Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen
4. Juni 2015
Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Aggregate der roten Blutkörperchen in der Mikrozirkulation direkt zu quantifizieren, dynamisch unter kontrollierten und konstanten Scherraten. Dies wird erreicht, indem zunächst im Training Suspensionen roter Blutkörperchen und ein Doppel-Y-Mikrokanal mit einer Phosphatpuffer-Kochsalzlösung verwendet werden, wodurch die Blutschicht ständig aufgeheitert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Strömung mit einer Hochgeschwindigkeitskamera zu visualisieren und aufzuzeichnen.
Verwenden Sie als Nächstes Bildverarbeitungstechniken, um die Aufzeichnung zu verarbeiten und eine durchschnittliche Aggregatgröße und die Aggregatgrößenverteilung im Mikrokanal zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, die Blutgeschwindigkeit zu bestimmen, indem die Verdrängung der in den Mikrokanal injizierten fluoreszierenden Partikel zwischen zwei aufeinanderfolgenden Bildern verfolgt wird. Letztendlich wird die Scherrate im Mikrokanal basierend auf der Blutgeschwindigkeit und der Blutschichtdicke berechnet, um die Aggregatgrößen mit der entsprechenden lokalen Scherrate in Beziehung zu setzen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Lichttransmissionsmethode besteht darin, dass die Aggregate der roten Blutkörperchen im Gegensatz zu anderen Techniken dynamisch in der mikroskopischen Anteilsströmung analysiert werden. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Hämoradiologie zu beantworten, wie z. B. das Verständnis der Bedingungen für die Bildung von Aggregaten roter Blutkörperchen und das Auffinden des radiologischen Verhaltens des Blutes in der Mikrozirkulation. Beginnen Sie mit der Herstellung von Mikrokanälen mit einer Breite von 120 Mikrometern, einer Höhe von 60 Mikrometern und einer Länge von sieben Millimetern nach photolithographischen Standardmethoden.
Als nächstes entnehmen Sie Blutzellen von gesunden freiwilligen Spendern und bereiten Sie Erythrozytensuspensionen mit fünf, 10 und 15 % Hämatokritwerten vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben, kombinieren Sie einen Milliliter jeder Erythrozytensuspension mit 60 Mikrolitern einer 1%igen Lösung, die fluoreszierende Tracerpartikel enthält. Schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Lösung zu mischen. Kombinieren Sie außerdem das gleiche Volumen an Tracerpartikeln mit einem Milliliter PBS bei einem pH-Wert von 7,4.
Laden Sie eine 25-Mikroliter-Glasspritze mit der Tracerlösung, die die roten Blutkörperchen enthält, und eine 100-Mikroliter-Glasspritze. Stellen Sie mit der Tracer-Lösung in PBS sicher, dass keine Blasen im System vorhanden sind. Platzieren Sie dann den Mikrokanal auf einem inversen Mikroskoptisch, der mit einer Hochgeschwindigkeitskamera verbunden ist, die 18 Bilder pro Sekunde oder mehr aufzeichnen kann, und einem Mikropartikel-Bildgeschwindigkeitssystem.
Verbinden Sie jede Spritze über einen Schlauch mit einem der Einlassöffnungen des mikrofluidischen Kanals und laden Sie sie dann in den Halter derselben Spritzenpumpe. Programmieren Sie die Spritzenpumpe so, dass sie die 25-Mikroliter-Spritze mit einer Geschwindigkeit von zwei Mikrolitern pro Stunde abgibt. Dadurch wird auch die 100-Mikroliter-Spritze aufgrund ihres Größenunterschieds mit der vierfachen Rate abgegeben.
Ändern Sie die Durchflussrate zwischen den Experimenten, um unterschiedliche Schergeschwindigkeiten zu testen. Verwenden Sie einen Kalibrierungsspott mit dem 20-fach-Objektiv, um die Hochgeschwindigkeitskamera zu kalibrieren. Starten Sie dann die Pumpe, um mit der Abgabe der beiden Lösungen in den Mikrokanal zu beginnen.
Bestimmen Sie eine optimale Kamerabelichtung. Zeit für eine klare Abbildung der Aggregate. Es ist wichtig, zu warten, bis die Strömung einen stationären Zustand erreicht hat, bevor Messungen durchgeführt werden.
