromatin auf die erforderliche Größe zu fragmentieren, beschallen Sie die Zellen dann achtmal für jeweils 30 Sekunden mit einem Ampere von 30. Kühlen Sie jede Probe nach jeder 30-sekündigen Beschallung auf Eis ab. Nachdem Sie die Proben 10 Minuten lang bei 16.000 x g und vier Grad Celsius zentrifugiert haben, pipettieren Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet am Boden zu stören.

Tragen Sie ein Aliquot von fünf Mikrolitern des Überstands auf ein 1%iges Agarosegel auf und führen Sie eine Elektrophorese durch, um die DNA-Größe zu bestimmen. Die ideale Fragmentlänge sollte zwischen 200 und 500 Basenpaaren liegen. Um eine Immunpräzipitation des Chromatins durchzuführen, speichern Sie 25 Mikroliter des Zelllysats als Input.

Mischen Sie dann in einem 50-Milliliter-Röhrchen vier Milliliter des Zelllysats mit 20 Millilitern IP-Puffer, ER-Alpha-Antikörper und Protein-A- und Protein-G-kodierten magnetischen Kügelchen. Inkubieren Sie das Gemisch durch Rotation bei vier Grad Celsius über Nacht, um die Bildung von Chromatin-Antikörper-Komplexen zu ermöglichen. Nachdem Sie die Kügelchen gemäß dem Textprotokoll mit Waschpuffern gewaschen haben, fügen Sie den Kügelchen 500 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und eluieren Sie die DNA in vier Röhrchen.

Für die DNA-Eingangsproben eluieren Sie in 125 Mikroliter Elutionspuffer. Legen Sie dann die Röhren in einen Heizblock, decken Sie sie mit Folie ab und legen Sie ein Gewicht darauf, um ein Öffnen zu verhindern. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 65 Grad Celsius.

Um die DNA aus den Pulldown-Proben mit einem ChIP-DNA-Isolationskit zu isolieren, kühlen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ab. In der Zwischenzeit erwärmen Sie den Elutionspuffer auf 65 Grad Celsius. Geben Sie 625 Mikroliter Bindungspuffer in jedes Röhrchen.

Wenn sich ein Fällungsmittel bildet, fügen Sie weitere 250 Mikroliter Bindungspuffer hinzu, bis die Lösung klar ist. Laden Sie die Probe auf die Säule und zentrifugieren Sie sie 30 Sekunden lang bei 16.000 x g. Verwenden Sie dann 250 Mikroliter Waschpuffer, um die Säule zweimal zu waschen.

Mit 15 Mikrolitern Elutionspuffer eluieren Sie die DNA. Kombinieren Sie die DNA aus den vier Röhrchen desselben Pulldowns, um auf 55 Mikroliter DNA zu gelangen. Messen Sie die DNA-Konzentration und führen Sie die QPCR gemäß dem Textprotokoll durch.

Geben Sie unter Verwendung von MCF7-Zellen, die gemäß dem Textprotokoll kultiviert wurden, fünf Milliliter eiskaltes 1X PBS auf die Platte. Kippen Sie dann die Platte mehrmals, bevor Sie das PBS entfernen. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male und entfernen Sie nach der letzten Wäsche so viel PBS wie möglich.

Geben Sie 750 Mikroliter vorgekühltes Aceton auf jede Platte und kratzen Sie die Zellen ab. Kombinieren Sie dann die Zellen aus zwei Platten zu einem zwei Milliliter Röhrchen auf Eis. Um die Zellen für die Normalisierung zu zählen, verwenden Sie für jede Behandlung zwei zusätzliche Platten für die Zellquantifizierung.

Um die Zellen von den Platten zu lösen, fügen Sie dann zwei Milliliter HE-Puffer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Mischen Sie die Zellen gründlich, indem Sie den HE-Puffer einpipettieren. Verwenden Sie dann 20 Mikroliter der Zelllösung in einem Hämozytometer, um die Zellzahl unter einem Mikroskop zu zählen.

Lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bevor Sie die gaschromatographische Massenspektrometrie zur Identifizierung und Quantifizierung der Metaboliten verwenden. Führen Sie eine integrative Analyse gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt die Integrität und Gesamtqualität von RNA-Proben, die für ein RNA-Seq-Experiment aufgereinigt wurden.

Die Analyse zeigt, dass alle Proben scharfe und saubere Banden von 18S und 28S RRNAs aufweisen, was auf die Integrität und Reinheit der Proben hinweist. Eine RNA-Integritätszahl (RIN) von 10 weist auf intakte RNA hin. Sechs steht für teilweise degradierte RNA und eine Drei für eine Probe, die stark abgebaut ist.

In diesen Experimenten erhielten alle RNA-Proben RIN-Werte zwischen 9,6 und 9,9. Die Durchführung der Ultrahochdurchsatz-Sequenzierung führte zu etwa 18 Millionen qualitativ hochwertigen Sequenzier-Reads pro Probe. Hier wird ein repräsentativer Schnell-QC-Bericht gezeigt, der die Gesamtqualität der Rohdaten analysiert.

Bei jedem Lesevorgang betrug die Qualitätsbewertung 32 bis 34 für die ersten fünf Basenpaare und 36 bis 38 für sechs bis 100 Basenpaare. Von den 17.990.863 Lesevorgängen, die aus dieser Stichprobe generiert wurden, hatten die meisten einen Qualitätsfaktor von mehr als 34. Diese Abbildung zeigt einen Überblick über etwa 100 Metaboliten, die durch Peaks dargestellt werden, die Veränderungen in MCF7-Zellen aufgrund der Östradiolbehandlung zeigen.

In dieser Tabelle sind die 10 wichtigsten Metaboliten mit signifikanten Veränderungen durch die E2-Behandlung aufgeführt. Und diese Tabelle listet die Signalwege auf, die während der E2-Behandlung hoch- und herunterreguliert wurden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, auf die Gesundheit der Zellen und die Qualität der zu analysierenden Proben zu achten. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Exomsequenzierung oder GRO-Seq, die auf Sequenzierungsdaten basieren, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Identität zusätzlicher MRNAs, Enhancer-MRNAs oder langer nicht-kodierender RNAs, deren Transkription durch Behandlungen induziert wird, zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Kernrezeptoren, um die Stoffwechselregulation durch Kernrezeptoren in Zellkultursystemen oder bei Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Daten aus mehreren Omics-Ansätzen analysieren und integrieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trizol, Formaldehyd und Methanol äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe und Laborkittel bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getragen werden sollten.