Wenn der stationäre Zustand nun erreicht ist, werden innerhalb von drei bis fünf Minuten erreicht. Füllen Sie die Spritze nach, um die Mischung aufzuklären und die roten Blutkörperchen in Schwebe zu halten. Sobald der Steady-State-Fluss erreicht ist, beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Bewegung der roten Blutkörperchen.
Zeichnen Sie den Fluss sieben Sekunden lang auf. Verbessern Sie mit einem Bildbearbeitungsprogramm den Kontrast für jedes Graustufenbild, das mit der Methode des Histogramm-Equalizers aufgenommen wurde. Konvertieren Sie als Nächstes die Graustufenbilder in Binärbilder.
Legen Sie den Schwellenwert sorgfältig fest, indem Sie mehrere Werte testen und den Wert auswählen, für den alle Aggregate ordnungsgemäß erkannt werden. Füllen Sie gegebenenfalls die Löcher aus, die den Lücken innerhalb eines Aggregats entsprechen. Erkennen Sie dann die Zellen, indem Sie benachbarte weiße Pixel im Binärbild bestimmen, sodass benachbarte Zellen als Aggregate berücksichtigt werden.
Beschriften Sie die verschiedenen erkannten Aggregate roter Blutkörperchen und wandeln Sie das Binärbild zur besseren Visualisierung in ein rotes, grün-blaues Bild um. Überlagern Sie abschließend das rote, grün-blaue Bild mit dem Originalbild. Um die Effizienz der Bildverarbeitung zu überprüfen, berechnen Sie die Fläche jedes im Rahmen erkannten Aggregats basierend auf der Anzahl der erkannten Pixel.
Verarbeiten Sie alle Frames auf die gleiche Weise. Als Nächstes ermitteln Sie den Durchschnitt der in jedem Frame erkannten Aggregatgrößen und dann die Ergebnisse aller Frames. Um die durchschnittliche Gesamtgröße für jede Aufzeichnung der Suspensions-Engines für rote Blutkörperchen zu erhalten, konvertieren Sie die Ergebnisse mithilfe des Spottbildes in quadratische Mikrometer.
Berechnen Sie dann die Fläche eines roten Blutkörperchens, um einen Vertreter zu bestimmen. Geschätzte Anzahl roter Blutkörperchen in jedem erkannten Aggregat nach Erfassung der Daten. Wechseln Sie mit der Hochgeschwindigkeitskamera zur Doppelpulskamera, die für das Velocimetriesystem für Mikropartikel verwendet wird.
Verwenden Sie eine bildgebende Software wie die hier gezeigte für die Bildaufnahme der Strömung und die Bildverarbeitung für die Geschwindigkeitsfeldbestimmung. Achten Sie darauf, eine Schutzbrille aufzusetzen und schalten Sie dann das Lasersystem und die Kamera ein. Legen Sie ein Mikrometer unter das Mikroskop und verwenden Sie das resultierende Bild, um das System zu kalibrieren.
Starten Sie dann die Fluidströmung und visualisieren Sie die Partikel in beiden Fluiden. Finden Sie die mittlere Ebene des Mikrokanals, indem Sie sich auf die schnellsten und hellsten Partikel in der Strömung konzentrieren. Stellen Sie als Nächstes das Zeitintervall zwischen den Bildern auf etwa zwei Millisekunden ein, sodass sich die schnellsten Partikel zwischen beiden Bildern um fünf bis 10 Pixel bewegen, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Strömung. O.Stellen Sie die Software so ein, dass sie 100 Bildpaare für alle verschiedenen Suspensionen der roten Blutkörperchen und für unterschiedliche Scherraten erfasst.
Nach der Bildvorverarbeitung. Wählen Sie die Größe und Form des Korrelationsfensters sowie den Prozentsatz der überlappenden Bilder aus. Drücken Sie die Ergebnisse als durchschnittliches Geschwindigkeitsfeld aus, das aus den 100 Bildpaaren und dem mittleren quadratischen Geschwindigkeitsfehler berechnet wird.
Schalten Sie die Laserkamera und den Computer aus. Sobald alle Messungen und die Bildverarbeitung durchgeführt wurden, berechnen Sie die Scherrate, indem Sie zunächst die Blutdicke im Mikrokanal auf der Grundlage der Hochgeschwindigkeitskameraaufzeichnung erkennen und schätzen. Mittelnieren Sie zu diesem Zweck alle Frames in der jeweiligen Aufnahme, um ein Hintergrundbild des Videos zu erhalten.
Zum Schluss entlasten Sie die Blutschicht, indem Sie das Durchschnittsbild aller Bilder visuell untersuchen und den Rand der Blutschicht manuell erkennen. Ermitteln Sie dann manuell aus dem extrahierten Geschwindigkeitsprofil den Geschwindigkeitswert für die entsprechende Blutschichtdicke und berechnen Sie die Schergeschwindigkeit, indem Sie den Geschwindigkeitswert durch die Blutschicht dividieren. Die hier gezeigte Dicke ist die Nettobewegung von vier Aggregaten roter Blutkörperchen, die in drei aufeinanderfolgenden Bildern nachgewiesen wurden.
Die großen Aggregate von mehr als 30 Zellen sind rot dargestellt. Die mittleren Aggregate zwischen neun und 30 Zellen sind grün dargestellt, kleine Aggregate von weniger als neun Zellen sind blau dargestellt. Die Geschwindigkeit eines Aggregats variiert je nach seiner Position im gezeigten Mikrokanal.
Hier sind die Geschwindigkeitsprofile der roten Blutkörperchen, die bei 5 % Hämatokrit, 10 % Hämatokrit und 15 % Hämatokrit bei einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Stunde suspendiert sind. Sie können sehen, dass die Geschwindigkeit an beiden Kanten erwartungsgemäß in Richtung Null geht, und der Wendepunkt zwischen den beiden Strömungsströmen variiert leicht zwischen den Hämatokritwerten, da die Gesamtscherrate die Größe der Aggregate bei jedem Absinken des Hämatokritspiegels erhöht. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die schiere Kraft im Mikrokanal die Aggregationskraft übersteigt und dazu führt, dass die roten Blutkörperchen disaggregieren.
Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, eine gute Bildqualität des Flusses im Mikrokanal zu gewährleisten und einen Kontrast zwischen den fließenden roten Blutkörperchen und dem Bildhintergrund zu gewährleisten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Aggregate roter Blutkörperchen qualitativ und quantitativ unter kontrollierten Flussbedingungen analysiert.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung von Erythrozytenaggregaten (RBC) unter kontrollierten Scherraten mithilfe von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel der Studie ist es, die Größe von Erythrozytenaggregaten mit den Scherraten in einer mikrofluidischen Umgebung zu korrelieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrofluidik
- Hamatologie
- Bildverarbeitung
Hintergrund
- Erythrozytenaggregate spielen eine entscheidende Rolle in der Mikrozirkulation.
- Das Verständnis von Schergeschwindigkeiten ist entscheidend für die Untersuchung der Blutflussdynamik.
- Bildverarbeitungstechniken können die Analyse von Erythrozytenaggregaten verbessern.
- Diese Studie verwendet eine Mikrokanalanordnung für kontrollierte Experimente.
Zweck der Studie
- Quantifizierung von Erythrozytenaggregaten in einer mikrofluidischen Umgebung.
- Beziehung zwischen Aggregatgrößen und lokalen Schergeschwindigkeiten herstellen.
- Verbesserung des Verständnisses des Blutflussverhaltens in der Mikrozirkulation.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Erythrozytensuspensionen in einer Phosphatpuffer-Salzlösung.
- Visualisierung der Strömung mittels einer Hochgeschwindigkeitskamera.
- Bildverarbeitung zur Bestimmung der durchschnittlichen Aggregatgröße und Verteilung.
- Berechnung der Schergeschwindigkeit basierend auf der Blutgeschwindigkeit und Schichtdicke.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Quantifizierung der Größen von Erythrozytenaggregaten.
- Herstellung einer Beziehung zwischen Aggregatgrößen und Schergeschwindigkeiten.
- Nachweis des effektiven Einsatzes von Bildverarbeitungstechniken.
- Erkenntnisse über die Dynamik des Erythrozytenverhaltens in der Mikrozirkulation.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung von Erythrozytenaggregaten.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis der Blutströmung in mikrofluidischen Systemen.
- Zukünftige Anwendungen könnten Untersuchungen zu Bluterkrankungen und Therapien umfassen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Aggregationsdynamik von Erythrozyten unter kontrollierten Scherraten liefert entscheidende Erkenntnisse zur Blutrheologie, die für die Mikrozirkulation und die Gefäßgesundheit relevant sind. Dieser mikrofluidische Ansatz ermöglicht die quantitative Beurteilung von Aggregatbildung und -auflösung und unterstützt damit mechanistische Untersuchungen in der Hämatologie und Hämorheologie. Die Methode trägt zur Risikominderung bei der Zielvalidierung bei, indem sie biophysikalische Parameter mit funktionellen Ergebnissen des Blutflussverhaltens verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Bezug auf Signalwege der Erythrozytenaggregation und Modulatoren der hämorheologischen Funktion.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Visualisierung und Quantifizierung der Dynamik von Aggregaten unter physiologisch relevante Scherbedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem reproduzierbare Aggregategrößenmetriken unter kontrollierten Strömungsbedingungen etabliert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit von Assays durch die Wiederverwendung mikrofluidischer Plattformen und quantitative, bildbasierte Auswertungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Kontinuität, indem das scherbeanspruchungsabhängige Verhalten von Erythrozyten in der Mikrozirkulation modelliert wird.
- Operationaler Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem die Aggregatstabilität mit hämodynamischen Bedingungen korreliert wird, die für die Gefäßfunktion relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung, indem sie scherverabhängige phänotypische Messgrößen bereitstellt, die zum mechanistischen Verständnis von Modulatoren des Blutflusses beitragen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Wegen, indem die dynamische Beobachtung der Aggregatbildung und -dissoziation unter kontrollierten Scherraten ermöglicht wird.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte mikrofluidische Umgebungen und quantitative Ausgaben zur Größenverteilung von Aggregaten.
- Analytik: Bietet messbare Ergebnisse, einschließlich durchschnittlicher Aggregatgröße, Größenverteilung und berechneter lokaler Scherraten, abgeleitet aus Geschwindigkeitsfeldern und Schichtdicke.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem das Verhalten von roten Blutkörperchen in mikrovaskulären Umgebungen modelliert wird, die für Krankheitszustände relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von Substanzen oder Bedingungen, die hämorheologische Eigenschaften über mehrere Hämatokritwerte und Scherbedingungen hinweg beeinflussen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten bei den Wechselwirkungen zwischen roten Blutkörperchen und Plasma unter Flussbedingungen verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit und Standardisierung sicher durch kontrollierte Schergeschwindigkeiten, kalibrierte Bildaufnahme und automatisierte Bildverarbeitungsabläufe.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitige Erkennung hämorheologischer Risiken ermöglicht wird, die die Arzneimittelsicherheit oder -wirksamkeit beeinträchtigen könnten.
- Portfolio-Beitrag: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die die Neigung zur Aggregation auf eine scherabhängige Weise modulieren.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit mikrofluidischen Vorrichtungen, der Hochgeschwindigkeitsaufnahme und Bildverarbeitungstechniken zur binären Schwellwertbestimmung und Partikelkennzeichnung.
- Hängt von mikrofluidischen Fertigungsmöglichkeiten, Hochgeschwindigkeitskameras mit einer Leistungsfähigkeit von mindestens 18 Bildern pro Sekunde (fps) und μPIV-Systemen zur Bestimmung des Geschwindigkeitsfeldes ab.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Herstellung des Hämatokrits, der Konzentration der Tracerpartikel und den Durchflussraten, um den Vergleich zwischen Experimenten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf Proben von erythrozyten mit Erkrankungen oder auf unterschiedliche Plasma-Bedingungen ausgeweitet wird, die die Aggregationskinetik beeinflussen können.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit blasenfreier Systeme, die Validierung eines stationären Flusses sowie die manuelle Überprüfung der Dicke der Blutschicht zur Berechnung der Schergeschwindigkeit.
